高效液相色譜法測(cè)定莠去津

1、成都高等紡織?？茖W(xué)校2016屆論文（設(shè)計(jì)）畢業(yè)論文題 目： 高效液相色譜法測(cè)定莠去津 所屬系、部 ： 年級(jí)、 專業(yè)： 姓 名： 學(xué) 號(hào)： 指 導(dǎo) 教 師： 完 成 時(shí) 間： 目錄摘要1謝辭31前言41.1研究背景41.2莠去津殘留分析的樣品前處理技術(shù)51.2.1液液萃取(LLE)51.2.2 固相萃取（SPE）51.2.3 其他萃取方法51.3莠去津殘留分析的檢測(cè)技術(shù)61.3.1 氣相色譜法（GC）61.3.2高效液相色譜法（HPLC）71.3.3液相色譜-質(zhì)譜法（LC/MS）71.3.4其他方法81.4 本文研究?jī)?nèi)容82高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定水中莠去津92.1實(shí)驗(yàn)部分92.1.1主要

2、儀器92.1.2主要試劑92.1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制92.1.4高效液相色譜（HPLC）測(cè)定條件102.1.5樣品預(yù)處理103實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析113.1高效液相色譜的基本原理113.1.1原理113.1.2高效液相色譜法的特點(diǎn)113.2HPLC方法的建立123.2.1 液相色譜條件的優(yōu)化123.3方法的準(zhǔn)確度173.4方法的精密度183.5標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限183.6固相萃取條件的優(yōu)化193.6.1固相萃取洗脫劑的優(yōu)化193.6.2固相萃取洗脫劑用量的優(yōu)化203.6.3固相萃取水樣的流速優(yōu)化213.7樣品的分析223.8加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)23結(jié)論26討論和展望27參考文獻(xiàn)28高效液相色譜法測(cè)定莠去津?qū)W生：

3、 指導(dǎo)教師： 摘要本文首先概述了農(nóng)藥殘留的現(xiàn)狀，重點(diǎn)是除草劑在水中的殘留，總結(jié)了在農(nóng)藥殘留分析中樣品前處理技術(shù)和有關(guān)分析檢測(cè)技術(shù)的特點(diǎn)和應(yīng)用。重點(diǎn)介紹了固相萃取技術(shù)的基本原理、操作步驟及其在環(huán)境水樣分析中的應(yīng)用，本文主要針對(duì)水中莠去津殘留的分析研究，建立了液液萃取和固相萃取兩種方法對(duì)比同時(shí)測(cè)定水中莠去津。首先對(duì)高效液相色譜(HPLC)分離條件進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)對(duì)固相萃取的洗脫溶劑，洗脫速率進(jìn)行優(yōu)化。 通過大量實(shí)驗(yàn)，對(duì)C18固相萃取小柱的萃取條件如洗脫溶劑、上樣速率等進(jìn)行了優(yōu)化，得出對(duì)目標(biāo)組分的最佳的固相萃取實(shí)驗(yàn)條件。最后結(jié)合高效液相色譜（HPLC）方法對(duì)實(shí)際水樣樣進(jìn)行了分析。關(guān)鍵詞：莠去津 固相萃

4、取 高效液相色譜High performance liquid chromatography determination of atrazine in waterStudent： Tutor： AbstractThis article mainly aims at the analysis and research of atrazine in water residue， liquid-liquid extraction and solid-phase extraction was established two methods contrast atrazine determination

5、 in water at the same time . First of all， high performance liquid chromatography (HPLC) separation conditions were optimized， the elution of solid phase extraction solvent， elution rate optimization.By a large number of experiments， the extraction conditions of C18 solid phase extraction small colu

6、mn， such as on the elution solvent， sample rate， the optimization， it is concluded that the best components of the target of solid-phase extraction experimental conditions. Finally combined with high performance liquid chromatography (HPLC) method for the actual water everything is analyzed.Key word

7、s：Atrazine; Solid-phase extraction; High performance liquid chromatography (HPLC).謝辭畢業(yè)設(shè)計(jì)期間， 老師對(duì)我們一直悉心教導(dǎo)，給予了很多的幫助。除了導(dǎo)師外，還要感謝我的工作合作伙伴們，一起做實(shí)驗(yàn)，一起提出問題解決問題，對(duì)所有幫助著我們的以及學(xué)校說：謝謝！大學(xué)馬上就要畢業(yè)了，心里無比的不舍，但我應(yīng)該感到高興，正是由于母校對(duì)我這四年的辛苦栽培讓我學(xué)到了太多知識(shí)，我必須踏上社會(huì)把自己所學(xué)的知識(shí)得到發(fā)揮，回報(bào)父母，回報(bào)母校，回報(bào)社會(huì)。1前言1.1研究背景莠去津,又叫名阿特拉津，是一種稍溶于有機(jī)溶劑，相對(duì)分子量215.69

8、的白色晶體，是瑞士汽巴-嘉基公司開發(fā)生產(chǎn)的一種均三氮苯類除草劑(Triazine herbicides)1，其化學(xué)名稱為2-氯-4-乙胺基-6-異丙胺基-l，3 ，5-三嗪，一些干旱的地方經(jīng)常用這種除草劑。從 60年代就有了莠去津的出現(xiàn)，近年來莠去津被廣泛應(yīng)用在玉米產(chǎn)區(qū)，使用量也由 80 年代的100t(有效成分 )增加到 90 年代的 690t2。莠去津具有應(yīng)用范圍廣，易生產(chǎn)，除草效果好，同時(shí)價(jià)格便宜等優(yōu)勢(shì)。但是莠去津也有突出的劣勢(shì)，具有較長(zhǎng)的殘留期(一年到幾年) 、較高的水溶性 (30mgL ，20)及應(yīng)用量的增加和施用范圍的擴(kuò)大導(dǎo)致其對(duì)環(huán)境的影響日益突出3。莠去津有一定的移動(dòng)性，所以很容

9、易滲透進(jìn)土地從而污染地下水。Huang 等人利用同位素稀釋氣質(zhì)法發(fā)現(xiàn)莠去津可以通過土壤剖面進(jìn)入到地下水中4。傳聞，美國研究人員發(fā)現(xiàn)過"阿特拉津"具有能使動(dòng)物變性的功能。后來就有相關(guān)的研究人員以蛙作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，把那些蛙放入濃度為十億分之二點(diǎn)五的水中生活，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的蛙已雌性化，甚至少部分的蛙已經(jīng)變?yōu)榇菩?。將變性后的雌蛙與雄性蛙交配，出現(xiàn)產(chǎn)卵現(xiàn)象。說明“阿特拉津”確實(shí)能夠雄性蛙變性。如此，不禁會(huì)令人聯(lián)想到：除草劑“阿特拉津”是否對(duì)人性也有相同的效應(yīng)呢？在該問題上，也曾對(duì)人類的血清作了相關(guān)研究，相關(guān)資料顯示，“阿拉特津”和天然性激素（即睪酮、雌二醇）一樣都能夠與體內(nèi)的血清相結(jié)合，

10、因此二者之間具有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，從而使生物體內(nèi)的性激素水平產(chǎn)生變化。殘留莠去津的分析主要是采用氣相色譜法，其余方法也有，比如氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、反相高效液相色譜 (HPLC)方法，還有離子對(duì)反相高效液相色譜法也被用來測(cè)定土壤中殘留的莠去津5。但是很多處理方法步驟繁瑣費(fèi)時(shí)，因?yàn)椴贿m用于大量的樣品進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)采用對(duì)比實(shí)驗(yàn)的方法，應(yīng)用液液萃取和固相萃取兩種方法從水和土壤中快速提取、處理和檢測(cè)莠去津殘留，最終采用高效液相色譜儀對(duì)前處理后的樣品進(jìn)行上機(jī)分析。1.2莠去津殘留分析的樣品前處理技術(shù)目前樣品的的分析方法一般來講包括樣品的前處理和樣品的檢測(cè)兩環(huán)節(jié)。然而對(duì)于莠去津來講，分離、提取和凈化是莠去津前

11、處理中最繁瑣而關(guān)鍵的一步。對(duì)于分析的水樣來說，由于稀釋和降解作用導(dǎo)致莠去津的殘留濃度很低，甚至都低于有些方法的檢出限。所以，我們?cè)趯?duì)樣品的前處理時(shí)每一步都要做到細(xì)致，避免樣品的損失。1.2.1液液萃取(LLE)目前農(nóng)藥殘留的傳統(tǒng)處理方法是液液萃取(Liquid-liquid extraetion，LLE)，液液萃取通常采用二氯甲烷，乙酸乙醋等這類萃取劑。但這種方法的弊端是需要大量的有機(jī)試劑，并且對(duì)人體、環(huán)境都會(huì)有危害。1.2.2 固相萃?。⊿PE）固相萃取(Solid-phase extractioll，SPE)是近些年研究出來的新的處理方法之一，對(duì)樣品的分離和凈化有很好效果。相比其它方法來說

12、，它的回收率較高、分離度也高，同時(shí)縮短樣品預(yù)處理過程，操作簡(jiǎn)單，省時(shí)6-7。1.2.3 其他萃取方法隨著研究的不斷進(jìn)步，固相微萃取(Solid-Phase Micro extraction，SPME)也逐漸浮出水面。該方法的基本原理是將不同極性的吸附材料涂在極細(xì)的纖維上面，形成探針。把探針插入到被檢測(cè)的樣品中，目標(biāo)組分在一定時(shí)間內(nèi)附著在上面。氣相色譜儀檢測(cè)時(shí)，由于色譜柱的高溫作用使得北側(cè)組分被解吸，從而檢測(cè)。該方法簡(jiǎn)便、快速。但是纖維管很細(xì)容易破碎而且種類較少，所以在很大程度上就限制了該技術(shù)的應(yīng)用范圍8-9。超臨界流體萃取(Supereritieal fuild extraetion，SFE)

13、也是一種曾用于萃取的技術(shù)。這種萃取技術(shù)是以超臨界流體作為萃取溶劑。超臨界流體具有液體密度高和氣體粘低度的特點(diǎn)，這些特點(diǎn)是在臨界溫度和壓力以上存在的。處于臨界狀態(tài)下的流體會(huì)因?yàn)閴毫蜏囟鹊母淖兌l(fā)生變化，這樣一來可以改變一下相關(guān)的條件使得溶解在流體中的組分被析出來，從而實(shí)現(xiàn)特定溶質(zhì)的萃取。其中常見的超臨界流體是很環(huán)保的二氧化碳。由于超臨界的條件要求比較高，使得目前廣泛應(yīng)用受到限制10。微波輔助萃取(Mierowave assisted extraetion，MAE)是指利用微波能量使浸沒在溶劑中的固體中的有機(jī)萃取目標(biāo)物被萃取的過程。這種方法一般只適用于固體物質(zhì)的萃取，對(duì)于水中莠去津等農(nóng)藥殘留的萃

14、取不適用。1.3莠去津殘留分析的檢測(cè)技術(shù)農(nóng)藥殘留分析主要的分析技術(shù)有氣相色譜和液相色譜。最先應(yīng)用的是氣相色譜，所使用的檢測(cè)器都是高靈敏度的，從而也推動(dòng)了農(nóng)藥殘留分析技術(shù)的發(fā)展。隨后，高效液相色譜也開始發(fā)展起來啦。兩者相比而言，高效液相色譜更適用于受熱易分解和極性大的組分檢測(cè)。色譜法是一種分離和分析方法，具有高效、高速等特點(diǎn)。利用不同物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中具有不同的分配系數(shù)，液體流過色譜柱時(shí)，液體中的不同組分沿著固定相移動(dòng)，由于不同的分配比，在柱內(nèi)的停滯時(shí)間不同，導(dǎo)致流出順序也不同，從而就可以達(dá)到分離效果，這種分離技術(shù)稱為色譜法。1.3.1氣相色譜法（GC）氣相色譜(GC)法，流動(dòng)相為液體。氣相

15、色譜法，操作簡(jiǎn)便快捷、速度快、選擇性高。氣相色譜法檢測(cè)對(duì)象主要針對(duì)的就是那些容易氣化而且氣化后不發(fā)生分解反應(yīng)的化合物。氣相色譜法主要采用填充柱和毛細(xì)管柱這兩種色譜柱。在農(nóng)藥殘留分析檢測(cè)中，最開始采用的是填充柱，后來過渡到了毛細(xì)管柱。進(jìn)樣時(shí)，當(dāng)被檢測(cè)的物質(zhì)在載氣的帶動(dòng)下通過色譜柱，目標(biāo)組分被吸附，由于不同組分有不同的通過速率，流出時(shí)間也有先后順序，因此達(dá)到分離效果，從而達(dá)到氣相分析的目的。利用氣相色譜法對(duì)除草劑的檢測(cè)不管是單一組分還是多組分都有普遍的應(yīng)用。例如，張素娣利用帶氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)的氣相色譜儀，采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)敵草隆進(jìn)行分離和測(cè)定11，胡先文等人對(duì)水樣中的甲磺隆進(jìn)行測(cè)定，采用液一

16、液分配法提取后進(jìn)行氣相色譜分析，進(jìn)入電子捕獲檢測(cè)器(ECD)進(jìn)行檢測(cè)12等.但是，在同柱同溫下條件下分離和檢測(cè)混合樣品的研究并不多。秦冬梅等曾用氣相色譜法對(duì)河水中莠去津和乙草胺進(jìn)行同柱分離，然后將樣品分別通過氮磷檢測(cè)器(NPD)和電子捕獲檢測(cè)器(ECD)進(jìn)行檢測(cè)13。C. Aguilar等用氣相色譜分離環(huán)境水中的莠去津、西瑪津等多種物質(zhì)，然后比較了電子捕獲檢測(cè)器(ECD)和質(zhì)譜(MS)檢測(cè)結(jié)果14。但是，使用氣象色譜法具有一定的局限性。首先樣品進(jìn)入儀器后要被氣化，因此，被測(cè)樣品應(yīng)該滿足一下兩個(gè)條件：一方面是樣品必須在儀器工作的溫度下能夠氣化，另外一方面是樣品在氣化后不能發(fā)生分解。因而對(duì)于不揮發(fā)

17、性和受熱易分解化合物的測(cè)定，必須先進(jìn)行衍生化處理，操作步驟比較繁瑣。1.3.2高效液相色譜法（HPLC） 液相色譜法(Liquid chromatography，LC)是采用液體作為流動(dòng)相的一種色譜法。20世紀(jì)70年代,高效液相色譜開始發(fā)展起來，具有高效、快速、高壓等特點(diǎn)。相比氣相色譜而言，液相色譜不受試劑揮發(fā)性的限制，因此也可以檢測(cè)穩(wěn)定性差、相對(duì)分子質(zhì)量大和沸點(diǎn)高的物質(zhì).高效液相色譜主要由色譜柱、高壓泵和檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器組成，具有高壓、高速、高效、高靈敏度、流出組分容易收集幾個(gè)突出的特點(diǎn)15，這些特點(diǎn)在分析結(jié)果上都起著很大的作用。目前利用高效液相色譜儀對(duì)農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)器是紫外檢測(cè)器

18、（UV）。紫外檢測(cè)器具有靈敏度較高、噪音低、流量和溫度的變化影響小等特點(diǎn)，是梯度淋洗的一種比較理想的檢測(cè)器16，但是溶質(zhì)能對(duì)紫外光進(jìn)行吸收是必要條件，否則無法進(jìn)行檢測(cè)。還有另一種檢測(cè)器熒光檢測(cè)器，是一種靈敏度高、選擇性強(qiáng)的檢測(cè)器，比紫外檢測(cè)器的靈敏度要高l2個(gè)數(shù)量級(jí)。隨著社會(huì)的不斷發(fā)展，也有許多新型的檢測(cè)器開始應(yīng)用，如光化學(xué)誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器(PIF)，二極管矩陣檢測(cè)器(DAD)和質(zhì)譜(MS)等，其中DAD的應(yīng)用越來越廣泛。1.3.3液相色譜-質(zhì)譜法（LC/MS）質(zhì)譜(Masss Pectrometry，MS)法是目前應(yīng)用的比較廣泛的檢測(cè)技術(shù)之一，其基本原理是利用帶電粒子在磁場(chǎng)或電場(chǎng)中通過受力的作

19、用，由于物質(zhì)的電離產(chǎn)生不同的質(zhì)荷比(m/z)，從而實(shí)現(xiàn)分離分析，該方法的專屬性較強(qiáng)、靈敏度相對(duì)比較高、檢測(cè)速度比較快等優(yōu)點(diǎn)。并且質(zhì)譜法很早就開始應(yīng)用，液相色譜一質(zhì)譜(LC/MS)的結(jié)合，提高了檢測(cè)范圍和精確度，成為一種重要的現(xiàn)代分離分析檢測(cè)技術(shù)，在學(xué)術(shù)研究和樣品檢測(cè)等許多領(lǐng)域應(yīng)用極廣。自70年代以來，經(jīng)過約30年的發(fā)展己趨向成熟15。1.3.4其他方法20世紀(jì)50年代，農(nóng)藥殘留分析檢測(cè)技術(shù)開始出現(xiàn)，其中就包含有莠去津。那時(shí)的農(nóng)藥殘留分析技術(shù)方法以簡(jiǎn)便分光光度法為主。分光光度法這種檢測(cè)技術(shù)對(duì)于檢測(cè)農(nóng)藥殘留來說，靈敏度比較低。所以這種技術(shù)如今已不作為常用的分析方法了。近年發(fā)展起來的一種分離、分析技

20、術(shù)毛細(xì)管電泳(CE)，是藥品行業(yè)分離分析的重要工具之一17。其工作原理是不同帶電粒子在毛細(xì)管柱內(nèi)，通過高壓作用在緩沖液中定向的移動(dòng)進(jìn)行分離。這種技術(shù)的主要局限是系統(tǒng)的負(fù)荷能力低，檢測(cè)光程短，檢測(cè)靈敏度較低，在痕量分析的應(yīng)用上就達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)。另外，還有免疫分析(IA)這種分離技術(shù)存在，原理是基于抗原抗體特異性識(shí)別和結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)實(shí)現(xiàn)的。免疫分析具有很強(qiáng)的特異性、且分析成本較低，已成為現(xiàn)代科學(xué)研究和檢驗(yàn)檢測(cè)的重要研究手段。由于免疫分析方法獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，使得研究人員對(duì)莠去津的研究和檢測(cè)有了很大的進(jìn)步，同時(shí)也引起了農(nóng)藥研究領(lǐng)域的關(guān)注18。1.4 本文研究?jī)?nèi)容隨著現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)的發(fā)展和從事農(nóng)業(yè)生產(chǎn)人口的減少，同

21、時(shí)為保證糧食的高產(chǎn)，除草劑使用范圍越來越廣。除草劑的廣泛使用在保證糧食增產(chǎn)的同時(shí)對(duì)環(huán)境及人類健康也帶來了危害。本實(shí)驗(yàn)選除草劑中典型成分之一莠去津作為研究對(duì)象，建立水中除草劑殘留的檢測(cè)方法。2高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定水中莠去津2.1實(shí)驗(yàn)部分2.1.1主要儀器高效液相色譜儀（LC-20AT，日本島津）包括：DGU-20A5脫氣機(jī)，LC-20AT液相泵，CBM-20A控制器，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-10AS vp柱溫箱，SPD-M20A二極管陳列檢測(cè)器。Sepax HP-C18色譜柱（5um，4.6×250mm），24位負(fù)壓SPE固相萃取裝置（天津博納艾杰爾科技有限公司），

22、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，自動(dòng)液液萃取裝置（Q-10001CQ-2000，吉林歐伊爾環(huán)?？萍及l(fā)展有限公司），渦旋振蕩器（XW-80A，上海青浦瀘西儀器廠），分液漏斗（蜀牛250mL），Milli-Q Integral超純水儀（密理博公司），移液槍，振蕩器（XW-80A 上海青浦瀘儀器廠），超聲波清洗器（KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司）。2.1.2主要試劑 二氯甲烷（500mL色譜純，成都市科龍化工試劑廠），甲醇（500mLHPLC級(jí)，成都市科龍化工試劑廠），甲醇（4LHPLC級(jí)，成都市科隆化學(xué)品有限公司），氯化鈉（分析純，成都市科龍化工試劑廠），無水硫酸鈉（分析純，成都市科龍化工試劑廠）。莠去津標(biāo)

23、準(zhǔn)溶液（GBW（E）081100b，99mg/L，地質(zhì)科學(xué)院物化探研究所）。2.1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：用200uL移液槍準(zhǔn)確移取101uL濃度為99mg/L的莠去津標(biāo)準(zhǔn)母液于10mL容量瓶中，用甲醇定容，得到濃度為1mg/L的莠去津標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：要配制的標(biāo)線濃度梯度依次為30ug/L、50ug/L、100ug/L、200ug/L、500ug/L、1000ug/L，準(zhǔn)備好6個(gè)1.5mL的離心管，依次按標(biāo)線濃度梯度由低到高編號(hào)1、2、3、4、5、6，然后分別向6個(gè)離心管中依次先加入溶劑甲醇970uL、950uL、900uL、800uL、500uL、0uL，然后分別依次加入莠

24、去津標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液30uL、50uL、100uL、200uL、500uL、1000uL然后用渦旋器混勻，最后轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣瓶中。2.1.4高效液相色譜（HPLC）測(cè)定條件流動(dòng)相B：甲醇 流動(dòng)相D：超純水洗脫方式：等度洗脫（70%甲醇+30%超純水）流速：0.8mL/min 柱溫：25進(jìn)樣量：10uL 檢測(cè)波長(zhǎng)：225nm2.1.5樣品預(yù)處理本次設(shè)計(jì)主要以固相萃取為主要實(shí)驗(yàn)方法，液液萃取方法作為對(duì)比方法。方法一，固相萃取方法：取污染的稻田水樣200mL，經(jīng)孔徑為0.45um，直徑50mm的水系濾膜后再用SPE固相萃取裝置凈化。SPE具體步驟為：用5mL丙酮以6mL/min的流速清洗填料為C18的富集小柱

25、，再依次用10mL甲醇和10mL超純水以同樣的流速通過萃取小柱，在柱子被抽空前加100mL剛剛過膜的水樣，使樣品連續(xù)的通過萃取柱，控制其流速為10mL/min待水樣全部抽完后，用10mL超純水清洗樣品瓶，保持真空抽濾泵壓力-0.03MPa抽吸10min，使待測(cè)組分富集在C18柱上，最后用2mL色譜級(jí)甲醇洗脫被分析的莠去津，取洗脫液10uL供高效液相色譜儀上機(jī)分析。方法二，液液萃取方法：先將氯化鈉在400灼燒4小時(shí)，冷卻后密閉保存在玻璃瓶中。無水硫酸鈉在400灼燒4小時(shí)，冷卻后密閉保存在玻璃瓶中。取污染的稻田水樣200mL，經(jīng)孔徑為0.45um，直徑50mm的水系濾膜，用容量瓶量取100ml樣品

26、于250ml分液漏斗中，加入5g氯化鈉搖勻。用20ml二氯甲烷分兩次萃取，每次10 ml，于振蕩器上充分振搖5min。注意手動(dòng)振搖放氣。靜置分層后，將有機(jī)相通過裝有無水硫酸鈉的漏斗，接至濃縮瓶中，注意無水硫酸鈉充分淋洗。合并兩次二氯甲烷萃取液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至近干，用甲醇定容至1.00ml，供分析。試樣保存在4冰箱中。注：樣品在濃縮過程中，萃取液濃縮至近干時(shí)，應(yīng)立即定容，否則阿特拉津會(huì)有較大損失。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析3.1高效液相色譜的基本原理3.1.1原理高效液相色譜中液-液分配原理：液-液分配色譜法 (Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學(xué)鍵合相色

27、譜(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流動(dòng)相和固定相都是液體。流動(dòng)相與固定相之間應(yīng)互不相溶(極性不同，避免固定液流失)，有一個(gè)明顯的分界面。當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱，溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配。HLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決于K，K大的組分保留值大;但也有不同之處，GPC中，流動(dòng)相對(duì)K影響不大，HLPC流動(dòng)相對(duì)K影響較大。 a. 正相液 - 液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography)： 流動(dòng)相的極性小于固定液的極性。 b. 反相液 - 液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromato

28、graphy)： 流動(dòng)相的極性大于固定液的極性。 c. 液 - 液分配色譜法的缺點(diǎn)：盡管流動(dòng)相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動(dòng)相中仍有微量溶解;流動(dòng)相通過色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊力，會(huì)造成固定液流失。上世紀(jì)70年代末發(fā)展的化學(xué)鍵合固定相(見后)，可克服上述缺點(diǎn)?，F(xiàn)在應(yīng)用很廣泛(70-80%)。 液-固色譜法 流動(dòng)相為液體，固定相為吸附劑(如硅膠、氧化鋁等)。這是根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來進(jìn)行分離的。下圖3是高效液相色譜儀的基本原理圖。圖3高效液相色譜儀的基本原理圖3.1.2高效液相色譜法的特點(diǎn)高效液相色譜法有“三高一廣一快”的特點(diǎn)：高壓：流動(dòng)相為液體，液體流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為了能

29、迅速通過色譜柱，必須對(duì)載液加高壓。高效：分離效能比氣相色譜還高。可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果，一些新型的固定相，如化學(xué)鍵合固定相，使分離效率大大提高。高靈敏度：采用高靈敏度的紫外檢測(cè)器，該檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，進(jìn)樣量在uL數(shù)量級(jí)。應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析。分析速度快、載液流速快：較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個(gè)樣品在1530分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時(shí)。除了上述的特點(diǎn)外，高效液相色譜還具有色譜柱可以反復(fù)使用的特點(diǎn)。但其也存在缺點(diǎn)，那就是在色譜柱等連接處有連接管

30、可能產(chǎn)生死體積。3.2HPLC方法的建立3.2.1 液相色譜條件的優(yōu)化3.2.1.1 流動(dòng)相的選擇高效液相色譜中一般使用的色譜柱都是非極性的C18色譜柱，一般水中莠去津殘留的分離等使用的流動(dòng)相一般為甲醇/水或乙睛/水體系。我們對(duì)常用的流動(dòng)相甲醇/水對(duì)比乙睛/水進(jìn)行了解，圖3-4和圖3-5是進(jìn)樣量10uL時(shí)，流動(dòng)相分別為甲醇/水(體積比為70：30)和乙睛/水(體積比為70：30)的色譜圖。同時(shí)圖3-1為莠去津的色譜圖，圖3-2為莠去津的光譜視圖（提取圖），圖3-3為莠去津的的純度視圖。圖3-1莠去津的液相色譜圖Figure 3-1 atrazine liquid chromatogram圖3-

31、2莠去津的光譜視圖（提取圖）View 3-2 spectra of atrazine (extracted)圖3-3莠去津的的純度視圖Figure 3-3 to view the purity of Tianjin atrazine圖3-4以甲醇/水為流動(dòng)相的色譜Figure 3-4 in a methanol/water as mobile phase chromatogram圖3-5以乙腈/水為流動(dòng)相的色譜圖Figure 3-5 with acetonitrile/water as mobile phase chromatograph chart實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：從分離度角度考慮，則乙睛/水體

32、系和溶劑峰分離度不好，會(huì)產(chǎn)生干擾，而甲醇/水體系莠去津的峰和其他溶劑峰都分離的比較好，因此采用甲醇睛/水作為流動(dòng)相。3.2.1.2 溶劑流速的影響溶劑的流速會(huì)影響組分的出峰時(shí)間，選擇三種不同的流速進(jìn)行分析。得到溶劑甲醇/水（70/30）如圖3-6，圖3-7和圖3-8的不同溶劑流速色譜圖。圖3-6流速為1.0mL/min的色譜圖 Figure 3-6 chromatograms of flow rate is 1.0 mL/min圖3-7流速為0.8mL/min的色譜圖Figure 3-7 chromatograms of flow rate is 0.8 mL/min圖3-8流速為0.5mL/

33、min的色譜圖Figure 3-8 chromatograms of flow rate is 0.5 mL/min通過對(duì)比色譜圖3-6，圖3-7，圖3-8可以清楚的看到流速對(duì)組分的峰形和分離度基本沒有影響，只是會(huì)影響組分的出峰時(shí)間。但是流速為1.0mL/min時(shí)壓力達(dá)到18.5MPa，壓力偏高對(duì)色譜柱填料有影響從而會(huì)降低柱效，所以不可取。0.8mL/min的流速時(shí)壓力14.5MPa，峰形和分離度都很好。然而流速0.5ml/min時(shí)，壓力為9.2MPa，雖然壓力較低但出峰時(shí)間有點(diǎn)靠后，所以綜合上訴原因我們選擇流速為0.8mL/min。3.2.1.3色譜柱的選擇對(duì)于高效液相色譜柱來講，色譜柱的長(zhǎng)

34、度是影響組分分離度的重要因素，所以我們?cè)趯?duì)莠去津的定性和定量過程中必須對(duì)色譜柱長(zhǎng)度進(jìn)行優(yōu)化，圖3-9和圖3-10是在柱溫30，流速0.8mL/min進(jìn)樣量10uL，流動(dòng)相為甲醇/水(70/30)時(shí)，分別采用SepaxHP-C18色譜柱（5um，4.6×250mm）和Sepax HP-C18色譜柱（5um，4.6×150mm）的色譜圖。圖3-9用250mm長(zhǎng)度色譜柱的色譜圖Figure 3-9 with 250 mm length of chromatographic column chromatogram圖3-10用150mm長(zhǎng)度色譜柱的色譜圖Figure 3-10 wit

35、h 150 mm length of chromatographic column chromatogram通過比較圖3-9和圖3-10發(fā)現(xiàn)，采用長(zhǎng)度250mm的色譜柱與溶劑峰都分離的比較好，而長(zhǎng)度為150mm的色譜柱莠去津的峰和溶劑峰沒有完全分離。所以應(yīng)該選擇SepaxHP-C18色譜柱（5um，4.6×250mm）比較好。分析原因應(yīng)該是在一定的流速范圍之內(nèi)，柱子越長(zhǎng)其理論塔板數(shù)就越多，分離效果就越好，所以250mm長(zhǎng)的柱子分離效果更好。3.3方法的準(zhǔn)確度分別對(duì)100ug/L，300ug/L，800ug/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定6次，計(jì)算莠去津濃度的相對(duì)誤差差(RE%)濃度，結(jié)果見表3

36、-1。表3-1方法的準(zhǔn)確度table 3-1 the accuracy of the method測(cè)量次數(shù)濃度（ug/L）濃度（ug/L）濃度（ug/L）198.79 292.70 804.84 299.01 296.72 804.74 397.68 295.10 806.30 498.44 297.03 803.48 597.69 296.03 807.37 697.95 293.83 806.86 平均值98.26 295.24 805.60 實(shí)際濃度100.00 300.00 800.00 相對(duì)誤差RE（%）1.74 1.59 0.70 3.4方法的精密度分別對(duì)30ug/L，300ug/

37、L，700ug/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定6次，計(jì)算莠去津峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差差(RSD%)，結(jié)果見表3-2。表3-2方法的精密度Table 3-2 the precision of the method測(cè)量次數(shù)峰面積峰面積峰面積13215 34376 81938 23232 34872 81907 33287 34567 81609 43383 34477 82073 53213 34627 81809 63241 34548 82069 平均值3262 34578 81901 標(biāo)準(zhǔn)偏差S65.14167.85174.89相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（%）2.000.490.213.5標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限對(duì)己經(jīng)

38、配制好的濃度為30ug/L，50ug/L.100ug/L，500ug/L，1000ug/L的莠去津標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣10uL，通過二極管陳列檢測(cè)器檢測(cè)進(jìn)行定量分析。以下的X值為莠去津峰面積，Y值為莠去津的濃度（ug/L），得到莠去津的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3-11。莠去津的標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)，線性范圍及檢出限(S/N=3)列于表3-3。結(jié)果表明，莠去津的線形關(guān)系良好。表3-3莠去津的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限Table 3-3 standard curve of atrazine， linear range and detection limit工作曲線相關(guān)系數(shù)（r）檢出限（ug/L)莠去津Y= 8.3

39、27161e-3X+4.6530090.99994613.549Y = aX + ba = 8.327161e-003b = 4.653009R2 =0.9998922R = 0.9999461圖3-11莠去津的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 3-11 standard curve of atrazine3.6固相萃取條件的優(yōu)化3.6.1固相萃取洗脫劑的優(yōu)化我們?cè)趯?duì)莠去津的分離凈化過程中，當(dāng)莠去津被固相萃取柱吸附后，要選用合適的洗脫劑將莠去津洗脫下來，不同的洗脫劑洗脫效果不同，從而會(huì)影響回收率，所以對(duì)洗脫劑的選擇十分重要。洗脫劑的種類有很多，目前實(shí)驗(yàn)室常用的有水、甲醇、異丙醇、乙睛、丙酮、乙酸乙醋、二氯

40、甲烷、四氯化碳、正己烷等。本論文參考了大量相關(guān)文獻(xiàn)后，選擇了甲醇、乙睛、二氯甲烷，正己烷這幾種不同極性的洗脫劑為研究對(duì)象，考查它們對(duì)莠去津的洗脫效果，見表3-4.表3-4不同洗脫溶劑對(duì)回收率(%)的影響Table 3-4 different elution solvent effect on the recovery (%)平行測(cè)量甲醇（ug/L)二氯甲烷乙腈正己烷A98.0757.5148.060B98.1558.3448.170平均值98.1157.9248.110實(shí)際濃度100100100100回收率（%）98.1157.9248.110由回收率結(jié)果可以看出，甲醇的洗脫效果較好，二氯甲烷

41、和乙腈的洗脫效果不理想，正己烷的洗脫效果最差。分析原因可能因?yàn)榧状嫉臉O性與莠去津的極性相似，具有較大的溶解度，因此可獲得較高的回收率.3.6.2固相萃取洗脫劑用量的優(yōu)化萃取小柱上的有效組分是否有效的被洗脫下來，這需要對(duì)洗脫劑的用量進(jìn)行探討和研究，所以我們以不同體積的甲醇洗脫同一樣品，洗脫劑用量從0.5mL-3.0mL，每增加0.5mL甲醇測(cè)定一次回收率，試驗(yàn)結(jié)果如圖3-12所示。圖3-12洗脫劑體積對(duì)回收率的影響Figure 3-12 eluent volume effect on recovery圖3-12的結(jié)果表明，洗脫溶劑甲醇的體積小于2.0mL時(shí)，樣品回收率隨洗脫溶劑體積的增加而提高。

42、當(dāng)洗脫溶劑的體積大于2.0mL時(shí)，隨著洗脫溶劑體積的增加回收率基本保持不變。所以，我們?cè)跇悠返膬艋疵摃r(shí)選擇洗脫溶劑體積為2.0mL。3.6.3固相萃取水樣的流速優(yōu)化樣品水樣的流速也是固相萃取的一個(gè)重要指標(biāo)。流速過慢，則需要較長(zhǎng)的樣品處理時(shí)間；流速過快，則樣品不能充分的被吸附，富集效果變差，造成回收率降低。本文選取了八種不同的流速，分別是負(fù)壓真空泵壓力為-0.2，-0.6，-1.2，-1.6，-2.0，-3.2，-4.0，-5.0MPa，研究了不同負(fù)壓(流速)下莠去津的固相萃取回收率，結(jié)果如圖3-13。圖3-13水樣流速對(duì)回收率的影響Figure 3-13 water velocity inf

43、luence on recovery從圖3-13中可以很清楚的看到：當(dāng)負(fù)壓為-0.2，-0.6，-1.2，-1.6，-2.0MPa時(shí)莠去津的回收率變化不大，而當(dāng)負(fù)壓增加到-3.2MPa時(shí)，隨著負(fù)壓（流速）的增加，固相萃取的回收率出現(xiàn)了比較明顯的下降，表明此時(shí)組分沒有充分被固相柱吸附和保留。綜合考慮，本試驗(yàn)選擇負(fù)壓（流速）-2.0MPa， 此時(shí)固相萃取的回收率較高，而水樣過柱時(shí)間相對(duì)較短。通過以上一系列實(shí)驗(yàn)對(duì)色譜條件以及固相萃取方法條件的優(yōu)化得到最后主要優(yōu)化條件的匯總表如3-5。表3-5色譜主要條件及固相萃取主要條件優(yōu)化匯總表Table 3-5 main conditions of chroma

44、tography and solid phase extraction optimization of the main conditions of the summary table色譜條件的優(yōu)化流動(dòng)相的優(yōu)化甲醇：水=70:30溶劑流速的優(yōu)化0.8 mL/min色譜柱的優(yōu)化SepaxHP-C18（5um，4.6×250mm）固相萃取的優(yōu)化洗脫劑的選擇甲醇（HPLC）洗脫劑用量的優(yōu)化2.0mL樣品流速的優(yōu)化負(fù)壓-2.0MPa3.7樣品的分析取3份農(nóng)作物附近的灌溉水樣按照2.1.5固相萃取的方法進(jìn)行樣品的處理，然后上機(jī)分析測(cè)定。得到如圖3-14，圖3-15，圖3-16莠去津的樣品圖。圖

45、3-14樣品1的莠去津色譜檢測(cè)圖Figure 3-14 samples of atrazine chromatographic detection figure圖3-15 樣品3的莠去津色譜檢測(cè)圖Figure 3-15 samples 2 atrazine chromatographic detection figure圖3-16 樣品3的莠去津色譜檢測(cè)圖Figure 3-16 samples of 3 atrazine chromatographic detection figure根據(jù)樣品1，樣品2，樣品3的色譜圖可以看出都有莠去津的檢出。3個(gè)樣品檢測(cè)濃度分別為52.69ug/L，54.6

46、5ug/L，65.45ug/L，3個(gè)樣品的實(shí)際濃度分別為 1.05ug/L，1.09ug/L，1.31ug/L，參考國家相關(guān)水中農(nóng)藥最大殘留得知三個(gè)樣品的濃度都沒有超出國家限量標(biāo)準(zhǔn)。3.8加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)對(duì)液液萃取和固相萃取兩種預(yù)處理方法都進(jìn)行加標(biāo)處理。對(duì)兩種方法的3個(gè)水樣分別平行取6份，樣品1加標(biāo)濃度是30ug/L，樣品2加標(biāo)濃度是50ug/L，樣品3加標(biāo)濃度是100ug/L。分別安2.1.5的兩種處理方法處理，得到樣品的加標(biāo)回收率見表3-6和表3-7。表3-6液液萃取測(cè)定的加標(biāo)回收率Table 3-6 standard addition recovery rate for the determ

47、ination of liquid-liquid extraction平行號(hào)樣品1樣品2樣品3樣品（ug/L)加標(biāo)樣品（ug/L)樣品（ug/L)加標(biāo)樣品（ug/L)樣品（ug/L)加標(biāo)樣品（ug/L)1020.95058.15083.752020.90058.94083.993020.76059.23083.964021.25058.96084.005021.31059.79084.166021.18059.61084.13平均值021.06059.11084.00加標(biāo)濃度3050100加標(biāo)回收率Pi(%)70.2118.284.0標(biāo)準(zhǔn)偏差0.2190.5830.146RSD（%）1.040

48、.990.17表3-7固相萃取測(cè)定的加標(biāo)回收率Table 3-7 solid-phase extraction measurement standard addition recovery rate平行號(hào)樣品1樣品2樣品3樣品（ug/L)加標(biāo)樣品（ug/L)樣品（ug/L)加標(biāo)樣品（ug/L)樣品（ug/L)加標(biāo)樣品（ug/L)1029.34049.92099.112029.42049.98099.273029.65049.98099.284029.48049.98099.365029.47050.01099.256029.42049.96099.21平均值029.46049.97099.25

49、加標(biāo)濃度3050100加標(biāo)回收率Pi（%）98.299.999.2標(biāo)準(zhǔn)偏差0.1040.30.083RSD（%）0.350.60.08表3-8對(duì)比液液萃取和固相萃取的加標(biāo)回收率Table 3-8contrast liquid-liquid extraction and solid-phase extraction of standard addition recovery rate方法樣品1樣品2樣品3液液萃取的加標(biāo)回收率Pi（%）70.2118.284固相萃取的加標(biāo)回收率Pi（%） 98.299.999.2分析表3-7得知樣品中莠去津的含量的確很少?zèng)]有達(dá)到檢出線，說明樣品中莠去津的殘留基本沒

50、有。同時(shí)對(duì)比表3-6和表3-7可知液液萃取方法的回收率沒有固相萃取方法的回收率好，而且重現(xiàn)性也不如固相萃取方法。液液萃取在實(shí)驗(yàn)過程中步驟繁瑣，而且在萃取和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)過程中損失太大，導(dǎo)致回收率很低。對(duì)比兩種方法可以得知應(yīng)用SPE固相萃取不但可以得到較好的回收率，同時(shí)使用后的C18小柱可以再生回收利用，降低成本，減少污染。結(jié)論莠去津作為農(nóng)藥的主要成分之一，具有很多不可代替的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)對(duì)環(huán)境液有污染，受到研究人員的關(guān)注。本文通過固相萃取和液液萃取兩個(gè)方法對(duì)莠去津提取進(jìn)行對(duì)比，對(duì)莠去津的預(yù)處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)高效液相色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，通過一系列的探討實(shí)驗(yàn)，結(jié)論如下：第一，通過固相萃取的方法對(duì)比水質(zhì)HJ

51、 587-2010標(biāo)準(zhǔn)方法實(shí)驗(yàn)，確定固相萃取方法的突出優(yōu)點(diǎn)和可行性。探討了固相萃取在不同洗脫溶劑，不同洗脫溶劑用量，不同水樣流速以及高效液相色譜儀的一系列優(yōu)化條件。第二，在優(yōu)化條件下繪制莠去津的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為：Y=8.327161e-3+4.653009，相關(guān)系數(shù)為人r=0.9999461，檢出限為3.549ug/L，定量限為11.83ug/L。通過一系列的加標(biāo)回收試驗(yàn)，最后確定了固相萃取方法提取莠去津的加標(biāo)回收率非常高，基本在98%以上。第三，通過對(duì)農(nóng)作物灌溉水的的檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)在固相萃取優(yōu)化條件下和液相色譜儀優(yōu)化條件下，測(cè)得3份100mL不同水樣，樣品中莠去津的含量值均未達(dá)到檢出限。

52、所以，計(jì)算得3份水樣中莠去津的濃度含量分別為樣品1濃度1.05ug/L，樣品2濃度1.09ug/L，樣品3濃度1.31ug/L，均低于國家限量標(biāo)準(zhǔn)。第四，通過本次設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的研究，利用固相萃取對(duì)樣品中莠去津的提取凈化，然后通過高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定的良好結(jié)合是快速而且高效環(huán)保的。這也為其他農(nóng)藥組分的檢測(cè)打下了很好的基礎(chǔ)。討論和展望一， 實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)：1. 綜合對(duì)比了固相萃取和液液萃取實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證的固相萃取的優(yōu)越性。2. 固相萃取分離凈化樣品高效環(huán)保3. 利用高效液相色譜法分析樣品，快速，高效，準(zhǔn)確，方便，簡(jiǎn)便。二，實(shí)驗(yàn)的不足和改進(jìn)：4. 固相萃取改進(jìn)為全自動(dòng)在線固相萃取會(huì)更好5. 由于條件關(guān)

53、系沒有進(jìn)行高效液相和液質(zhì)聯(lián)用或氣質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。6. 由于時(shí)間關(guān)系沒有對(duì)水中莠去津殘留隨時(shí)間的降解濃度探討。二， 對(duì)未來的展望：隨著社會(huì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，高效液相色譜法為其他農(nóng)藥殘留的檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)我們應(yīng)該在現(xiàn)在的基礎(chǔ)上更上一層樓，不斷開發(fā)出更加高效、快速、靈敏的檢測(cè)方法對(duì)農(nóng)藥殘留。也應(yīng)該對(duì)農(nóng)藥的降解進(jìn)行相關(guān)研究，然我們的環(huán)境更加美好，人們健康得到保證。參考文獻(xiàn)1 Francis A G. The Triazine Herbicides J. Residue Review. 1970，32： 40-42.2 華小梅.我國農(nóng)藥的生產(chǎn)、使用狀況及其污染環(huán)境因子分析 J . 環(huán)境科學(xué)進(jìn)展. 1996 ，4 ( 2 )： 33-35.3 Martine M. Spectrophotometric Method to DetermineTernary Mixture of Atrazine， Diuron and Chlorpyrifos in Water and Soil by a Ratiospectrum. zero Crossing Method J . J Assoc off Anal Chem. 19