石蠟切片的制作

1、個人收集整理僅供參考學習石蠟切片的制作石蠟切片法即用石蠟作為支持劑進行切片的方法。石蠟切片法是一般組織 學、病理學等常規(guī)制片方法，它有很多優(yōu)點，例如，比較省時間，容易操作，可 切成極薄的切片，能制作連續(xù)切片，組織塊可包埋在石蠟中永久保存等。 缺點是 只能用于較小的組織塊，較大的組織塊不易切好容易破碎， 組織在脫水透明過程 中產(chǎn)生收縮并易變脆，制片時間太長。一、石蠟切片的制作過程石蠟切片的制作過程主要是：取材一水洗一固定一水洗一脫水一透明一浸蠟一 包埋一切片一貼片一染色。（一） 取材及水洗根據(jù)實驗要求選取材料來源及部位， 取要求部位的小塊組織成為組織塊， 組 織塊的大小以不超過0.5立方厘米為宜

2、。切去組織塊時動作要輕，切忌用力牽引 或挾持，以免組織內(nèi)部發(fā)生變化。由動物身上切取的組織必須是新鮮的，材料越 新鮮越好，一般不應(yīng)超過死后 24小時，因此一般情況下，將動物處死后立即取 需要的材料。 個人收集整理 勿做商業(yè)用途組織塊取下后，先用相應(yīng)的生理鹽水漂洗以洗去血液、 污漬以及粘液等。如 果是管狀組織則必須把管腔中污物洗凈，可用注射器自一端向管腔中注射生理鹽 水數(shù)次，使其管腔沖洗干凈，切忌不可用刀或其他器具刮之。個人收集整理勿做商業(yè)用途（二）固定材料由動物體取下后應(yīng)當迅速固定，固定的目的是盡快使固定液滲入組織內(nèi) 部，將組織固定以保持其原有的結(jié)構(gòu)Q不同的綱織應(yīng)選用適當?shù)墓潭ㄒ?。固?液的用量

3、與組織塊體積之比一般在 20:1 ,不應(yīng)使組織塊貼于容器壁上。材料固 定完畢后，保存于嚴密緊塞或加蓋的容器里，同時在容器外上標簽，應(yīng)記錄固定 液的名稱，材料的種類，動物品種及開始固定的時間。固定的時間長短依據(jù)材料 大小而定。 個人收集整理勿做商業(yè)用途固定液有許多種，在固定的過程中應(yīng)該根據(jù)需要選取合適的固定液， 一般固 定液都以新配為好，配好后應(yīng)貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引起化學變 化而失去固定作用。有些混合固定液的成份之間會發(fā)生氧化還原作用，一定要在 使用前才混合，如果混合太早固定時就沒有作用了。 個人收集整理勿做商業(yè)用途（三）水洗固定后的組織塊在進行脫水前必須用流水洗去固定液，主要目

4、的是洗去 固定液的顏色以便后續(xù)的染色。水洗時，一般將其置于水龍頭下以自來水流水沖 洗，這樣可以使組織中的固定液隨時溢出， 洗得更干凈徹底，有些還需要進行特 殊的洗滌。個人收集整理 勿做商業(yè)用途（四）脫水固定之后的組織要進行脫水。由于組織內(nèi)的水不能和支持劑混合，所以必須 把組織中的水分徹底脫除。脫水有利于組織的透明和浸蠟，有利于組織的永久保 存。乙醇既可做固定劑也可做為脫水劑，再用酒精脫水的過程中，首先用 50% 的酒精進行脫水，然后再依次增加酒精濃度，直到最后用100%的酒精進行脫水。 如50% T0%70%80%90%95% T00% ,使用100%的酒精可以脫水兩次 到三次。脫水的時間應(yīng)該

5、視組織塊的大小而定。脫水必須徹底，否則不易透明， 甚至使透明劑內(nèi)出現(xiàn)白色混濁現(xiàn)象。 個人收集整理勿做商業(yè)用途（五）透明透明是石蠟切片法切片前必經(jīng)的一步，其目的主要是置換組織內(nèi)的脫水劑， 為下一步的浸蠟起到橋梁作用，并且使組織呈現(xiàn)不同程度的透明狀態(tài)，有利于光 線的透過。最常用的透明劑主要是二甲苯，它既能與酒精混溶，也可以任意比例 與石蠟混溶。在透明過程中，先用等比例混合的二甲苯和純酒精處理一段時間， 再用二甲苯進行處理二到三次即可。 用二甲苯處理的時間不可過長，否則組織容 易變脆。但是透明也必須徹底。 個人收集整理勿做商業(yè)用途（六） 浸蠟與包埋浸蠟的目的主要是置換組織中的透明劑， 為包埋做準備。

6、在浸滲前要先將選 好的石蠟分別以容器裝好放在恒溫箱中， 使其雜質(zhì)沉淀。石蠟最好選用軟蠟和硬 蠟兩種，冬天室溫較低時多用軟蠟，夏天室溫較高時多用硬蠟。浸滲應(yīng)在自動包 溫箱中進行。浸蠟時間不宜過長。浸蠟溫度過高或時間過長使組織收縮過度。浸蠟后的組織材料塊放在裝有蠟液的容器中， 待蠟液表層凝固即迅速放入冷水中冷 卻，即做成含有組織塊的蠟塊。容器可用光亮且厚的紙折疊成紙盒或金屬包埋框 盒。如果包埋的組織塊數(shù)量多，應(yīng)進行編號，以免差錯。個人收集整理勿做商業(yè)用途（七）切片包埋好的蠟塊用刀片修成規(guī)整的四棱臺， 將其固定在切片機上，使蠟塊切面 與切片刀刃平行，旋緊。切片刀的銳利與否、蠟塊硬度適當都直接影響切片

7、質(zhì)量， 按照一定的頻率切出一片接一片的蠟帶，用毛筆輕托輕放在紙上。切片可以是單 張，也可以是連續(xù)切片形成蠟帶。 個人收集整理勿做商業(yè)用途（八）貼片粘附劑將展平的蠟片牢附于載玻片上，以免在以后的脫蠟、水化及染色等步 驟中二者滑脫開。粘附劑是蛋白甘油。首先在潔凈的載玻片上涂抹薄層蛋白甘油，再將一定長度蠟帶（連續(xù)切片）或用刀片斷開成單個蠟片于溫水（45 c左右）中展平后，撈至玻片上鋪正，或直接滴兩滴蒸儲水于載玻片上， 再把蠟片放于水 滴上，略加溫使蠟片鋪展，最后用濾紙吸除多余水分，將載玻片放入45 c溫箱中干燥，也可在37c溫箱中干燥，但需適當延長時間。 個人收集整理勿做商業(yè)用途（九）染色為了觀察組

8、織內(nèi)部的細微結(jié)構(gòu)，必須應(yīng)用某些與固定后的原生質(zhì)有親合性的 染料對組織進行染色，否則有礙觀察。普通的染色法有兩種即蘇木精伊紅染色法， 染色結(jié)果是細胞核為紫色，細胞質(zhì)為粉紅色，另一種方法為鐵蘇木紫染色，染色 的結(jié)果是全部著以深淺不同的藍色。制作石蠟切片時最常用的染色方法是蘇木精 伊紅染色法。個人收集整理勿做商業(yè)用途二、固定的目的制作石蠟切片時，在取材并且洗凈之后應(yīng)該迅速固定， 其目的主要是使組織 液滲入到組織內(nèi)部殺死組織中的各種酶， 保持細胞原有的結(jié)構(gòu)，使觀察出來的結(jié) 果更加貼近實際，研究更加方便。而且固定能使組織硬化，有利于切片的進行， 而且也有媒浸作用，有利于組織著色。個人收集整理勿做商業(yè)用途

9、三、染色的機理石蠟切片制作過程中主要使用的是蘇木精-伊紅染色法，即HE染色法。蘇 木精染液為堿性，主要使細胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍色； 伊紅為 酸性染料，主要使細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)中的成分著紅色。 個人收集整理勿做商業(yè)用途易于被堿性或酸性染料著色的性質(zhì)分別稱為嗜堿性和嗜酸性； 組織內(nèi)構(gòu)成蛋 白質(zhì)的氨基酸種類很多，它們有不同的等電點。在普通染色法中，染色液的酸堿 度為pH6左右，細胞內(nèi)的酸性物質(zhì)如細胞核的染色質(zhì)、腺細胞和神經(jīng)細胞內(nèi)的5 / 6個人收集整理僅供參考學習粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及透明軟骨基質(zhì)等均被堿性染料染色，這些物質(zhì)稱為嗜堿性。而細胞 質(zhì)中的其它蛋白質(zhì)如紅細胞中的血紅蛋白、 嗜酸粒細胞

10、的顆粒及膠原纖維和肌纖 維等被酸性染料染色，這些物質(zhì)稱為嗜酸型。如果改變?nèi)旧旱乃釅A度，pH值升高時，則原來被酸性染料染色的物質(zhì)可變?yōu)槭葔A性；pH值降低時，原來被堿性染料染色的物質(zhì)則可變?yōu)槭人嵝?。所以說染色液的pH值可以影響染色的反應(yīng)。 個人收集整理勿做商業(yè)用途去氧核糖核酸（DNA）兩條鏈上的磷酸基向外，帶負電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性染料以離子鍵結(jié)合而被染色。蘇木精在堿性溶液中稱藍色，所以細胞核被染成藍色。伊紅 Y是一種化學合成的酸性染料，在水中離 解成帶負電荷的陰離子，與蛋白質(zhì)的氨基正電荷的陽離子結(jié)合使胞漿染色，細胞漿、紅細胞、肌肉、結(jié)締組織、嗜伊紅顆粒等被染成不同程度的紅色或粉紅色， 與藍色的細胞核形成鮮明對比。伊紅是細胞漿的良好染料。由于組織或細胞的不 同成分對蘇木精的親和力不同及染色性質(zhì)不一樣。經(jīng)蘇木精染色后，細胞核及鈣 鹽粘液等呈藍色，可用鹽酸酒精分化和弱堿性溶液顯藍， 如處理適宜，可使細胞 核著清楚的深藍色，胞漿等其它成分脫色。再利用胞漿染料伊紅染胞漿，使胞漿 的各種不同成分又呈現(xiàn)出深淺不同的粉紅色。 一般的組織變化和組織產(chǎn)物都可以 通過這一染色法顯示出來，是形態(tài)學最常用的染色方法。個人收集整理勿做商業(yè)用