生物制藥工藝學(xué)習(xí)題 第七章 凝膠層析

1、第七章 凝膠層析一、填空題1、凝膠層析的分離原理有 、 、 。這三種分離原理是互相補(bǔ)充的，在通常情況下 起主導(dǎo)作用； 的作用隨流速增加而加強(qiáng)；只有在流速很高時(shí) 才起作用。2、瓊脂糖凝膠的一個(gè)特征是分離的分子量范圍非常大，其分離范圍隨著凝膠濃度上升而 ，顆粒強(qiáng)度隨濃度上升而 。3、凝膠粒度的大小對(duì)分離效果有直接的影響。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)粒凝膠柱流速低，洗脫峰窄，分辨率 ，多用于 等。粗粒凝膠柱流速高，洗脫峰平坦，分辨率 ，多用于 等。4、在作分級(jí)分離時(shí)，為了提高分辨率，多采用比樣品體積大 倍以上的柱體積， 以上的柱比，較 吸液量、較 粒的凝膠固定相。5、溶質(zhì)通過(guò)色譜柱時(shí)造成的峰加寬效應(yīng)包括 、 、 、

2、 。6、葡聚糖凝膠的孔徑大小取決于 ，其越小，凝膠孔徑 越 ；而瓊脂糖凝膠的孔徑卻依賴(lài)于 。二、選擇題1、凝膠層析中，有時(shí)溶質(zhì)的Kd>1，其原因是 （ ）A.凝膠排斥 B.凝膠吸附 C.柱床過(guò)長(zhǎng) D.流速過(guò)低2、凝膠層析中，有時(shí)小分子溶質(zhì)的Kd<1，其原因是 （ ）A.水合作用 B.凝膠吸附 C.柱床過(guò)長(zhǎng) D.流速過(guò)低3、在凝膠層析中樣品各組分最先淋出的是 （ ）A.分子量最大的 B.體積最大的 C.分子量最小的 D.體積最小的4、為了進(jìn)一步檢查凝膠柱的質(zhì)量，通常用一種大分子的有色物質(zhì)溶液過(guò)柱，常見(jiàn)的檢查物質(zhì)為藍(lán)色葡聚糖，下面不屬于它的作用的是 （ ）A.觀察柱床有無(wú)溝流 B.觀察

3、色帶是否平整C.測(cè)量流速 D.測(cè)量層析柱的外水體積5、在選用凝膠層析柱時(shí)，為了提高分辨率，宜選用的層析柱是 （ ）A.粗且長(zhǎng)的 B.粗且短的 C.細(xì)且長(zhǎng)的 D.細(xì)且短的三、名詞解釋1、全排阻： 2、類(lèi)分離：3、分級(jí)分離： 4、柱比： 5、操作壓： 6、全滲入： 7、分離度Rs： 四、問(wèn)答題1、試述公式Ve=V0+KdVi 各字母的物理意義。2、利用凝膠層析如何測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量？ 3、凝膠層析的應(yīng)用主要有哪些？并說(shuō)明其原理。第七章 凝膠層析（答案）一、填空題1、凝膠層析的分離原理有平衡排除理論、擴(kuò)散分離理論、流動(dòng)分離理論。這三種分離原理是互相補(bǔ)充的，在通常情況下平衡排除理論起主導(dǎo)作用；擴(kuò)散分離

4、理論的作用隨流速增加而加強(qiáng)；只有在流速很高時(shí)流動(dòng)分離理論才起作用。2、瓊脂糖凝膠的一個(gè)特征是分離的分子量范圍非常大，其分離范圍隨著凝膠濃度上升而 下降 ，顆粒強(qiáng)度隨濃度上升而 提高 。3、凝膠粒度的大小對(duì)分離效果有直接的影響。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)粒凝膠柱流速低，洗脫峰窄，分辨率 高 ，多用于 精制分離 等。粗粒凝膠柱流速高，洗脫峰平坦，分辨率 低 ，多用于脫鹽等。4、在作分級(jí)分離時(shí)，為了提高分辨率，多采用比樣品體積大 25 倍以上的柱體積， 25 以上的柱比，較 大 吸液量、較 細(xì) 粒的凝膠固定相。5、溶質(zhì)通過(guò)色譜柱時(shí)造成的峰加寬效應(yīng)包括 分子擴(kuò)散 、渦流擴(kuò)散 、 流動(dòng)相中傳質(zhì)阻力 、 固定相中傳質(zhì)阻

5、力。6、葡聚糖凝膠的孔徑大小取決于 交聯(lián)度 ，其越小，凝膠孔徑 越 大 ；而瓊脂糖凝膠的孔徑卻依賴(lài)于 瓊脂糖濃度 。二、選擇題1、凝膠層析中，有時(shí)溶質(zhì)的Kd>1，其原因是 （ B ）A.凝膠排斥 B.凝膠吸附 C.柱床過(guò)長(zhǎng) D.流速過(guò)低2、凝膠層析中，有時(shí)小分子溶質(zhì)的Kd<1，其原因是 （ A）A.水合作用 B.凝膠吸附 C.柱床過(guò)長(zhǎng) D.流速過(guò)低3、在凝膠層析中樣品各組分最先淋出的是 （ B）A.分子量最大的 B.體積最大的 C.分子量最小的 D.體積最小的4、為了進(jìn)一步檢查凝膠柱的質(zhì)量，通常用一種大分子的有色物質(zhì)溶液過(guò)柱，常見(jiàn)的檢查物質(zhì)為藍(lán)色葡聚糖，下面不屬于它的作用的是 （C

6、）A.觀察柱床有無(wú)溝流 B.觀察色帶是否平整C.測(cè)量流速 D.測(cè)量層析柱的外水體積5、在選用凝膠層析柱時(shí)，為了提高分辨率，宜選用的層析柱是 （A）A.粗且長(zhǎng)的 B.粗且短的 C.細(xì)且長(zhǎng)的 D.細(xì)且短的三、名詞解釋1、全排阻： 當(dāng)具有一定分子量分布的高聚物溶液從柱中通過(guò)時(shí)，較大的分子完全不能進(jìn)入顆粒內(nèi)部，只能從顆粒間隙流過(guò)，稱(chēng)“全排阻”。其流經(jīng)體積最小，等于外水體積V0。2、類(lèi)分離：將分子量極為懸殊的兩類(lèi)物質(zhì)分開(kāi)，如蛋白質(zhì)與鹽類(lèi)，稱(chēng)作類(lèi)分離或組分離.選擇凝膠時(shí)，應(yīng)使樣品中大分子組的分子量大于其排阻限，而小分子組的分子量小于滲入限。大分子的分配系數(shù)Kd=0，小分子的Kd=1。3、分級(jí)分離：將分子量

7、相差不大的大分子物質(zhì)加以分離，如分離血清球蛋白與白蛋白，分級(jí)分離應(yīng)盡量使待分離各物質(zhì)的Kd值相差大些，并使分子量分布不在凝膠分離范圍的一側(cè)。4、柱比：層析柱的長(zhǎng)度與直徑的比值一般稱(chēng)作“柱比”。5、操作壓：凝膠層析柱由于進(jìn)出口之間液位壓力差形成的對(duì)凝膠顆粒的壓力稱(chēng)作“操作壓”。6、全滲入：被分離組分的分子量小于該種凝膠的滲入限，其分子可以自由進(jìn)出凝膠顆粒，這叫做“全滲入”。 其流經(jīng)體積最大，等于外水體積與內(nèi)水體積之和，V0 Vi。7、分離度Rs： 式中 Ve1、Ve2對(duì)應(yīng)于兩個(gè)峰的淋出體積；W1、W2和1、2兩個(gè)峰寬度和標(biāo)準(zhǔn)偏差。四、問(wèn)答題1、試述公式Ve=V0+KdVi 各字母的物理意義。答：

8、公式Ve=V0+KdVi中Ve代表被分離組分的流經(jīng)體積，V0代表外水體積，Vi代表內(nèi)水體積。Kd稱(chēng)作“排阻系數(shù)” 或“分配系數(shù)”， 它反映了物質(zhì)分子進(jìn)入凝膠顆粒的程度。對(duì)一定種類(lèi)規(guī)格的凝膠，物質(zhì)的Kd值為該物質(zhì)的特征常數(shù)。排阻系數(shù)： 當(dāng)Kd=1時(shí)，洗脫體積Ve=V0+Vi，為全滲入。當(dāng)Kd=0時(shí)，洗脫體積Ve=V0，為全排阻。0Kd1時(shí)，洗脫體積Ve=Vo+KdVi，為部分滲入。2、利用凝膠層析如何測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量？ 答：當(dāng)具有一定分子量分布的高聚物溶液從柱中通過(guò)時(shí)，較小的分子在柱中停留時(shí)間比大分子停留的時(shí)間要長(zhǎng)，于是樣品各組分即按分子大小順序而分開(kāi)，最先淋出的是最大的分子（2分）。對(duì)于一個(gè)

9、特定體系（凝膠柱），待測(cè)定物質(zhì)的洗脫體積與分子量的關(guān)系符合公式Ve=-KlogM +C先以3個(gè)以上（最好更多些）的已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白過(guò)柱，測(cè)取各自的Ve值。以Ve作縱坐標(biāo)，logM作橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（2分）。在同一測(cè)定系統(tǒng)中測(cè)取未知物質(zhì)的Ve值便可由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得分子量（2分）。3、凝膠層析的應(yīng)用主要有哪些？并說(shuō)明其原理。當(dāng)具有一定分子量分布的高聚物溶液從柱中通過(guò)時(shí)，較小的分子在柱中停留時(shí)間比大分子停留的時(shí)間要長(zhǎng)，于是樣品各組分即按分子大小順序而分開(kāi)，最先淋出的是最大的分子（2分）。應(yīng)用：一、脫鹽：脫鹽用的凝膠多為大粒度的，高交聯(lián)度的凝膠。此時(shí)溶液中蛋白質(zhì)等大分子的Kd=0，鹽類(lèi)的Kd=1。由于交聯(lián)度大，凝膠顆粒的強(qiáng)度較好，加之凝膠粒度大，柱層操作比較便利，流速也高。二、分子量測(cè)定：對(duì)于一個(gè)特定體系（凝膠柱），待測(cè)定物質(zhì)的洗脫體積與分子量的