常見實驗方法匯總常用

1、技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號（201203）常用實驗方法匯總目錄一Western Blot（蛋白質印跡法）3二免疫組化技術4三. 免疫熒光技術（Immunofluorescence technique ）6四免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）8五GST-pulldown9六雙向凝膠電泳11七ELISA 免疫測定12八酵母雙雜交系統(tǒng)14九熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)17十. RT-PCR19十一. 第二代DNA技術20伯豪生物十二. . . .

2、. . . . .23十三. Real-Time PCR25十四. RACE 技術28十五. DNase I 足跡試驗30十六. DNase I 超敏感位點的研究32十七. Northern blot34十八. digital PCR36十九. Luciferase 報告系統(tǒng)38二十. 凝膠遷移或電泳遷移率實驗（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）39二十一. 染色質免疫共沉淀技術（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）42二十二. RNA 結合蛋白免疫沉淀45二十三. 熒光原位雜交技術（Fluorescence

3、in situ hybridization, FISH）48二十四. RNA-蛋白 Pull-Down50二十五.機制信號通路關鍵和抑制劑521 / 87技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號（201203）二十六.機制-細胞器典型標志物62二十七.A（GeneA）的敲減載體構建64二十八. GeneA 過表達載體構建64二十九. GeneA 點突變載體構建65三十. GeneA 敲除載體構建（CRISPR/Cas9 法）65三十一. GeneA 敲除載體構建（TALENs 法）65三十二. GeneA 的 miRNA 載體表達構建66三十三. 原代細胞培養(yǎng)與分離6

4、7三十四. 干細胞分離培養(yǎng)68三十五. 細胞增殖相關研究方法70三十六. 細胞轉移相關研究方法73三十七.生成75三十八. 細胞周期：PI 染色76伯豪生物三十九. 細胞凋亡檢測76四十. 細胞分選78四十一. 細胞轉染79四十二. 細胞慢.80四十三.穩(wěn)定細胞株的篩選80四十四. 耐藥細胞株的篩選81四十五. 細胞共培養(yǎng)81四十六. 研究腫瘤細胞增殖82四十七. 研究腫瘤細胞轉移82四十八. 研究腫瘤細胞耐藥84四十九. 免疫組化85五十. HE 染色862 / 87技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號（201203）一Western Blot（蛋白質印跡法）概

5、述：蛋白質印跡法（免疫印跡試驗）即 Western Blot，它是生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色，通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況的信息。目的：獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中的表達情況的信息。原理：與 Southern 或 Northern 雜交方法類似，但 Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過 PAGE 分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體(例如硝酸素薄膜)上，固相載體以非共價鍵形式吸

6、附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的表達的蛋白成分。伯豪生物步驟：1.提取組織或細胞蛋白；2.測定蛋白質濃度 ；3.電泳：電泳條件為： 恒壓 100V， 待120min）；4.電轉膜儀轉膜 ：前沿移行到距離凝膠底部 2-3mm 時方可停止（ 約轉膜條件為：恒流 250mA ，2h（時間可根據目的蛋白5.封閉：5%脫脂牛奶室溫封閉 1h；量適當調整）；6. 加一抗：一抗封膜之后室溫條件下搖 1h 然后放入 4冰箱中過夜；7. 收一抗

7、，PBST 洗膜 3 次，10min/次；8. 二抗孵育：室溫孵育 1h，所用二抗的比例和種屬見步驟 9）表格。9.洗膜：PBST 洗膜 2 次，PBS 洗膜一次，10min/次。10.顯色流程圖：3 / 87技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號（201203）二免疫組化技術:概述：免疫組織化學（Immunohistochemistry）是組織化學的分支，它是用標記的特異性抗體（或抗原）對組織內抗原（或抗體）的分布進行組織和細胞原位檢測的技術。凡是組織細胞內伯豪生物具有抗原性的物質，如肽類、激素、神經遞質、細胞因子、受體 表面抗原等均可用免疫組織化學方法顯示，因而

8、目前在基礎與臨床科研中被廣泛應用。免疫組織化學染色方法分類：1、按標記物質的種類，如熒光、放射性同位素、酶（主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶）、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、酶標法和免疫金銀法等。2、按染色步驟可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）；與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。3、按結合方式可分為抗原抗體結合，如過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP）法和親和連接，如卵白素-生物素-過氧化物酶復合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）法等。目的：對所研究的大如肽類、激素、神經遞質、細胞因子、受體、表面抗原等進行，進而深入研究其功能。

9、原理：1、免疫熒光方法4 / 87技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號（201203）免疫熒光方法是最早建立的免疫組織化學技術。它利用抗原抗體特異性結合的原理，先將已知抗體標上熒光素，以此作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當抗原抗體復合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會發(fā)出一定波長的熒光，從而可確定組織中某種抗原的，進而還可進行定量分析。由于免疫熒光技術特異性強、靈敏度高、快速簡便，所以在臨床病理診斷、檢驗中應用比較廣。2、免疫酶標方法免疫酶標方法是繼免疫熒光后，于 60 年代發(fā)展起來的技術?；驹硎窍纫悦笜擞浀目贵w與組織或細胞作用，然后加入

10、酶的底物，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細胞表面和細胞內的各種抗原成分進行研究。免疫酶標技術是目前最常用的技術。3、免疫膠體金技術免疫膠體金技術是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對蛋白的生物學活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體金標記一抗、二抗或其他能特異性結合免疫球蛋白的(如葡萄球菌 A 蛋白)等作為探針，就能對組織或細胞內的抗原進行定性、，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，伯豪生物且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術特別適合于免疫電鏡的單標記或多標記研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也

11、適合進行光鏡觀察。如應用銀加強的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。步驟：1. 洗載玻片2. 包埋組織3. 切片4. 撈組織5. 脫蠟6. 抗原修復7. 血清封閉8. 加一抗9. 加二抗10. 加SABC11. 加顯色劑12. 復染13. 脫水5 / 87技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號（201203）14. 封片流程圖：伯豪生物三. 免疫熒光技術（Immunofluorescence technique ）概述：免疫熒光技術（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術，它是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光基團，

12、再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質和。目的：測定內激素、蛋白質、多肽、核酸、神經遞質、受體、細胞因子、細胞表面抗原、腫瘤標志物、血藥濃度等各種生物活性物質。步驟：1、細胞準備；2、固定。根據需要選擇適當的固定劑固定細胞，固定完畢后的細胞可置于含疊氮納的 PBS中 4保存 3；6 / 87技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號（201203）3、通透。使用交聯劑（如多聚）固定后的細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通

13、透劑應充分考慮抗原蛋白的性質。4、封閉。使用封閉液對細胞進行封閉。5、一抗結合。室溫孵育 1h 或者 4過夜。6、二抗結合。間接免疫熒光需要使用二抗。7、封片，熒光顯微鏡檢查。流程圖：伯豪生物7 / 87技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號（201203）四免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）概述：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一種以抗體和抗原之間的特異免疫反應為基礎，研究蛋白質與蛋白質間相互作用的經典方法。其基本原理是在細胞裂解液中加入抗原特異性的抗體，抗體、抗原、以及與抗原具有相互作用

14、的蛋白質通過抗原與抗體之間免疫沉淀反應將形成免疫復合物，經過純化，洗脫，收集免疫復合物，SDS-PAGE 電泳， western blot 和（或）質譜可鑒定出與抗原相互作用的蛋白質。其優(yōu)點為：（1）相互作用的蛋白質都是經翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為的影響；（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物。缺點為：（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質蛋白質相互作用；（2）兩種蛋白質的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋梁作用； （3）必須在實驗前目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若不正確，實驗就得不到結果，方法本身具有

15、性。伯豪生物目的：研究一種已知蛋白質與已知或者未知蛋白質間相互作用原理：當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質-蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質 X 的抗體免疫沉淀 X，那么與 X 在體內結合的蛋白質 Y 也能沉淀下來。步驟：1.用 RIPA 裂解緩沖液裂解細胞；2. 用PBS 配制成 50%的 protein A/G-agarose 工作液；3. 在樣品中以每 1ml 中加 100l 的比例，加入 50%的Protein A/G agarose 工作液。水平搖床4搖動 10min（該步驟的目的是去除非特異性結合的蛋白）；4. 4，14000g 離心 15min，

16、將上清轉移到一個新的離心管中，去除 protein A/G-agraose 微球；5. 使用 BCA 法或者其他方法測定總蛋白的濃度；6. 加入一定體積的一抗；8 / 87技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號（201203）8. 用搖床緩慢搖動抗原抗體混合物，4過夜；9. 14000g 離心收集沉淀，并且用預冷的洗滌緩沖液（或者預冷的PBS）洗滌 3 遍；10. 收集上清，用于進一步的下游 SDS-PAGE、western-blot 或者質譜分析。流程圖：五GST-pulldown伯豪生物概述：GST pull-down 實驗是一個行之有效的驗證酵母雙雜交系統(tǒng)的體

17、外試驗技術，近年來越來越受到廣大學者的青睞。其基本原理是將靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase 谷胱苷肽巰基轉移酶）融合蛋白親和在谷胱甘肽親和樹脂上,作為與目的蛋白親和的支撐物，充當一種“誘餌蛋白”，目的蛋白溶液過柱，可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白)，洗脫結合物后通過SDS-PAGE 電泳分析，從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應的目的蛋白，“誘餌蛋白” 和“捕獲蛋白”均可通過細胞裂解物、純化蛋白、表達系統(tǒng)以及體外轉錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。目的：體外檢測蛋白質與蛋白質之間相互作用，用于驗證兩個已知蛋白的相互作用，或者篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白

18、。原理：9 / 87技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號（201203）利用重組技術將探針蛋白與 GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通過 GST 與固相化在載體上的 GTH（Glutathione）親和結合。因此，當與融合蛋白有相互作用的蛋白通過層析柱時或與此固相復合物混合時就可被吸附而分離。步驟：.Glutathione 瓊脂糖珠預處理；.GST 融合蛋白掛柱：取適 GST-融合蛋白與已經處理過的 beads 置于管中，4，搖床孵育過夜；.孵育過夜的蛋白質與 beads 的混合液于 4，離心,上清收集，觀察融合蛋白是否飽和

19、地掛在 beads 上；.把轉染目的的細胞裂解在細胞裂解液里（含蛋白酶抑制劑），最大轉速4離心，收集上清液；.將細胞裂解液上清加入 beads；.加上 SDS 上樣緩沖液；伯豪生物.SDS-PAGE，Western Blot 或者質譜儀分析。流程圖：10 / 87技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號（201203）伯豪生物六雙向凝膠電泳概述：雙向凝膠電泳技術結合了等電聚焦技術（根據蛋白質等電點進行分離）以及 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳技術（根據蛋白質的大小進行分離）。這兩項技術結合形成的二維電泳是分離分析蛋白質最有效的一種電泳。目的：凝膠中蛋白的檢測、圖像和分析、蛋

20、白鑒定、分離蛋白質組所有蛋白 。原理：1、 根據蛋白質的等電點（第一向）和量（第二向）的不同進行分離。，在不同的 pH 環(huán)境中可以帶正電荷、負電荷或不帶電荷。對每個蛋白質是兩性蛋白質來說都有一個特定的 pH，此時蛋白質的靜電荷為零，此 pH 值即該蛋白質的等電點(pI)。將蛋白質樣品加載至 pH 梯度介質上進行電泳時，它會向與其所帶電荷相反的電極方向移動。在移動過程中，蛋白可能獲得或失去質子，并且隨著移動的進行，該蛋白所帶的電荷數和遷移速度下降。當蛋白質遷移至其等電點 pH 位置時，其凈電荷數為零，在11 / 87技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號（201203

21、）電場中不再移動。聚焦是一個與 pH 相關的平衡過程：蛋白質以不同的速率靠近并最終停留在它們各自的pI 值；在等電聚焦過程中，蛋白質可以從各個方向移動到它的恒點。雙向電泳的第二向是將 IPG 膠條中經過第一向分離的蛋白轉移到第二向 SDSPAGE凝膠上，根據蛋白相對質量或量(MW)大小與第一相垂直的分離。蛋白質與十二烷基硫酸鈉(SDS)結合形成帶負電荷的蛋白質-SDS 復合物，由于 SDS 是一種強陰離子去垢劑，所帶的負電荷遠遠超過蛋白質原有的電荷量，能消除不同之間原有的電荷差異，從而使得凝膠中電泳遷移率不再受蛋白質原有電荷的影響，而主要取決于蛋白質的質量大小，其遷移率與量的對數呈線性關系。步

22、驟：.樣品.第一向分離 等電聚焦.第二向分離 聚丙烯酰胺凝膠電泳.修飾和，如用 32P 標記可以研究磷酸化蛋白的變化流程圖：伯豪生物七ELISA 免疫測定概述：12 / 87技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號（201203）ELISA 是酶聯接免疫吸附劑測定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術。此項技術自 70 年代初問世以來， 發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學和醫(yī)學科學的許多領域。在臨床檢驗中主要通過抗原抗體反應檢測體液中的抗體或抗原性物質。目的：1.

23、測定體液中的各種蛋白質，包括含量極少的蛋白質如甲胎蛋白等；2. 測定激素，包括小量的甾體激素等；3.測定抗生素和；4. 測定病原體抗原，HBsAg、HBeAg 等；5. 利用純化的抗原檢測標本中的抗體，例如抗-HBs 等；原理：ELISA 的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用伯豪生物洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時

24、固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。步驟：1. 包被；2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品 0.1ml 于上述已包被之反應孔中，置 37孵育 1 小時。然后洗滌(同時做空白孔，對照孔及陽性對照孔)；3.加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定后的稀釋度)0.1ml。37孵育 0.51 小時，洗滌。4.5.6.加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的 TMB 底物溶液 0.1m

25、l，371030 分鐘； 終止反應：于各反應孔中加入 2M 硫酸 0.05ml；結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，反應為無色或極淺。也可測 OD 值：在 ELISA 檢測儀上，于 450nm 處，以空白對照孔調零后測各孔 OD 值。13 / 87技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號（201203）流程圖：八酵母雙雜交系統(tǒng)概述：酵母雙雜交由 Fields 在提出，他的產生是基于對真核細胞轉錄因子特別是酵母轉錄伯豪生物因子 GAL4 性質的研究。GAL4 包括兩個彼此分離的但功能必需的結構域，分別是位于 N端 1-147 位

26、氨基酸殘基區(qū)段的 DNA 結合域（DNA binding domainDNA-BD）和位于 C 端768-881 位氨基酸殘基區(qū)段的轉錄激活域（Activationdomain，AD)。DNA-BD 能夠識別位于 GAL4 效應（GAL4-responsivegene）的上游激活序列(Upstream activating sequence，UAS)，并與之結合。而 AD 則是通過與轉錄機構（transcription machinery）中的其他成分之間的結合作用，以啟動 UAS 下游的進行轉錄。DNA-BD 和 AD 單獨分別作用并不能激活轉錄反應，但是當二者在空間上充分接近時，則呈現完整

27、的 GAL4 轉錄因子活性并可激活 UAS 下游啟動子，使啟動子下游得到轉錄。酵母雙雜交系統(tǒng)的最主要的應用是快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用及分離新的與已知蛋白作用的配體及其編碼。酵母雙雜交系統(tǒng)檢測蛋白之間的相互作用具有以下優(yōu)點： 作用信號是在融合表達后，在細胞內重建轉錄因子的作用，省去了純化蛋白質的繁瑣步驟。 檢測在活細胞內進行，可以在一定程度上代表細胞內的真實情況。 檢測的結果可以是表達產物的積累效應，因而可檢測存在于蛋白質之間的微弱的或暫時的相互作用。酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、細胞類型和分化時期材料構建cDNA 文庫，能分析細胞漿、細胞核及膜結合蛋白等多種不同亞細胞部位及功能的蛋

28、白。酵母雙雜交系統(tǒng)仍存在一些局限性：雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用于細胞核內，而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后如糖基化、二硫鍵形成等，這些反應在核內無14 / 87技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號（201203）法進行。另外有些蛋白的正確折疊和功能有賴于其他非酵母蛋白的輔助，這限制了某些細胞外蛋白和細胞膜受體蛋白等的研究。酵母雙雜交系統(tǒng)的一個重要的問題是"假陽性"。由于某些蛋白本身具有激活轉錄功能或在酵母中表達時發(fā)揮轉錄激活作用，使 DNA 結合結構域雜交蛋白在無特異激活結構域的情況下可激活轉錄。另外某些蛋白表面含有對多種蛋白質的低親和力

29、區(qū)域， 能與其他蛋白形成穩(wěn)定的復合物，從而引起報告的表達，產生"假陽性"結果。目的：1. 發(fā)現新的蛋白質和蛋白質相互作用；2. 在細胞體內研究抗原和抗體的相互作用；3. 篩選4. 建立作用位點及對蛋白相互作用影響；組蛋白連鎖圖，原理：酵母的轉錄激活因子 GAL4 由兩個可以的、功能上相互的結構域 DNA 結合域(DNA binding domain BD)和的轉錄激活域(transcription activation domain,AD)。BD 可以和伯豪生物上游激活序列(upstream ac ivating sequence，UAS)結合，而 AD 則能激活 UAS

30、下游的進行轉錄。但是 單獨的 BD 或 AD 不能激活轉錄，它們之間只有通過某種方式結合在一起才具有完整的轉錄激活因子的功能。酵母雙雜交系統(tǒng)主要利用酵母的 GAL4 的這個特性通過兩個雜交蛋白在酵母細胞中的相互結合及對報告的轉錄激活來研究活細胞內蛋白質的相互作用，對蛋白質之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過報告敏感地檢測到。步驟：1、酵母菌株的保存與表達型驗證1)用接種環(huán)將凍存在-70 C°的酵母 Y190 貯備備液劃于 YPD 瓊脂培養(yǎng)平板上，在 30 C°培養(yǎng)，直到菌落直徑達到 2mm，約需 3-5 天，密封平板，4°C 保存。2)正常的Y190 菌落由于 ade

31、2-101 突變而呈粉紅色，并且直徑>2mm。挑取 3-4 個菌落置于不同培養(yǎng)平板上(SD/-Trp，SD/-Leu,，SD/-His，SD/-Ura，YPD)，培養(yǎng) 4-6 天。核對其不同的生長情況。由于 Y190 可以有輕微的 His3 泄漏表達，所以需要在 SD/-His 的培養(yǎng)基中加入的競爭性拮抗劑 3-AT(3-ammino-l,2,4-triazole，25mmol/L)，以抑制背景生長。2、酵母感受態(tài)細胞15 / 87技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號（201203）挑取數個直徑 2-3 mm 的酵母單菌落放入 1 ml YPD 液體培養(yǎng)基中

32、，劇烈振蕩使菌落分散， 然后轉入 50ml YPDA 液體培養(yǎng)基中。以 250 rpm、30°C 的條件培養(yǎng) 16-18h 達到穩(wěn)定期。將過夜培養(yǎng)物轉入 YPDA 液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，使 OD600 值達到 0.4-0.6。室溫下4,000 rpm 離心 5 min 收集菌體，用無菌 IxTE 洗菌體后，用新鮮配制的 1 xTE/LiAc 溶液重懸。3、酵母感受態(tài)細胞的轉化1)PEG/LiAc 溶液。2)將各組分在反應管中混勾(BD 載體構建產物 0.1 g + AD 載體構建產物 0.1 g +鮭精 DNA0.1 mg)。3) 在反應管中加入酵母感受態(tài)細胞 100 l，

33、混勻；4) 加入PEG/LiAc 溶液 0.6 ml，混勻；5) 30 C°培養(yǎng) 30min；6) 加入DMSO 70 l 以達到 10%的終濃度，輕輕顛倒混勻；7) 42°C 水浴中熱休克 15 min； 8)冰浴 10 min；伯豪生物9)14,000 rpm 離心 5 s 沉淀細胞；10)用 IxTE 重懸細胞。4、共轉化產物的培養(yǎng)和處理共轉化的酵母細胞鋪于 SD/-Trp/-Leu/-His+3-AT(25mM)培養(yǎng)平板上。30°C 倒置培養(yǎng) 7-10 天， 直至菌落出現。選擇直徑>2 mm 的淡粉色菌落,用牙簽重新點種在新鮮的 SD/-Trp/-L

34、eu/-His+3-AT(25mM)培養(yǎng)平板上，繼續(xù)培養(yǎng) 2-4 天，此時可進行半乳糖苷酶活性檢測。5、LacZ活性的測定1) 將 SD/-Trp/-Leu/-His+3-AT(25mM)培養(yǎng)平板上的克隆印跡到新華 3 號濾紙上；2) 濾紙克隆面朝上，在液氮中冷凍 10s 以上，取出，室溫放置數分鐘；3) 在一平皿中放一張新華 3 號濾紙，再加入 2ml Z buffer/X-Gal 溶液，盡量避免出現氣泡。4) 將濾紙置于濾紙上，克隆面朝上，盡量避免出現氣泡。30°C 溫浴。5) 觀察濾紙上克隆顏色反應。一般菌落半乳糖苷酶的表達需要 30min-8 h。流程圖：16 / 87技術服

35、務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號（201203）九熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)伯豪生物概述：熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）作為一種高效的光學“分子尺”，在生物大相互作用、免疫分析、核酸檢測等方面有廣泛的應用。在生物學領域，該技術可用于研究活細胞生理條件下蛋白質-蛋白質間的相互作用。蛋白質-蛋白質間相互作用在整個細胞生命過程中占有重要地位，由于細胞內各種組分極其復雜，因此一些傳統(tǒng)研究蛋白質-蛋白質間相互作用的方法如酵

36、母雙雜交、免疫沉淀等可能會丟失某些重要的信息，無法正確地反映在當時活細胞生理條件下蛋白質-蛋白質間相互作用的動態(tài)變化過程。FRET 技術是近來發(fā)展的一項新技術，為在活細胞生理條件下對蛋白質-蛋白質間相互作用進行實時的動態(tài)研究提供了便利。目的：1. 活細胞內檢測蛋白激酶活性；2. 細胞凋亡的研究；3. 受體激活效應在細胞膜上的橫向擴散；4.膜蛋白的修飾；5.細胞膜受體之間相互作用；6.細胞內之間相互作用。17 / 87技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號（201203）原理：熒光共振能量轉移是指兩個熒光發(fā)色基團在足夠靠近時，當供體吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電

37、子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過偶極子相互作用，實現了能量向鄰近的受體轉移（即發(fā)生能量共振轉移）。FRET 是一種非輻射能量躍遷，通過間的電偶極相互作用，將供體激發(fā)態(tài)能量轉移到受體激發(fā)態(tài)的過程，使供體熒光強度降低，而受體可以發(fā)射更強于本身的特征熒光（敏化熒光），也可以不發(fā)熒光（熒光猝滅），同時也伴隨著熒光的相應縮短或延長。能量轉移的效率和供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜的重疊程度、供體與受體的躍遷偶極的相對取向、供體與受體之間的距離等因素有關。作為共振能量轉移供、受體對，熒光物質必須滿足以下條件：受、供體的激發(fā)光要足夠分得開；供體的發(fā)光光譜與受體的激發(fā)光譜要重疊。伯豪生物步驟：1 、實驗所用細胞

38、的培養(yǎng)；2 細胞轉染質粒：CFP-A和 YFP-B質粒；3 多光子共聚焦顯微鏡和 FRET 觀察18 / 87技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號（201203）FRET 檢測時間：CFP-A測 FRET。或 YFP-B轉染細胞 12h、18h、24h、36h、48h、72h 后檢FRET 圖像：確定 FRET 配對的激發(fā)波長， 藍寶石激光被調諧分別用于探測最大和最小的供體和受體信號， 最大供體信號和最小受體信號對應的波長用于收集雙表達細胞的FRET 信號。標定 CFP （供體）和 YFP （受體），調整激光變化，以便獲取最大 CFP 信號和最小 YFP 信號的激

39、發(fā)光波長，以此激發(fā)（CFP-YFP）雙表達細胞，選擇合適的濾鏡組合和高靈敏的PMT，供體和受體圖像，收集 FRET 信號，調整供體激光強度，固定用于激發(fā)供體，對受體激發(fā)波長也類似要求，注意調整能量，使用合適的中性密度濾光片，避免光漂白。每個細胞FRET 檢測重復 3 次，每種轉染至少完成 6 個細胞的 FRET 檢測。FRET 數據處理： 去除 FRET 信號中DSBT 和 ASBT 的光譜串色信號； 受體通路的FRET 信號需要對供體受體光譜靈敏度的變化進行矯正、對自發(fā)熒光和光學噪聲進行矯正； 利用矯正系數對雙標定細胞進行象素匹配矯正。十. RT-PCR伯豪生物概述：RT- PCR（Reve

40、rse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆轉錄 PCR是將 RNA 的逆轉錄（RT）和 cDNA 的聚合酶鏈式擴增反應（PCR）相結合的技術 RT-PCR 技術靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞/組織中表達水平，細胞中 RNA的含量和直接克隆特定的cDNA 序列等。目的：檢測目的的轉錄產物 mRNA 的水平原理：提取組織或細胞中的總 RNA，以其中的 mRNA 作為模板，采用 Oligo(dT)或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成 cDNA。再以 cDNA 為模板進行 PCR 擴增，從而獲得目的因的表達?；驒z測基步驟：1. 總 RNA 的提取（以細胞為

41、例）1.1 棄去培液，PBS 洗 2 遍，加入 1ml Trizol，輕輕吹打，直至細胞脫落，吸入 1.5 ml EP 管內，靜置 5 min。（Trizol 量根據細胞密度可適當調整，建議：6 孔板細胞長滿1ml Trizol）19 / 87技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號（201203）1.2 加入 200l 氯仿（三氯甲烷），用手劇烈震蕩 15 秒，室溫靜置 2-3 分鐘。（氯仿量為1/5 Trizol）1.3 12000g，4，離心 15min。1.4 仔細轉移上層水相到 1 個新 EP 管中，不能貪多，約 400-500l。1.5 加等體積異丙醇，輕

42、柔混合 45 次，室溫放置 10 分鐘。1.6 12000g，4，離心 10min。1.7 輕輕倒去上清，用 20 l 槍輕輕吸去殘液，沉淀用 1ml 75%乙醇（0.75ml 無水乙醇0.25ml DEPC 水，現配）洗 12 次，渦旋混勻。1.8 吸去上清，5-10 分鐘空氣干燥 RNA。（肉眼不能明顯看到水分即可）1.9 加 15-20l DEPC 水，吹打數次，測濃度。注釋：mRNA 不穩(wěn)定，很容易講解，因此 mRNA 提取過程中要盡量避免 RNA 酶污染。2.RT：（參照商品化試劑盒說明書）3.PCR：（參照商品化試劑盒說明書）4.電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果。5.密

43、度掃描、結果分析：采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對電泳條帶進行密度掃描。伯豪生物十一. 第二代 DNA技術概述：第一代（缺點：通量低 1000 個核苷酸/反應，費用高） 化學降解法雙脫氧鏈終止法（Sanger 法）高通量熒光自動技術雜交技術：（next-generation sequencing，NGS）第二代第二代技術的思想是邊邊(Sequencing by Synthesis)，即通過捕捉新的末端的標記來確定 DNA 的序列， 現有的技術平臺主要包括 Roche/454 FLX 、Illumina/Solexa Genome Analyzer 和 Applied Biosystems SOLID

44、system。這三個技術平臺各有優(yōu)點，454 FLX 的片段比較長，高質量的讀長(read)能達到 400bp；Solexa性價比最高，不僅的售價比其他兩種低，而且運行成本也低，在數據量相同的情況下，成20 / 87技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號（201203）本只有 454的 1/10；SOLID的準確度高，原始堿基數據的準確度大于 99.94%，而在 15X 覆蓋率時的準確度可以達到 99.999%，是目前第二代技術中準確度最高的。雖然第二代技術的工作一般都由專業(yè)的商業(yè)公司來完成，但是了解原理、操作流程等會對后續(xù)的數據分析有很重要的作用，下文將以Illu

45、mina/Solexa Genome Analyzer為例，簡述第二代技術的基本原理、操作流程等方面。原理：Illumina/Solexa Genome Analyzer的基本原理是邊邊。在 Sanger 等方法的基礎上，通過技術創(chuàng)新，用不同顏色的熒光標記四種不同的 dNTP，當 DNA 聚合酶合成互補鏈時，每添加一種 dNTP 就會出不同的熒光，根據捕捉的熒光信號并經過特定的計算機軟件處理，從而獲得待測 DNA 的序列信息。Illumina Solexa儀特點：橋式PCR邊邊可逆終止物伯豪生物Illumina Solexa流程：操作步驟：1)文庫的構建(Library Constructio

46、n)21 / 87技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號（201203）組 DNA(雖然公司要求樣品量要達到 200ng，但是 Gnome Analyzer 系統(tǒng)首先準備所需的樣品量可低至 100ng，能應用在很多樣品有限的實驗中)，然后將 DNA 隨機片段化成幾百堿基或更短的小片段，并在兩頭加上特定的接頭(Adaptor)。如果是轉錄組，則文庫的構建要相對麻煩些，RN段化之后需反轉成 cDNA，然后加上接頭，或者先將RNA 反轉成 cDNA，然后再片段化并加上接頭。片段的大小(Insert size)對于后面的數據分析有影響，可根據需要來選擇。對于組來說，通常會選

47、擇幾種不同的 insert size，以便在組裝(Assembly)的時候獲得的信息。2)錨定橋接(Surface Attachment and Bridge Amplification)Solexa的反應在叫做 flow cell 的管中進行，flow cell 又被細分成 8 個 Lane，每個Lane 的內表面有無數的被固定的單頭。上述步驟得到的帶接頭的 DN段變性成單鏈后與通道上的接頭引物結合形成橋狀結構，以供后續(xù)的預擴增使用。3)預擴增(Denaturation and Complete Amplification)添加未標記的dNTP 和普通 Taq 酶進行固相橋式PCR 擴增，單

48、鏈橋型待測片段被擴增成為雙鏈橋型片段。通過變性，出互補的單鏈，錨定到附近的固相表面。通過不斷循環(huán)，將會在 Flow cell 的固相表面上獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測片段。伯豪生物4)單堿基延伸(Single Base Extension and Sequencing)在的 flow cell 中加入四種熒光標記的 dNTP 、DNA 聚合酶以及接頭引物進行擴增，在每一個簇延伸互補鏈時，每加入一個被熒光標記的 dNTP 就能出相對應的熒光，儀通過捕獲熒光信號，并通過計算機軟件將光信號轉化為峰，從而獲得待測片段的序列信息。從熒光信號獲取待測片段的序列信息的過程叫做 Base Calling，I

49、llumina 公司Base Calling 所用的軟件是 Illumina's Genome Analyzer Sequencing Control Software and Pipeline Analysis Software。讀長會受到多個引起信號衰減的因素所影響，如熒光標記的不完全切割。隨著讀長的增加，錯誤率也會隨之上升。5)數據分析(Data Analyzing)這一步嚴格來講不能算作操作流程的一部分，但是只有通過這一步，前面的工作才顯得有意義。得到的原始數據是長度只有幾十個堿基的序列，要通過生物信息學工具將這些短的序列組裝成長的 Contigs 甚至是整個組的框架，或者把這

50、些序列比對到已有的組或者相近物種組序列上，并進一步分析得到有生物學意義的結果。22 / 87技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號（201203）十二.概述：（又稱 DNA、生物）技術系指將大量（通常每平方厘米點陣密度高于400 ）探針固定于支持物上后與標記的樣品進行雜交，通過檢測每個探針的雜交信號強度進而獲取樣品的數量和序列信息。通俗地說，就是通過微技術 ，將伯豪生物數以萬計、乃至百萬計的特定序列的 DN段（探針），有規(guī)律地排列固定于 2cm2的硅片、玻片 等支持物上的一個二維 DNA 探針陣列，與計算機的電子十分相似，所以被稱為。主要用于檢測工作 。目前主要被應

51、用的表達是美國昂飛公司和安捷倫兩家公司的。美國Affymetrix 公司開發(fā)了世界上最第一款商業(yè)化，其發(fā)明的寡核苷酸原位光刻專利技術（light-controlled in situ synthesisof DNA microarrays）可在每 cm²片基上超過 400 萬條探針，是世界上最高密度的探針技術。將片基羥基化保護后，通過光刻掩膜（photolithographic mask）的覆蓋調控激光對片基的照射，從而促使相應片基部位脫羥基而活化。進而，與后續(xù)加入的 3端活化(5羥基末端連接光敏保護基團)單一核苷酸單體底物發(fā)生循環(huán)偶聯反應，而實現原位寡核苷酸的。待檢測樣本利用體外轉

52、錄的方式進行擴增和生物素標記，標記后雜交、洗滌、染色、掃描獲得原始圖像文件安捷倫的制造工藝為享有專利的噴墨打印化學原位技術（ink-jet chemicalinsitusynthesis）。非接觸式的探針技術保證了每一個探針樣點的制作準確度，精度的高度均一化，極大地減少了間的差異和實驗可以完整準確的60mer 的長寡核苷酸探針，極大地提高了檢測的靈敏度，并且使的設計和生產具有無與倫比的靈活應用特性。23 / 87技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號（201203）目的：功能的研究。通過可以大規(guī)模，高通量地對成千上萬個同時進行表達豐度檢測。原理：的原理是利用堿基互補雜交，即以熒光或生物素標記的樣品，借助堿基互補雜交原理，進行大量的表達研究。帶有熒光或生物素標記的目的片段與固定在片基上序列互補的探針雜交后，通過掃描儀獲得熒光或生物素信號強度，借以反應的表達豐度。伯豪生物的雜交原理圖的原理圖24 / 87技術服務Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號（201203）步驟：1. 樣品的準備： 總RNA 抽提、逆轉錄、體外轉錄、標記2. 雜交、掃描獲得信號強度。當前掃描儀主要是應用激光共聚焦顯微掃描技術，以便于對高密度探針