石蠟切片的制作

1、個(gè)人收集整理僅供參考學(xué)習(xí)石蠟切片的制作石蠟切片法即用石蠟作為支持劑進(jìn)行切片的方法。石蠟切片法是一般組織 學(xué)、病理學(xué)等常規(guī)制片方法，它有很多優(yōu)點(diǎn)，例如，比較省時(shí)間，容易操作，可 切成極薄的切片，能制作連續(xù)切片，組織塊可包埋在石蠟中永久保存等。 缺點(diǎn)是 只能用于較小的組織塊，較大的組織塊不易切好容易破碎， 組織在脫水透明過(guò)程 中產(chǎn)生收縮并易變脆，制片時(shí)間太長(zhǎng)。一、石蠟切片的制作過(guò)程石蠟切片的制作過(guò)程主要是：取材一水洗一固定一水洗一脫水一透明一浸蠟一 包埋一切片一貼片一染色。（一） 取材及水洗根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選取材料來(lái)源及部位， 取要求部位的小塊組織成為組織塊， 組 織塊的大小以不超過(guò)0.5立方厘米為宜

2、。切去組織塊時(shí)動(dòng)作要輕，切忌用力牽引 或挾持，以免組織內(nèi)部發(fā)生變化。由動(dòng)物身上切取的組織必須是新鮮的，材料越 新鮮越好，一般不應(yīng)超過(guò)死后 24小時(shí)，因此一般情況下，將動(dòng)物處死后立即取 需要的材料。 個(gè)人收集整理 勿做商業(yè)用途組織塊取下后，先用相應(yīng)的生理鹽水漂洗以洗去血液、 污漬以及粘液等。如 果是管狀組織則必須把管腔中污物洗凈，可用注射器自一端向管腔中注射生理鹽 水?dāng)?shù)次，使其管腔沖洗干凈，切忌不可用刀或其他器具刮之。個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途（二）固定材料由動(dòng)物體取下后應(yīng)當(dāng)迅速固定，固定的目的是盡快使固定液滲入組織內(nèi) 部，將組織固定以保持其原有的結(jié)構(gòu)Q不同的綱織應(yīng)選用適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ?。固?液的用量

3、與組織塊體積之比一般在 20:1 ,不應(yīng)使組織塊貼于容器壁上。材料固 定完畢后，保存于嚴(yán)密緊塞或加蓋的容器里，同時(shí)在容器外上標(biāo)簽，應(yīng)記錄固定 液的名稱，材料的種類，動(dòng)物品種及開(kāi)始固定的時(shí)間。固定的時(shí)間長(zhǎng)短依據(jù)材料 大小而定。 個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途固定液有許多種，在固定的過(guò)程中應(yīng)該根據(jù)需要選取合適的固定液， 一般固 定液都以新配為好，配好后應(yīng)貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引起化學(xué)變 化而失去固定作用。有些混合固定液的成份之間會(huì)發(fā)生氧化還原作用，一定要在 使用前才混合，如果混合太早固定時(shí)就沒(méi)有作用了。 個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途（三）水洗固定后的組織塊在進(jìn)行脫水前必須用流水洗去固定液，主要目

4、的是洗去 固定液的顏色以便后續(xù)的染色。水洗時(shí)，一般將其置于水龍頭下以自來(lái)水流水沖 洗，這樣可以使組織中的固定液隨時(shí)溢出， 洗得更干凈徹底，有些還需要進(jìn)行特 殊的洗滌。個(gè)人收集整理 勿做商業(yè)用途（四）脫水固定之后的組織要進(jìn)行脫水。由于組織內(nèi)的水不能和支持劑混合，所以必須 把組織中的水分徹底脫除。脫水有利于組織的透明和浸蠟，有利于組織的永久保 存。乙醇既可做固定劑也可做為脫水劑，再用酒精脫水的過(guò)程中，首先用 50% 的酒精進(jìn)行脫水，然后再依次增加酒精濃度，直到最后用100%的酒精進(jìn)行脫水。 如50% T0%70%80%90%95% T00% ,使用100%的酒精可以脫水兩次 到三次。脫水的時(shí)間應(yīng)該

5、視組織塊的大小而定。脫水必須徹底，否則不易透明， 甚至使透明劑內(nèi)出現(xiàn)白色混濁現(xiàn)象。 個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途（五）透明透明是石蠟切片法切片前必經(jīng)的一步，其目的主要是置換組織內(nèi)的脫水劑， 為下一步的浸蠟起到橋梁作用，并且使組織呈現(xiàn)不同程度的透明狀態(tài)，有利于光 線的透過(guò)。最常用的透明劑主要是二甲苯，它既能與酒精混溶，也可以任意比例 與石蠟混溶。在透明過(guò)程中，先用等比例混合的二甲苯和純酒精處理一段時(shí)間， 再用二甲苯進(jìn)行處理二到三次即可。 用二甲苯處理的時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，否則組織容 易變脆。但是透明也必須徹底。 個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途（六） 浸蠟與包埋浸蠟的目的主要是置換組織中的透明劑， 為包埋做準(zhǔn)備。

6、在浸滲前要先將選 好的石蠟分別以容器裝好放在恒溫箱中， 使其雜質(zhì)沉淀。石蠟最好選用軟蠟和硬 蠟兩種，冬天室溫較低時(shí)多用軟蠟，夏天室溫較高時(shí)多用硬蠟。浸滲應(yīng)在自動(dòng)包 溫箱中進(jìn)行。浸蠟時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。浸蠟溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使組織收縮過(guò)度。浸蠟后的組織材料塊放在裝有蠟液的容器中， 待蠟液表層凝固即迅速放入冷水中冷 卻，即做成含有組織塊的蠟塊。容器可用光亮且厚的紙折疊成紙盒或金屬包埋框 盒。如果包埋的組織塊數(shù)量多，應(yīng)進(jìn)行編號(hào)，以免差錯(cuò)。個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途（七）切片包埋好的蠟塊用刀片修成規(guī)整的四棱臺(tái)， 將其固定在切片機(jī)上，使蠟塊切面 與切片刀刃平行，旋緊。切片刀的銳利與否、蠟塊硬度適當(dāng)都直接影響切片

7、質(zhì)量， 按照一定的頻率切出一片接一片的蠟帶，用毛筆輕托輕放在紙上。切片可以是單 張，也可以是連續(xù)切片形成蠟帶。 個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途（八）貼片粘附劑將展平的蠟片牢附于載玻片上，以免在以后的脫蠟、水化及染色等步 驟中二者滑脫開(kāi)。粘附劑是蛋白甘油。首先在潔凈的載玻片上涂抹薄層蛋白甘油，再將一定長(zhǎng)度蠟帶（連續(xù)切片）或用刀片斷開(kāi)成單個(gè)蠟片于溫水（45 c左右）中展平后，撈至玻片上鋪正，或直接滴兩滴蒸儲(chǔ)水于載玻片上， 再把蠟片放于水 滴上，略加溫使蠟片鋪展，最后用濾紙吸除多余水分，將載玻片放入45 c溫箱中干燥，也可在37c溫箱中干燥，但需適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。 個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途（九）染色為了觀察組

8、織內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)，必須應(yīng)用某些與固定后的原生質(zhì)有親合性的 染料對(duì)組織進(jìn)行染色，否則有礙觀察。普通的染色法有兩種即蘇木精伊紅染色法， 染色結(jié)果是細(xì)胞核為紫色，細(xì)胞質(zhì)為粉紅色，另一種方法為鐵蘇木紫染色，染色 的結(jié)果是全部著以深淺不同的藍(lán)色。制作石蠟切片時(shí)最常用的染色方法是蘇木精 伊紅染色法。個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途二、固定的目的制作石蠟切片時(shí)，在取材并且洗凈之后應(yīng)該迅速固定， 其目的主要是使組織 液滲入到組織內(nèi)部殺死組織中的各種酶， 保持細(xì)胞原有的結(jié)構(gòu)，使觀察出來(lái)的結(jié) 果更加貼近實(shí)際，研究更加方便。而且固定能使組織硬化，有利于切片的進(jìn)行， 而且也有媒浸作用，有利于組織著色。個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途

9、三、染色的機(jī)理石蠟切片制作過(guò)程中主要使用的是蘇木精-伊紅染色法，即HE染色法。蘇 木精染液為堿性，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍(lán)色； 伊紅為 酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。 個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途易于被堿性或酸性染料著色的性質(zhì)分別稱為嗜堿性和嗜酸性； 組織內(nèi)構(gòu)成蛋 白質(zhì)的氨基酸種類很多，它們有不同的等電點(diǎn)。在普通染色法中，染色液的酸堿 度為pH6左右，細(xì)胞內(nèi)的酸性物質(zhì)如細(xì)胞核的染色質(zhì)、腺細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的5 / 6個(gè)人收集整理僅供參考學(xué)習(xí)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及透明軟骨基質(zhì)等均被堿性染料染色，這些物質(zhì)稱為嗜堿性。而細(xì)胞 質(zhì)中的其它蛋白質(zhì)如紅細(xì)胞中的血紅蛋白、 嗜酸粒細(xì)胞

10、的顆粒及膠原纖維和肌纖 維等被酸性染料染色，這些物質(zhì)稱為嗜酸型。如果改變?nèi)旧旱乃釅A度，pH值升高時(shí)，則原來(lái)被酸性染料染色的物質(zhì)可變?yōu)槭葔A性；pH值降低時(shí)，原來(lái)被堿性染料染色的物質(zhì)則可變?yōu)槭人嵝浴Ｋ哉f(shuō)染色液的pH值可以影響染色的反應(yīng)。 個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途去氧核糖核酸（DNA）兩條鏈上的磷酸基向外，帶負(fù)電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性染料以離子鍵結(jié)合而被染色。蘇木精在堿性溶液中稱藍(lán)色，所以細(xì)胞核被染成藍(lán)色。伊紅 Y是一種化學(xué)合成的酸性染料，在水中離 解成帶負(fù)電荷的陰離子，與蛋白質(zhì)的氨基正電荷的陽(yáng)離子結(jié)合使胞漿染色，細(xì)胞漿、紅細(xì)胞、肌肉、結(jié)締組織、嗜伊紅顆粒等被染成不同程度的紅色或粉紅色， 與藍(lán)色的細(xì)胞核形成鮮明對(duì)比。伊紅是細(xì)胞漿的良好染料。由于組織或細(xì)胞的不 同成分對(duì)蘇木精的親和力不同及染色性質(zhì)不一樣。經(jīng)蘇木精染色后，細(xì)胞核及鈣 鹽粘液等呈藍(lán)色，可用鹽酸酒精分化和弱堿性溶液顯藍(lán)， 如處理適宜，可使細(xì)胞 核著清楚的深藍(lán)色，胞漿等其它成分脫色。再利用胞漿染料伊紅染胞漿，使胞漿 的各種不同成分又呈現(xiàn)出深淺不同的粉紅色。 一般的組織變化和組織產(chǎn)物都可以 通過(guò)這一染色法顯示出來(lái)，是形態(tài)學(xué)最常用的染色方法。個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用