植物組織培養(yǎng)母液的配制與保存

1、植物組織培養(yǎng)母液的配制與保存目的 熟練掌握植物組織培養(yǎng)中各種成分或成分組的母液比需要量大假設干倍的配制方法。實驗儀器電子天平感量為0.0001g、一般天平感量為0.1g、燒杯100mL 50 mL 25mL、量筒1000 mL 100 mL 50 mL、容量瓶200 mL 100 mL 50 mL 25 mL、細口瓶500 mL 200 mL 100 mL 50 mL、藥勺、玻棒、電爐等。實驗試劑  按培養(yǎng)基配方準備實驗原理一培養(yǎng)基的組成 培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中的“血液，血液的成分及其供應狀況直接關系到培養(yǎng)物的生長與分化，因此了解培養(yǎng)基的成分、特點及其配制至關重要。自然狀態(tài)下生長的綠

2、色植物由于自身能進行光合作用，并且能合成植物生長發(fā)育所需的幾乎所有有機成分，加上土壤中含有較全面的無機和有機營養(yǎng)成分，所以只需在適當的時候施加少量的無機和有機肥復合成分，植物就可良好的生長。目前所使用的培養(yǎng)基有10余種之多，大局部都是在前人研究的根底上經過分析綜合和改進而成的。例如，White培養(yǎng)基是Uspenski和Uspenskaia1925的藻類培養(yǎng)基演化的結果，被廣泛用于根的培養(yǎng)；Cautheret培養(yǎng)基是建立在Knop營養(yǎng)液(1865)根底上的。以后的培養(yǎng)基大局部是在White和Cautheret培養(yǎng)基的根底上改進而成。 就目前所使用的各種培養(yǎng)基而言，可將它們的成分劃分為幾大類，常用

3、的有MS、 B5 、和White培養(yǎng)基等。 1水 水是植物原生質體的組成成分，也是一切代謝過程的介質和溶媒。配制培養(yǎng)基母液時要用蒸餾水，以保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性，防止儲藏過程發(fā)霉變質。大規(guī)模生產時可用自來水。但在少量研究上盡量用蒸餾水，以防成分的變化引起不良效果。   2無機營養(yǎng)成分：大量元素，主要包括氮、磷、鉀、鈣、鎂和硫六種微量元素：培養(yǎng)基的微量元素主要包括鐵Fe、錳Mn、銅Cu、鋅Zn、氯Cl、硼B(yǎng)和鉬Mo等。這些元素有的對生命活動的某個過程十分有用，有的對蛋白質或酶的生物活性十分重要，有的是參與某些生物過程的調節(jié)。 3. 有機營養(yǎng)成分包括維生素，氨基酸及其它有機物質等維

4、生素：硫氨素維生素B1鹽酸吡哆醇維生素B6和煙酸 在局部培養(yǎng)基中還添加維生素BX氨酰苯甲酸、維生素C抗壞血酸、維生素E生育酚、維生素H生物素、維生素B12氰鈷胺酸、維生素BC葉酸、維生素B2核黃素、泛酸鈣和氯化膽堿等維生素。氨基酸：甘氨酸氨基乙酸和肌醇環(huán)己六醇也是一些培養(yǎng)基的添加成分。其他：在某些植物或某些組織的培養(yǎng)中還加有水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰子汁、玉米胚乳、麥芽浸出物、西紅柿汁和酵母浸出物等。這些可能對某些植物或植物的某些代謝過程有重要作用，如肌醇主要以磷酸肌醇和磷脂酰肌醇的形式參與由Ca介導的信號轉導。  4. 碳水化合物 所有的植物組織培養(yǎng)基都需要有碳水化合物作為能源，用

5、作碳源的碳水化合物通常為蔗糖或D-葡萄糖，用量通常為2%-4%，高者可達5%，亦可用市售的白糖所代替，但一般應增加用量，而且最好用比較固定的廠家生產的產品，以保證實驗的穩(wěn)定性。  5. 植物生長調節(jié)物質常稱為激素：生長素類有：NAA萘乙酸、IAA吲哚乙酸、IBA吲哚丁酸、NOA萘氧乙酸，P-CPA對氯苯氧乙酸、2，4-D2，4-二氯苯氧乙酸，2，4，5-T2，4，5-三氯苯氧乙酸等；細胞分裂素類主要有：從甜玉米未成熟種子或其他植物中別離到的玉米素6-4-羥基-3-甲基-反式-2-丁烯氨基嘌呤。人工合成的細胞分裂素主要有沖動素KT，6-呋喃氨基嘌呤、 6-芐基腺嘌呤6-BA、2IP異戊

6、烯氨基嘌呤和TDZthidiazuron,噻二唑苯基脲等。細胞分裂素常常與生長素相互配合，用以調節(jié)細胞分裂，細胞伸長，細胞分化和器官形成；赤霉素：主要是GA3，雖然已經用于頂端分生組織的培養(yǎng)和維管分化的研究，但在培養(yǎng)基中很少添加，因為它的作用往往是負面的；乙烯等。 6. 瓊脂或其他支持物 除液體懸浮培養(yǎng)外，就目前情況而言，瓊脂是一種極為理想的支持物。一般濃度0.4%-1%，質量越差的瓊脂用量越大。  7. 其他添加劑含天然提取物、抗生素等  活性炭 滲透調節(jié)劑   抗生素 抗氧化劑等二培養(yǎng)基的選擇 選擇適宜的培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)成功的根底。選擇適宜的培養(yǎng)基主要從以

7、下兩個方面考慮：一是根本培養(yǎng)基；二是各種激素的濃度及相比照例。MS培養(yǎng)基適合于大多數雙子葉植物，B5和N6培養(yǎng)基適合與許多單子葉植物，特別是N6培養(yǎng)基對禾本科植物小麥、水稻等很有效，White培養(yǎng)基適合于根的培養(yǎng)。個人收集整理 勿做商業(yè)用途實驗內容與步驟一MS大量元素母液的配制 一般將大量元素分別配制成10倍的母液，使用時再分別稀釋10倍。依次分別稱?。?#160;     NH4NO3         16.5g                 KNO3

8、           19.0g             KH2PO4         1.70gMgSO4·7H2O     3.7g CaCl2·2H2O     4.4g共配成1L的母液。倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。二MS微量元素母液的配制 一般將微量元素配制成100倍母液。依次稱?。篕I             &#

9、160;   0.083g         Na2MoO4·2H2O       0.025gH3BO3             0.62g         CuSO4·5H2O         0.0025gMnSO4·H2O       1.69g          

10、; CoCl2·6H2O         0.0025gZnSO4·7H2O       0.86g配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由于稱取量很小，如果天平精確度沒有到達萬分之一，可先配成調整液。分別稱取CuSO4·5H2O         0.05g         CoCl2·6H2O     0.05g各

11、自配成100ml的調整液，然后取5ml就還有0.0025g的量。三MS有機質母液的配制      一般配制成100倍MS有機母液。依次稱取肌醇   10g         鹽酸硫胺素VB1 0.01g煙酸   0.05g       甘氨酸       0.2g鹽酸吡哆醇VB6     0.05g配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。四MS鐵鹽母液的配制 一般配制成100倍MS鐵鹽母液。依次稱?。篍DTA二鈉 3.73

12、g 和FeSO4·7H2O 2.78g，配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。  所以MS母液有5種大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有機母液和MS鐵鹽母液，共8種母液。五幾種生長調節(jié)物質的配制  各種生長素和細胞分裂素要單獨配制，不能混合在一起，生長素類一般要先用少量95%的酒精或1當量的NaOH溶解，細胞分裂素一般要先用1當量的鹽酸溶解，然后再加蒸餾水定容。一般取100mg配成100ml母液。  母液的保存：一般將以上配制好的各種母液保存在4左右冰箱內。文檔收集自網絡，僅用于個人學習本卷須知1.      

13、稱量要精確2.      配制母液時要注意藥品溶解的先后順序，以免發(fā)生化學反響，使的產生沉淀。附：MS培養(yǎng)基母液的配制與保存儀器與用具 1、儀器：各類天平、磁力攪拌器、冰箱等。 2、用具：燒杯、容量瓶、量筒、試劑瓶、標簽等。3、試劑：95%酒精，0.1-1 NaOH，0.1-1NHCl，配制MS培養(yǎng)基所需的各種無機物、有機物，蒸餾水。 方法步驟 一母液的配制 母液是欲配制培養(yǎng)基的濃縮液，一般配成比所需濃度高10100倍的溶液。 優(yōu)點：1保證各物質成分的準確性。         

14、0;   2便于配置時快速移取。            3便于低溫保藏。 1、MS大量元素母液10X 稱10升量溶解在1升蒸餾水中。配1升培養(yǎng)基取母液100ml。  化學藥品 1升量 10升量 NH4NO31650 mg/L165g KNO31900 mg/L190g CaCl2·2H2O 440 mg/L44g MgSO4·7H2O 370 mg/L37g KH2PO4170 mg/L17g2、MS微量元素母液10

15、0X 稱10升量溶解在100ml蒸餾水中。配1升培養(yǎng)基取母液10ml。  化學藥品 1升量 10升量 MnSO4·4H2O MnSO4·H2O 223 mg/L214 mg/L 223mg ZnSO4·7H2O 86 mg/L86mg CoCl2·6H2O 0025mg/L025mg CuSO4·5H2O 0025 mg/L025mg Na2MoO4·2H2O 025 mg/L25mg KI083 mg/L83 mg H3BO362 mg/L62 mg注意：CoCl2·6H2O和CuSO4·5H2O可按1

16、0倍量025 mgX10=25 mg或100倍量25 mg稱取后，定容于100ml水中，每次取10ml或1ml，即含025 mg的量，參加到母液中。 3、MS鐵鹽母液100X 稱10升量溶解在100ml蒸餾水中。配1升培養(yǎng)基取母液10ml。 化學藥品 1升量 10升量 Na2·EDTA 373 mg/L373 mgFeSO4·7H2O 278 mg/L278 mg 注意配制時，應將兩種成分分別溶解在少量蒸餾水中，其中EDTA鹽較難完全溶解，可適當加熱?；旌蠒r，先取一種置容量瓶燒杯中，然后將另一種成分逐加逐劇烈震蕩，至產生深黃色溶液，最后定容，保存在棕色試劑瓶中。 4、MS有

17、機物母液100X 稱10升量溶解在100ml蒸餾水中。配1升培養(yǎng)基取母液10ml。  化學藥品 1升量 10升量 煙酸 05 mg/L5mg 鹽酸吡哆素VB6 05 mg/L5mg 鹽酸硫胺素VB1    肌醇 100 mg/L1 g 甘氨酸 2 mg/L20mg5、生長調節(jié)劑 單獨配制，濃度為1-5 mg/ml書中為05 -1mg/ml，一般配成4 mg/ml 。 配制培養(yǎng)基母液時本卷須知：    一些離子易發(fā)生沉淀，可先用少量蒸餾水溶解，在按配方順序依次混合；    配制母液時必須用蒸餾水或重蒸餾水；

18、    藥品應用化學純或分析純；    溶解生長素時，可用少量05 1N的NaOH 或95%酒精溶解，溶解分裂素類用05 1N的HCl加熱溶解。 二母液的保存 1、裝瓶：將配制好的母液分別裝入試劑瓶中，貼好標簽，注明各培養(yǎng)基母液的名稱、濃縮倍數、日期。注意將易分解、氧化的溶液，放入棕色瓶中保存。 2、貯藏：4冰箱。 附：組織培養(yǎng)室操作程序一. 生產環(huán)境1. 工作人員進入組培室必須穿工作服，包括更換拖鞋、穿白大褂，接種人員還要帶帽、帶 口罩。2. 所有人員在組培室內不準高聲喧嘩、打鬧。3工作期間，各生產房間要關閉房門，尤其是接種間；工作

19、人員出入要隨手關門。4各種生產用品要安固定的位置排放整齊，不可亂拿亂放。5工作過程中所產生的垃圾要及時清理，尤其是接種間，其內垃圾停留時間不得超過4小時。 二. 接種程序1. 準備工作：接種人員在正式接種之前要做好準備工作，包括準備酒精燈、新潔爾滅、滅菌用脫脂棉以及準備接種工具、分取培養(yǎng)基、接種用苗和工作臺滅菌等。  ·酒精燈用工業(yè)酒精作燃料，而非75%酒精。  ·工作臺上用的新潔爾滅濃度是0.1%，而非0.01%。  ·工作臺滅菌包括兩步：一是上臺前用紫外燈照射30分鐘，二是正式接種前再用新潔

20、爾滅仔細擦一遍。  ·培養(yǎng)皿的取放：從布包里取培養(yǎng)皿時，一定要注意，手不能接觸培養(yǎng)皿的邊沿，同時要盡可能減少與培養(yǎng)皿的接觸面，一般規(guī)定只能用雙手的拇指和食指取放。   ·接種工具滅菌也分兩步，一是用滅菌布包裹好，在高壓鍋里滅一次，這一步由滅菌人員負責完成；二是在工作臺上，從布包里取出后，先用酒精擦拭一下，再放在酒精燈火焰上灼烤一遍，其要求是工具的每一點在火焰上灼烤時間不得少于5秒鐘。在工具滅菌之前，工作人員的手部，包括手腕，都要用酒精仔細擦拭一遍。  2接轉苗：包括取苗、切苗和接苗三步。  &#

21、183;取苗：先解開培養(yǎng)瓶的瓶蓋封口膜，如果不能一次取出其內的全部材料，要先把封口膜瓶蓋口對者風源放在酒精燈的左前方，然后把瓶口在酒精燈上烤710秒；正式取苗時，瓶口不要斜向外；一次取苗不可太多，以免風干。  ·切苗：培養(yǎng)皿放在離風窗1020厘米處，不可太往外；鑷子和手術刀都不可太熱，最好是涼的，且在操作過程中，刀和鑷都要培養(yǎng)皿斜上方操作，不可在其正上方操作；在切苗過程中產生的垃圾可堆放在培養(yǎng)皿內的一側位置上，假設非迫不得已，不可弄到培養(yǎng)皿外。  ·接苗：培養(yǎng)瓶蓋或封口膜的放置方法和及瓶口灼烤方法與取苗時的相同，烤完瓶口后，要先倒掉瓶內多余的水分，然后在接苗；接苗時，鑷子最好不要與瓶口接觸，一瓶內一般接56棵苗，不要放得太多；組培苗在瓶內要排放均勻、整齊、美觀。  ·封口、記錄：封口膜要及時捆綁，其松緊度以用手轉不動為準；下臺前要把品種代號、