琥珀酸脫氫酶的提取與活力測定的研究進(jìn)展

1、琥珀酸脫氫酶的提取與活力測定的研究進(jìn)展    【摘要】  琥珀酸脫氫酶是線粒體的一種標(biāo)志酶，是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一，可為真核細(xì)胞線粒體和多種原核細(xì)胞需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子，其活性一般可作為評價(jià)三羧酸循環(huán)運(yùn)行程度的指標(biāo)。本文從琥珀酸脫氫酶的提取、純化及活性檢測方法等幾方面介紹了琥珀酸脫氫酶的研究進(jìn)展情況。 【關(guān)鍵詞】  琥珀酸脫氫酶 線粒體 三羧酸循環(huán) 琥珀酸脫氫酶（Succinate dehydrogenase，簡稱SDH），黃素酶類，是線粒體內(nèi)膜的結(jié)合酶，屬膜結(jié)合酶，是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一，

2、可為真核細(xì)胞線粒體和多種原核細(xì)胞需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子，為線粒體的一種標(biāo)志酶。作為參與三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，琥珀酸脫氫酶是反映線粒體功能的標(biāo)志酶（marker enzyme）之一，其活性一般可作為評價(jià)三羧酸循環(huán)運(yùn)行程度的指標(biāo)1，對于評價(jià)精子線粒體功能、研究致奶牛酮缺乏癥病理過程等具有重要意義23。    本文從琥珀酸脫氫酶的提取、純化、性質(zhì)及其測定方法等幾方面回顧并介紹了琥珀酸脫氫酶的研究進(jìn)展情況。    1  琥珀酸脫氫酶的提取與生理意義    琥珀酸脫氫酶存在于所有有氧呼吸細(xì)胞，和線粒體膜

3、牢固結(jié)合，是三羧酸循環(huán)中唯一與內(nèi)膜結(jié)合的酶，是脫氫酶中最重要的酶。迄今為止，已從多種原核和真核組織中分離純化出這種酶，為該酶的酶學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。作為膜內(nèi)酶，琥珀酸脫氫酶與具有脂雙層結(jié)構(gòu)的線粒體膜結(jié)合得比較緊密，很難溶解下來，而且其一旦離開膜后，暴露在空氣中會很快失活，因此其提純難度很大。1950年我國著名生物化學(xué)家王應(yīng)睞、鄒承魯、汪靜英等開展對膜蛋白琥珀酸脫氫酶的研究，經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)最后以正丁醇抽提法成功地把琥珀酸脫氫酶從鼠肝組織線粒體膜上溶解下來，得到了高純度的水溶性琥珀酸脫氫酶，其活力比同期國外報(bào)道者高出1倍以上，從而奠定了我國在琥珀酸脫氫酶研究領(lǐng)域的領(lǐng)先地位4。其后，Davis等（197

4、1、1977）使用NaClO4從牛心線粒體溶解下此酶56；Tsukaho Hattori和Tadashi Asahi（1982）選用離子型去垢劑脫氧膽酸鈉從番薯根線粒體提取SDH7；Suraveratum等（2000）對惡性瘧原蟲的琥珀酸脫氫酶進(jìn)行了純化8；夏玉鳳等（2000）以玉米黃化苗為生物材料，通過差速離心獲得線粒體，使用超聲波將其破碎，用2%Triton X-100溶膜，超速離心，硫酸銨沉淀，DEAE-C32層析純化琥珀酸脫氫酶9；辛明秀等（2004）用常規(guī)酶學(xué)方法從嗜冷酵母（Y18）中分離純化出有催化活性的琥珀酸脫氫酶10。    琥珀酸脫氫酶是直接連在

5、電子傳遞鏈上的，氫受體是FAD而不是NAD，它使琥珀酸氧化為延胡索酸過程中所產(chǎn)生的FADH2與酶結(jié)合，將來自FADH2的兩個(gè)電子直接傳遞給酶的Fe31112?，F(xiàn)有研究表明，琥珀酸脫氫酶由、兩個(gè)亞基組成，亞基相對分子質(zhì)量為70.0×103，含有FAD和兩個(gè)鐵硫簇；亞基相對分子質(zhì)量為27.0×103，含有一個(gè)鐵硫簇1314。    2  琥珀酸脫氫酶的常用測定方法    琥珀酸脫氫酶活力測定方法目前主要有五種。    2.1  硫酸甲酯吩嗪（PMS）反應(yīng)法1516

6、60; 琥珀酸脫氫酶能通過一系列人工電子受體，如與PMS（吩嗪二甲酯硫酸鹽），DCPIP（2，6-二氯酚靛酚）等發(fā)生反應(yīng)催化琥珀酸的氧化，而借助這些中間產(chǎn)物的顏色變化，通過分光光度計(jì)檢測即可加以定量反映，其反應(yīng)式為：SuccinatePMSFumaratePMSH2；PMSH2DCPIPPMSDCPIPH2。DCPIP呈藍(lán)色，標(biāo)準(zhǔn)的吸收光譜在600nm處，這種色澤可因其還原而漸次變淡，從而600nm處的光密度的變化與DCPIP含量成正比，測定2.6-DPIP的還原速度可以推算出SDH的活力。一分子DCPIP被還原，即代表一分子琥珀酸被氧化。故可測定此反應(yīng)系統(tǒng)在600nm處的吸收光度變化，來計(jì)算

7、SDH的活性。SDH活性計(jì)算：（標(biāo)準(zhǔn)測定）/標(biāo)準(zhǔn)=mol/min/mg。 &nbs     p;  2.2  鐵氰化鉀K3Fe（CN）6還原法  以鐵氰化鉀K3Fe（CN）6和琥珀酸鈉為底物，使琥珀酸脫氫酶催化反應(yīng)將鐵氰化鉀還原為亞鐵氰化鉀K4Fe（CN）6，K4Fe（CN）6再與Fe3作用生成普魯士藍(lán)，在700nm波長測定吸光值，以檢測普魯士藍(lán)之生成量，作為琥珀酸脫氫酶的還原力，吸光值愈高表示琥珀酸脫氫酶活力愈強(qiáng)。    2.3  TTC（氯化三苯四氮唑）法

8、0; 無色TTC（2，3，5-氯化三苯基四唑）作為人造受氫體，它在細(xì)胞呼吸過程中接受氫，還原成三苯基甲膳（TF）。后者以紅色晶體的形式存在于細(xì)胞內(nèi)，采用有機(jī)溶劑（如甲苯、乙酸乙醋、三氯甲烷、丙酮或乙醇等）進(jìn)行萃取。萃取液測定485nm吸光度后，以TTC還原量表示脫氫酶活性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TF生成量，進(jìn)而求出TTC-脫氫酶活性。論文出處(作者):    2.4  MTT法  MTT是一種黃顏色的染料?；罴?xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原MTT，同時(shí)在細(xì)胞色素C的作用下生成藍(lán)色（或藍(lán)紫色）不溶于水的甲臜（Formazana），經(jīng)異丙醇作用顆粒溶

9、解顯色。在通常情況下，甲臜生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比，因此可根據(jù)光密度570nm處OD值推測出活細(xì)胞的數(shù)目。    2.5  NBT（氯化硝基四氮唑藍(lán)）法17  NBT易溶于水，呈淡黃色，以NBT為受氫體，接受由琥珀酸鈉鹽被酶作用而脫下的氫，進(jìn)而形成紫藍(lán)色的沉淀，于反應(yīng)體系中加入PMS，混勻，37保溫30min，之后加入TCA終止反應(yīng)。加異丙醇溶解顯色，混勻，即可于548nm測OD值。規(guī)定：30min內(nèi)548nm下OD值為1.0時(shí)的酶量為1個(gè)活力單位。比活力=活力單位數(shù)/毫克蛋白?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 李勤報(bào)，梁厚果輕度水分脅迫的小麥幼苗中

10、與呼吸有關(guān)的幾種酶活性變化J植物生理學(xué)報(bào)，1988，14（3）：2172222 薛小萍，商學(xué)軍，傅健，等精子線粒體琥珀酸脫氫酶的檢測及意義J中華男科學(xué)，2003，9（8）：6016033 柴春彥，劉國艷，石發(fā)慶銅缺乏奶牛琥珀酸脫氫酶的組化特征J中國獸醫(yī)雜志，2002，38（2）：574 王應(yīng)睞同志生平介紹-李伯良同志在王應(yīng)睞教授遺體告別儀式上的悼詞R生命的化學(xué)，2001，21（3）：1761775 Davis K A,Hatefi Y.Succinate dehydrogenase 1 purification,molecular properties and substructureJBio

11、chemistry 1971，10（13）：250925166 Davis K A,Hatefi Y,Cravford I P.Purification,molecular properties and amino acid composition of the subunits of Rhodospirillom rubrum succinate dehydrogenaseJArchives of Biochemistry and Biophysics,1977，180：4594647 Tsukaho Hattori,Tadashia sahi.The presense ot two torms of succinate dehydrogenase in sweet potato root mitochondriaJPlant Cell Physiol,1982，23（3）：5155238 鄭春福惡性瘧原蟲琥珀酸脫氫酶的純化及其生化特征J國外醫(yī)學(xué)寄生蟲病分冊，2000，27（6）：2702719 夏