地衣共生菌藻及分離與培養(yǎng)

1、地衣共生菌藻的分離與培養(yǎng)地衣是一種真菌，由地衣共生菌和一種藻類或藍(lán)細(xì)菌（藍(lán)藻）的共生而形成的聯(lián)合體，屬“二元”生物體。在這個(gè)二元共生聯(lián)合體中，真菌菌絲纏繞大量的光合細(xì)胞。在上述地衣的定義我們可以提出這樣的一個(gè)問題：地衣是否可分為單個(gè)生物體？地衣生物學(xué)研究的許多方面均涉及到這些不同有機(jī)組織的相互作用。對于共生體的分離和培養(yǎng)研究，為科學(xué)家對于地衣共生關(guān)系本質(zhì)的探討提供了迷人的前景。該研究的中心問題是地衣光合共生物以及地衣共生菌的培養(yǎng)，這也是解決地衣生理、形態(tài)、發(fā)育和分子生物學(xué)等方面研究的根本問題。 地衣共生體的培養(yǎng)曾經(jīng)被認(rèn)為難以進(jìn)行，這主要是因?yàn)檫@是一項(xiàng)很耗時(shí)的工作，而且共生體的培養(yǎng)是否成功需要長

2、期的技術(shù)探索。然而，Ahmadjian（1967b）突破性的研究引起了許多地衣學(xué)者對共生菌藻培養(yǎng)的興趣。在過去的二三十年間，關(guān)于地衣共生菌藻的研究和地衣的人工重建已取得了相當(dāng)?shù)某删?，如圖一所示，地衣共生菌藻培養(yǎng)可以通過各種不同的方法而實(shí)現(xiàn)。地衣共生體的培養(yǎng)很難，即使用具富營養(yǎng)的培養(yǎng)基。主要是因?yàn)楣采纳L遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于共生藻或藍(lán)細(xì)菌。此外，霉菌、酵母菌和細(xì)菌等的污染也是很重要的因素。因此在所有的操作過程中要進(jìn)行無菌操作以防污染。本章的目的在于講述從地衣中分離出共生菌藻并進(jìn)行培養(yǎng)的方案。子方案I講述了地衣共生菌培養(yǎng)的各種方法。子方案II講述了地衣共生藻培養(yǎng)的各種技術(shù)。這些培養(yǎng)技術(shù)已有報(bào)道，但我們在此

3、研究的基礎(chǔ)上又添加了一些新的內(nèi)容。關(guān)于共生體的分離技術(shù)已有Ahmadjian（1967a,b）和Galum（1988）全面的描述了。子方案I 共生菌的培養(yǎng)注意：除了每一個(gè)清洗步驟，所有的操作都應(yīng)在超凈工作臺(tái)上或無菌的條件下進(jìn)行。所有的儀器在用之前都應(yīng)高壓滅菌（1520分鐘，121，1 atm）或干熱滅菌（30分鐘，180）。一、儀器與材料儀器：顯微鏡、解剖鏡、相差顯微鏡、高壓滅菌鍋、培養(yǎng)箱、超聲波發(fā)生機(jī)、離心機(jī)、超凈工作臺(tái)或無菌工作室。真菌來源：我們建議所用的地衣應(yīng)為野外新采集的而且在一周內(nèi)利用。然而地衣也可以在干燥狀態(tài)下保存幾周，或在冰箱內(nèi)存放幾年（Yoshimura et al. 1990

4、)。共生菌可以從子囊孢子、分生孢子、裂芽、粉芽和菌體碎片中分離出來（Ahmadjian 1993）。用來實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)最常見的共生菌分離方法是：孢子釋放法，主要是子囊孢子。獲得共生菌藻的另一個(gè)方法是解剖菌體切片，這樣會(huì)形成大量較純的共生菌，在第二章我們將詳細(xì)介紹從菌體碎片中獲得共生菌和藻的方法。保存在Akita profectue University和Kochigakuen college的培養(yǎng)真菌可見表1。（P713）。真菌培養(yǎng)基： Ahmadjian（1993）和Pyatt（1973）建議用來孢子收集和萌發(fā)的培養(yǎng)基應(yīng)含營養(yǎng)量低。可在15黑暗條件下，采用含水4%的瓊脂培養(yǎng)基以取得了較好的效果。

5、這類共生菌的培養(yǎng)基如下：WA4培養(yǎng)基含4%蒸餾水的瓊脂培養(yǎng)基瓊脂 4克 蒸餾水補(bǔ)足100ml MY培養(yǎng)基麥芽酵母提取物培養(yǎng)基（ahmadjian 1967 a）麥芽提取物 20克 酵母提取物 2克瓊脂 20克 蒸餾水 蒸餾水補(bǔ)足1000mlLB培養(yǎng)基Lilly and Barnett s培養(yǎng)基（Lilly和Barnett 1951） 葡萄糖 10.0克 天冬酰胺酸（Asparagine) 2.0克KH2PO4 1.0克 MgSO47H2O 0.5克Fe（NO3)39H2O 0.2 mg ZnSO47H2O 0.2mgMnSO44H2O 0.1mg 維生素B1（Thiamine) 0.1mg維生

6、素H（Biotin) 5ug 蒸餾水補(bǔ)足 100ml可以在以上組分上加入1520g的瓊脂，并補(bǔ)足 1000ml，并制成固體培養(yǎng)基。LBG 培養(yǎng)基Lilly and BarnettsGelrite 培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基中以1%的w/v Gelrite 代替瓊脂。注意：在利用和倒入皮氏培養(yǎng)皿（5mm）或試管（5ml）之前，應(yīng)將所有培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌。二、實(shí)驗(yàn)步驟 （一）通過孢子分離出共生菌孢子釋放： 1.把野外采集的地衣體洗凈，放置幾天使其于周圍環(huán)境達(dá)到水分平衡。也可以將材料清洗和冷凍，在用之前平衡幾個(gè)小時(shí)。2.從地衣體上取下子囊盤或子囊殼，并將其在放有蒸餾水的培養(yǎng)皿中浸泡4小時(shí)或在流動(dòng)水中清洗。通過擠壓

7、去除多余的水分。3.將其用凡士林固定在皮氏皿底部，然后用含水4%的瓊脂培養(yǎng)基蓋在培養(yǎng)皿上部，將培養(yǎng)基放在培養(yǎng)皿的上面蓋上，并防止瓊脂污染。4.確保瓊脂在孢子的釋放范圍之內(nèi)（大約510mm），釋放的孢子會(huì)單個(gè)或成團(tuán)的附著的瓊脂的表面。如果要進(jìn)行單孢子分離可以通過減少孢子的釋放時(shí)間或增加子囊果同瓊脂之間的距離；否則會(huì)得到的是孢子團(tuán)。在適當(dāng)?shù)拈g隔（依據(jù)于釋放時(shí)間，通常一天）多次的旋轉(zhuǎn)瓊脂層。另外在潮濕的環(huán)境中也可以釋放到玻璃片上或無菌的薄膜上，然后用蒸餾水將孢子沖下，立即轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上。5.用超薄膜將皮氏皿封口，在培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，條件為無光、15。6.為了檢驗(yàn)孢子萌發(fā)情況，可以在相差顯微鏡下，觀察

8、孢子的釋放情況。將釋放的孢子轉(zhuǎn)移到含有瓊脂培養(yǎng)基的玻片上進(jìn)行觀察。保持皮氏培養(yǎng)皿玻片的潮濕，并連續(xù)觀察?？梢栽谒谢蛲ㄟ^染色法（lactic-glycerol-cotton blue）觀察孢子的萌發(fā)和菌絲體的生長情況。孢子萌發(fā)和菌絲體生長：有些地衣的孢子會(huì)在散出后的一天內(nèi)萌發(fā)。萌發(fā)后，將含有孢子的瓊脂小塊切下并轉(zhuǎn)移到含有營養(yǎng)培養(yǎng)基的皮氏培養(yǎng)皿或試管中。最常用的培養(yǎng)基為麥芽酵母提取物培養(yǎng)基MY培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基。（二) 從地衣體中分離出共生菌。由于有些地衣不產(chǎn)生子囊盤或成熟孢子，或者孢子萌發(fā)率低，這時(shí)候分離共生菌可用另外一個(gè)材料來源，如分生孢子（Vobis 1997）或粉芽（Honegger a

9、nd Bartnicki-Garcia1991；Hovegger et al. 1993)。由于裂芽經(jīng)常被一些附生的微生物所污染，故不常用來分離共生菌。Yamamoto et al（1985）已經(jīng)列出了采用地衣碎片分離出共生菌的方法。這可見于第二章。1.用消毒的刮胡刀將新鮮的地衣切成薄片，然后存放于不含營養(yǎng)僅含水的小試管中或放在15環(huán)境下的潮濕的濾紙片上。然后將沖洗后的地衣體碎片在研缽中磨碎并加水混勻成懸浮液。經(jīng)過濾后的濾液再經(jīng)過第二次過濾。從第二次過濾的濾紙上取出少部分接種至斜面培養(yǎng)基上。新的髓狀菌絲通常會(huì)在二三周后延長。采用無菌技術(shù)切取一部分新長出的菌絲，轉(zhuǎn)移到試管培養(yǎng)基上。我們發(fā)現(xiàn)這種方

10、法對于獲的鹿蕊（Cladia rangiferina）和大葉梅（Paramotrema tinctorum）的共生菌很適用。2.應(yīng)當(dāng)對此實(shí)驗(yàn)進(jìn)行多次重復(fù)，以保證生長的真菌最有可能為共生菌而不是生長于地衣體表面或內(nèi)部的其他真菌。（三）培養(yǎng)共生菌的保存共生菌可以存放很長時(shí)間 （大約一年左右）。但是，最好在兩三個(gè)月內(nèi)按如下步驟進(jìn)行一次繼代培養(yǎng)。利用解剖刀將培養(yǎng)的共生菌分為幾部分（通常為5mg）。將各個(gè)部分放在皮氏培養(yǎng)皿中的MY培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基中，在15無光條件下培養(yǎng)23個(gè)月。每2至3個(gè)月重復(fù)一次該步驟。通常共生菌在1520時(shí)表現(xiàn)出最大生長率。在共生菌的培養(yǎng)中，培養(yǎng)基的pH值對群體生長有著重要的影響

11、。每種共生菌均有其最適生長pH值，通常pH范圍為56，太高或太低的pH均會(huì)阻礙其生長。在共生菌群體保存培養(yǎng)中，光并不是必須的。地衣共生菌可以在液氮中保存很長時(shí)間，仍具有活性。三、注釋1.孢子的釋放 對于許多地衣來說，在將子囊盤放在皮氏培養(yǎng)皿一天之內(nèi)就可觀察到孢子釋放。然而，有些地衣卻只有在二三周后才可觀察到孢子釋放表2（P18）。將子囊盤放在皮氏培養(yǎng)皿后，孢子第一次釋放時(shí)間變化很大。孢子釋放的時(shí)間主要取決于地衣種類以及子囊盤采集時(shí)發(fā)育和代謝狀況，以及采集后的地衣體處理和子囊果的年齡。同樣，孢子釋放的數(shù)目和釋放的持續(xù)時(shí)間也有很大的變化也取決以上因素。將其浸放水中約15分鐘至24小時(shí)，然后吸干并放

12、在潮濕空氣中（90%RH）慢慢變干，可以獲得最大孢子釋放量。許多地衣，如Porpidia albocaulescents， graphis cervina（Ahmadjian 1993），孢子在釋放后很容易分散開來落在瓊脂表面。這種情況下，很容易進(jìn)行單孢子培養(yǎng)。然而在毛根石耳（Umbiliacaria vellea)和其他一些種類中，孢子卻形成一個(gè)8孢或少于8孢的孢子團(tuán)，在這些種類中單孢子分離就有些難度。Ahmadjian（1993）提出了孢子進(jìn)一步分離的一些方法（如以下所要提到的微量吸管吸取法）。Yamamoto et al.（1998)發(fā)現(xiàn)許多地衣的孢子釋放情況受到采集季節(jié)、存放溫度和存放

13、時(shí)間的影響。通過對一些種類的實(shí)驗(yàn)可知，它們的孢子形成或多或少有著內(nèi)部的節(jié)奏。對一些溫帶地衣來說，春夏季是孢子釋放的最佳季節(jié)。但是，在加拿大采集的石耳屬（Umbilicaria)孢子卻在夏季很容易萌發(fā)。2.孢子萌發(fā)據(jù)Pyatt（1968）報(bào)道，有些孢子在釋放后的24小時(shí)內(nèi)很快就會(huì)萌發(fā)，而另外一些則需要花費(fèi)45天才能萌發(fā)。對于大多數(shù)地衣來說，孢子在釋放幾天后就會(huì)萌發(fā)。在我們實(shí)驗(yàn)中，孢子萌發(fā)期約為散發(fā)后121天（見表2)。有些孢子也許在釋放時(shí)就已萌發(fā)。Lawarey （1984）報(bào)道Cetraria ciliris的孢子在釋放后的六周后才萌發(fā)。Roussard（1969）和MathyHoder（19

14、78）稱許多孢子甚至在子囊內(nèi)就萌發(fā)了。通常，殼狀地衣的單細(xì)胞孢子比二孢子或多孢子萌發(fā)的要快。葉狀和枝狀地衣的孢子比殼狀地衣的孢子萌發(fā)的要慢。有多核的磚壁型多孢子或單孢子則需更長時(shí)間萌發(fā)。孢子的萌發(fā)受到培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)基初始pH值和培養(yǎng)溫度的影響。實(shí)驗(yàn)中大部分種類的孢子均在pH為6、溫度為15的普通瓊脂培養(yǎng)基上萌發(fā)。Letharia的孢子不能在瓊脂培養(yǎng)基上萌發(fā)，但可以在Gelrite 培養(yǎng)基上萌發(fā)。一些種類的孢子不能在麥芽酵母提取的培養(yǎng)基上萌發(fā)。許多Peltigera種類的孢子可以在添加了樹脂的培養(yǎng)基上萌發(fā)，因?yàn)闃渲梢晕找种奇咦用劝l(fā)的石炭酸（phenols）。3.培養(yǎng)基的改進(jìn)通過對氨基酸或其

15、他含氮類物質(zhì)形式存在的氮素利用的研究，所得出的結(jié)果各異，因而沒有一個(gè)統(tǒng)一的結(jié)論。添加大部分氨基酸會(huì)促進(jìn)共生菌的生長。只有半胱氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等，不會(huì)維持其生長。大部分己糖碳源也會(huì)促進(jìn)其生長。麥芽糖、甘露糖和乳糖也可以促進(jìn)其生長，而檸檬酸鹽、醋酸鹽、紅蘚醇（erythritol）、三糖類則是不理想的碳源（Ahmadjian 1967b；Hale 1983）。通過改變和改進(jìn)碳源和氮源均可改變共生菌絲的形態(tài)和生理特點(diǎn)。各種地衣共生菌對VB1，和維生素H均有一定需求，有些僅對其中一種有需求。4.過濾膜的應(yīng)用共生菌絲可直接接種到瓊脂培養(yǎng)基或?yàn)V膜上培養(yǎng)。過濾膜可用纖維素、醋酸和硝酸纖維脂類、

16、玻璃纖維制成（Oliver et al. 1989, Honegger and Kutasi 1990）。采用濾膜的優(yōu)點(diǎn)在于它可以容易的轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)基上。5.液體培養(yǎng)基的應(yīng)用若采用液體培養(yǎng)基進(jìn)行浸潤培養(yǎng)，需要經(jīng)常更換培養(yǎng)基（Honegger and Kutasi 1990, Honegger and Kutasi et al. 1993）。由于大部分分離單位易于形成較硬的、只有邊緣生長的生長不旺盛菌落，因此最好將材料定期用勻漿機(jī)研磨成均一的物質(zhì)（Honegger and Kutasi 1990, Armaleo 1991）。由于不同的種類在其營養(yǎng)需求上有各自不同的特點(diǎn)，因此，很難得到共生菌培養(yǎng)

17、的普通培養(yǎng)基（Bubrick 1988）。6.pH值和光的影響盡管培養(yǎng)基的pH值和光對共生菌形態(tài)和生理的影響很少受到注意，但其影響卻是很重要的。由于地衣共生菌是一種異養(yǎng)生物，故也許會(huì)被認(rèn)為對不同的輻射和光照時(shí)間沒有反應(yīng)。然而，光對非地衣真菌繁殖的影響比對其生長的影響更大。 子方案 II 共生藻的培養(yǎng)早期的學(xué)者將地衣成薄片放在有光并且潮濕的房間里，使潮濕和光照促使藻共生體的生長，并分離出共生體組織（Ahmadjian 1967b）。這是一種獲得光合藻最簡單的方法。Nakano（1987）改進(jìn)了該方法，并做了詳細(xì)的敘述。Nakano和他的合作者已經(jīng)從日本地衣中獲得了許多共生藻（Nakano 198

18、8,Takeshita et al. 1989）。注意：除了每一個(gè)清洗步驟，所有的操作都應(yīng)在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行或在無菌條件下進(jìn)行。用之前所有儀器均應(yīng)高壓滅菌或干熱滅菌。一、實(shí)驗(yàn)材料：顯微鏡、解剖鏡、高壓滅菌鍋、培養(yǎng)箱、超聲波發(fā)生器、離心機(jī)、超凈工作臺(tái)或無菌室、毛細(xì)管、微量吸管。特殊微量吸管的制作：（1）將一個(gè)內(nèi)徑為45mm，長為 20cm 玻璃管的中央加熱，從兩端向外拉伸使其從中間斷開（圖3）。（2）在吸管較寬的一端塞一個(gè)棉塞，并聯(lián)接一個(gè)長的橡皮管。（3）將微量吸管用鋁箔包住滅菌。在用之前，在超凈工作臺(tái)上加熱較窄的一端，用鑷子將其拉成一個(gè)毛細(xì)管。拉成的毛細(xì)管直徑應(yīng)為典型藻細(xì)胞直徑（約50-75m

19、）的幾倍。 二、共生藻的培養(yǎng)基：大多數(shù)藻類在培養(yǎng)基上易于生長。只有少數(shù)藻類對有機(jī)碳源或有機(jī)氮源有絕對的需求，一些綠藻在加有葡萄糖或蛋白胨的培養(yǎng)基上生長尤其快。培養(yǎng)共生藻的培養(yǎng)基如下；BBM培養(yǎng)基Bolds Basal Medium（Deason bold 1960；Bischoff Bold 1963）NaNO3 250mg KH2PO4 175mg K2HPO4 75mg MgSO4·7H2O 75mgCaCl2·2H2O 25mg NaCl 25 mEDTA 50mg KOH 31mg FeSO4·7H2O 4.98mg H3BO3 11.42mg ZnSO4

20、·7H2O 8.82mg MnCl2 1.44mgMoO3 0.71mg CuSO4·5H2O 1.57 mgCo（NO3)2·6H2O 0.49mg 加蒸餾水補(bǔ)足1000ml 可以在以上組份中加入1520g瓊脂，并蒸餾水補(bǔ)足1L制成固體培養(yǎng)基。3×N BBM培養(yǎng)基（Brown Bold 1964）是由BBM改進(jìn)的培養(yǎng)基，只是比BBM多了3倍的氮素。 同上一樣，只是NaNO3為750mg。如制成固體培養(yǎng)基，需在以上配方中加入1520g瓊脂，并蒸餾水補(bǔ)充1L。Trebouxia 有機(jī)營養(yǎng)培養(yǎng)基（Ahmadjian 1967a） 1×N BBM 9

21、70ml 葡萄糖 20 g 蛋白胨 10g以上組分中加入1520g瓊脂，加蒸餾水補(bǔ)足1000ml，可制成 固體培養(yǎng)基。MDM培養(yǎng)基：用以培養(yǎng)藍(lán)細(xì)菌，從而代替BBM培養(yǎng)基（Watanabe 1960）KNO31g MgSO4·7H2O 250mgK2HPO4 250mg NaCl 100mgCaCl2·2H2O 10mg 鐵溶液 1mlA5溶液 1ml 加1520g瓊脂，蒸餾水補(bǔ)足1000ml 鐵溶液制備：FeSO4 1g、蒸餾水500ml、濃硫酸 2滴 A5溶液制備：H3BO3 286mg、MnSO4·7H2O 250mg、 ZnSO422.2mg、CuSO4&#

22、183;5H2O7.9mg、Na2MoO4 2.1mg、蒸餾水 100ml 其他類培養(yǎng)基的報(bào)道，主要有：Kratz and Myers（1955），Stanier et al.（1971），Starr （1980），Nichol（1973），Allen（1968；1973），Archibald（1975；1977），Carr et al.（1973）也提出了其他的培養(yǎng)基。注意：在將培養(yǎng)基使用或倒入試管（5ml）或皮氏培養(yǎng)皿（5ml厚)之前應(yīng)進(jìn)行消毒。三、培養(yǎng)步驟：（一）前處理操作：1地衣體的清洗對于大型地衣（葉狀和枝狀）：從地衣體頂端切下約12，然后放在自來水中浸泡510分鐘，用畫筆刷在流動(dòng)的

23、自來水中清理地衣體表面，然后用無菌水沖洗。對于小型地衣：如果地衣體較?。ǘ鄽畹匾拢?，可將其放入裝有12 ml的無菌水和一滴吐溫20（Tween20）的小試管中。超聲波粉碎約3分鐘。離心（2000rpm）去除地衣體表面的附屬物。2地衣體勻漿液的制備除了每一個(gè)清洗步驟，所有的操作都應(yīng)在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，或無菌條件下操作。所有儀器均應(yīng)高壓滅菌（1520min，121，1atm）或干熱滅菌（30min，180）。用酸或清潔劑清洗臟的玻片，然后用蒸餾水沖洗。大型地衣（枝狀或葉狀）：（1）清洗之后，將地衣體放在一個(gè)無菌的載玻片上。（2）在解剖鏡下，利用針銼平的小刀仔細(xì)刮去地衣皮層。（3）在顯微鏡下，取下

24、藻層并轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的無菌的玻片上。（4）在無菌玻片上滴一滴無菌水，用另一個(gè)玻片把切取的的共生藻層蓋上，輕輕壓玻片，將地衣體磨成較小碎片。這樣，盡管仍有一些菌絲存在，但實(shí)際上共生藻就機(jī)械地同共生菌分離了。兩種共生體均懸浮在液體中。較小地衣體：清洗之后，將小部分地衣體放在無菌的載玻片之間，輕輕磨動(dòng)玻片。不像大型地衣的處理，由于小型地衣沒有去除表皮，故應(yīng)需較大的壓力。這樣會(huì)得到含有菌藻的懸濁液。也可以采用攪拌器或研缽弄碎較大片地衣。但是，攪拌器會(huì)使脆弱的細(xì)胞受到破壞，因此，應(yīng)采用較溫和的方法處理，如在兩玻片間輕輕磨動(dòng)。幾位學(xué)者發(fā)明了許多地衣沖洗的方法和一些最好設(shè)備的建議，如Ahmadjian（196

25、7a）發(fā)明的木板和Yoshimura et al.（1993）的小沖洗器、杯子和過濾器。對于藍(lán)細(xì)菌可采用冷凍切片機(jī)產(chǎn)生的切片（小于40m的厚度）進(jìn)行培養(yǎng)。（二）共生藻的分離：1在皮氏培養(yǎng)皿的固體瓊脂培養(yǎng)基上滴幾滴含有共生菌藻的懸濁液。綠藻要用1×N的NBBM培養(yǎng)基而藍(lán)細(xì)菌則用MDM 培養(yǎng)基。另外，也可以將含有共生菌藻的懸濁液噴到皮氏培養(yǎng)皿的瓊脂培養(yǎng)基上。2在15的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15天。通常培養(yǎng)應(yīng)保持在1520，光強(qiáng)為1027molm-2s-1（PPED，photosynthesis photon flux density）的條件下。培養(yǎng)基最初應(yīng)放于低光強(qiáng)下。3大約一月后（取決于共生藻種

26、類），瓊脂培養(yǎng)基上就會(huì)出現(xiàn)較少的共生藻群。如果之前地衣沖洗較徹底，培養(yǎng)基上應(yīng)生長出真正的共生藻。4確定分離的藻類是真正的共生藻有重要意義。一些絲質(zhì)藻的污染可能源于滲入碎片中菌體組織的單細(xì)胞。單細(xì)胞藻類污染可能源于細(xì)胞壁上留下的菌絲體片段。（三）無菌培養(yǎng)群體的獲得：生長在培養(yǎng)基上的藻類，有許多可能受到污染。為了獲得無菌共生藻的培養(yǎng)群體可采用以下方法。1直接法：可以在體視顯微鏡下將未受污染的群體選出來，并移植到適宜的固體培養(yǎng)基上。在試管或皮氏培養(yǎng)皿中的Trebouxia有機(jī)營養(yǎng)培養(yǎng)基（Ahmadjian 1967a）用于綠藻，含有1%葡萄糖的MDM培養(yǎng)基用于藍(lán)細(xì)菌（Watanabe 1960）。如

27、果未受污染就可獲得無菌培養(yǎng)群體。然而，共生藻群卻常常受到細(xì)菌、共生菌以及其它生物的污染。此時(shí)有必要用噴霧法和微量吸管吸法獲得真正無菌群體。2噴霧法：該技術(shù)由Wiedemen et al.（1964）提出，很適用于綠藻單細(xì)胞的分離。對于單細(xì)胞綠藻或無菌群體獲得很有用。（無細(xì)菌、酵母菌污染，也無附著在共生藻上的共生菌污染（見圖4）。具體步驟為：（1）從單細(xì)胞中獲得群體，然后從生長在瓊脂上的群體中選擇污染低（或未污染）的群體，并轉(zhuǎn)移到試管中1×N BBM的斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)幾周。（2）在10ml的離心管中加入1ml 蒸餾水和一滴Tween-20，將共生藻移入。（3）超聲波粉碎。這樣會(huì)使共生

28、藻群同附著在其細(xì)胞壁表面上的細(xì)菌和共生菌污染物分開。（4）將混合物離心可以將共生藻同其他物質(zhì)分離。（5）移去上清液，在離心剩下的共生藻細(xì)胞中加入1ml無菌水和Tween，重復(fù)以上操作約十次。（6）在離心管底部插入一個(gè)毛細(xì)管，并保持直立。（7）通過毛細(xì)管的小開口引出壓縮空氣，壓縮空氣穿過伸出離心管的毛細(xì)管。（8）藻培養(yǎng)液就會(huì)被沖出毛細(xì)管形成噴霧。（9）快速將含有培養(yǎng)基（通常為Trebouxia有機(jī)培養(yǎng)基）的皮氏皿通過噴霧，培養(yǎng)皿上就會(huì)附著一層藻細(xì)胞的懸濁液。（10）一周或二周后，將未污染的藻群體移到合適的培養(yǎng)基上。3微量吸管吸法：盡管該法不能用來分離長的絲質(zhì)藻，但卻是分離綠藻可靠的方法。 （1）

29、在每一個(gè)有五孔的載玻片滴加一滴無菌水或無菌培養(yǎng)基。從營養(yǎng)培養(yǎng)基上取下生長的藻類，將其放入玻片的第一個(gè)孔中。如果藻群體成團(tuán)狀，可以通過超聲波將其分開。（2）在體視顯微鏡下，用微量吸管吸取510個(gè)藻細(xì)胞。（3）擠壓微量吸管膠頭，將所吸細(xì)胞放入第二個(gè)孔中。（4）重復(fù)以上操作五次以上。微管的尖端應(yīng)進(jìn)行蒸汽滅菌，以防止污染。有時(shí)將藻細(xì)胞放入新的無菌水時(shí)會(huì)漂浮在表面，這樣就會(huì)很難吸取藻細(xì)胞。一般來說，大部分細(xì)胞會(huì)幾分鐘后沉入水中。（5）如果污染十分嚴(yán)重，那就需要采用更多的蒸餾水或無菌培養(yǎng)基重復(fù)以上步驟。（6）在最后清洗之后，挑取單藻細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上（一般轉(zhuǎn)移1050個(gè)細(xì)胞)。（7）用于綠藻培養(yǎng)的Tr

30、ebouxia有機(jī)營養(yǎng)和用于藍(lán)細(xì)菌培養(yǎng)的含有葡萄糖的MDM培養(yǎng)基，可以檢驗(yàn)培養(yǎng)是否成功。如果受到細(xì)菌或酵母菌的污染，它們會(huì)在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上快速的生長。從藍(lán)細(xì)菌的膠狀外鞘上去除細(xì)菌十分難，然而它們可以與藻類協(xié)同生長，并不影響共生藻的生長。盡管在實(shí)驗(yàn)室中還沒成功地獲得較純的藍(lán)細(xì)菌群體，也許可以通過顯微操作做到這一點(diǎn)。平均從一種地衣中應(yīng)分離出15個(gè)單細(xì)胞。4切片法：僅用以上介紹的方法很難獲得無菌的絲狀綠藻，如Trentepohlia。切片技術(shù)會(huì)有利于獲得這些絲狀綠藻。（）采用消毒的解剖刀從藻的頂端切下新長成的藻絲，然后轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上。 （）采用Yamamoto的方法（見第二章)，在第二次過濾

31、后，放在解剖鏡下挑取淡綠色部分，然后將其轉(zhuǎn)移到有固體培養(yǎng)基或完全瓊脂的試管中。（）將裝有斜面培養(yǎng)基的試管（約50個(gè)）保存幾周，然后去除任何污染的試管。培養(yǎng)試管的污染取決于地衣體部位和狀況及地衣的種類。（）在未污染的試管中，共生體（光合藻和共生菌）大約在培養(yǎng)的四周后長出來。采用一些附加的處理方法（噴霧法或微量吸管吸法）可以將共生藻進(jìn)一步分離，以獲得源于單細(xì)胞的純基因上藻群。5離心方法：Richardson（1971)發(fā)表的離心技術(shù)的方案如下所述。（）將地衣勻漿獲得的懸濁液（子方案一）離心（100400g，10min）。通常，在低速離心（100200g，10min）后大部分小的共生藻會(huì)存在于上清液

32、中。對較大的共生藻必須采用不同搭配的速度和時(shí)間。可以采用低的離心速度（100g）去除較大片的地衣體或組織塊，采用較高的速度（400g）從細(xì)胞碎片和殘物中分離出完整的細(xì)胞。（）將樣品在離心前通過網(wǎng)孔為1030m的篩子過濾或通過其他較大孔的過濾器，以除去較大的殘片 （Bubrick1988）。（四）光合共生藻培養(yǎng)物的保存在低光照的條件下，共生藻可以培養(yǎng)很長一段時(shí)間 （約年) 。然而，我們認(rèn)為最好每23個(gè)月傳代一次。大多數(shù)的地衣共生藻的最佳生長溫度為1520。然而，在選擇培養(yǎng)條件時(shí)應(yīng)考慮地衣自然生長的溫度。其生長的最佳pH范圍是47。其生長的最佳光照范圍為1627molm-2s-1（PPFD）（Ah

33、madjian 1967a,b）。有色地衣的Trebouxia對高輻射敏感，而無色地衣的Trebouxia表皮具有耐光性。（）用解剖刀將帶有瓊脂培養(yǎng)基的共生藻群體分為幾部分（約5mm2），將群體放在有合適培養(yǎng)基的皮氏培養(yǎng)皿中培養(yǎng)23個(gè)月。（2) 每23個(gè)月將生長的群體轉(zhuǎn)移到相同成分的新鮮培養(yǎng)基上，在相同的條件下培養(yǎng)。地衣共生藻也可以在液氮下冷凍保藏相當(dāng)長的時(shí)間仍保持活性。四、評述一些Trebouxia種的地衣在光強(qiáng)大于11molm-2s-1（Ahmadjian，1967a）下培養(yǎng)時(shí)會(huì)失色。我們認(rèn)為在大約5molm-2s-1的光強(qiáng)下對Trebouxia培養(yǎng)，可以將該種保存很長時(shí)間。然而，作為分類

34、觀察，Trebouxia必須在低于22，33molm-2s-1的光照條件下，光周期為12h，培養(yǎng)基為3×N BBM培養(yǎng)基的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。五、需要解答的問題1.子囊孢子不萌發(fā)：在沒有合適共藻的時(shí)候，子囊孢子（如Peltigerales）有可能萌發(fā)，但卻不能生長。這種情況下，共生藻的提取物有可能會(huì)促進(jìn)孢子的萌發(fā)。在瓊脂中添加完整的共生藻細(xì)胞也許會(huì)刺激共生菌的生長?？蓞⒖嫉谌?。Pyatt （1973)、Ahmadjian（1993）和Yamamoto et al.（1998）已經(jīng)對各種條件對地衣孢子的萌發(fā)的影響作了很好的研究。孢子的萌發(fā)會(huì)受到許多環(huán)境因素的影響。這些因素包括采收季節(jié)（P

35、yatt 1969， Ostrofsky Denison，1980）、培養(yǎng)濕度（Garrett，1971）、培養(yǎng)基pH值（Pyatt 1968，Chismas 1980，OstrofskyDenison 1980）、培養(yǎng)溫度（Ostrofsky Denison 1980）、光周期（Pyatt 1968）、鹽堿度（Rmakaer 1978）、自然提取物（Ostrofsky Denison 1980）、葡萄糖是否存在（Belandria et al. 1989）、地衣次生代謝產(chǎn)物（Whiton Larrey 1982，1984）、空氣污染（Pyatt 1969， belandria et al.

36、1989）、重金屬（Pyatt1 976）、低氧（Kofler 1970）和樹皮成分（Ostrofsky and Denison 1980）等。2.污染：可以通過紫外線（可以損害細(xì)菌但不損害藻細(xì)胞）或抗生素去除附著在藍(lán)細(xì)菌膠狀鞘上的細(xì)菌。在培養(yǎng)時(shí)要防止小蟲吃共生藻或共生菌，可用乙烯材料的蓋子防止昆蟲的破壞。第二章 地衣體碎片的培養(yǎng)與地衣的重分化自古以來，地衣就在全世界范圍內(nèi)廣泛的用于醫(yī)藥、染料、香料、食品和飲料。在近二三十年來，已經(jīng)從地衣中分離出許多活性物質(zhì)。然而，對地衣大量的采集以用于工業(yè)生產(chǎn)，會(huì)導(dǎo)致地衣物種的滅絕。所以，地衣若要應(yīng)用于工業(yè)，必須進(jìn)行人共培養(yǎng)。通過孢子獲得地衣共生菌是最主要的

37、方法。然而，這種方法有著許多缺點(diǎn)（Ahmadjian 1993，可見于第一章）。如子囊盤也許不會(huì)產(chǎn)生孢子，孢子也許不會(huì)萌發(fā)，而且有許多地衣不產(chǎn)生子囊盤。在實(shí)驗(yàn)室，我們已成功的分離培養(yǎng)和保存了400多種的地衣共生菌藻。自從Schwender（1868）提出地衣為菌藻共生體以來，對許多地衣學(xué)者來說，通過分離的地衣共生體進(jìn)行地衣重建有一定的挑戰(zhàn)性。很少的學(xué)者可以做到這一點(diǎn)，通常是不能做到無菌操作（可見于Ahmadjian 1973a）。大多數(shù)情況下，純的共生菌群體培養(yǎng)并不適合用于滿足研究次生代謝物的生理實(shí)驗(yàn)或工業(yè)生產(chǎn)的大量需求，這是因?yàn)榕囵B(yǎng)共生菌所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物同完整地衣所產(chǎn)生的總是有一定的不同

38、。培養(yǎng)共生菌用于工業(yè)生產(chǎn)的另一個(gè)問題是其生長的速度很緩慢。另外，利用無菌分離的共生菌藻進(jìn)行地衣的人工重建是一項(xiàng)非常難和相當(dāng)費(fèi)時(shí)的工作。 1985年我們提出了利用地衣碎片進(jìn)行組織培養(yǎng)的技術(shù)（Yamamoto et al.，1985）。當(dāng)我們實(shí)踐時(shí)卻發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的地衣碎片會(huì)受到污染。據(jù)Ahmajian在地衣中所稱，地衣碎片的培養(yǎng)總會(huì)被其上所附的微生物所污染（Ahmadjian，1973b）。但我們認(rèn)為，通過仔細(xì)的挑選較小的地衣碎片（幾百微米），是可以減少污染的。1990年，Kon等人和Yoshimura 等人分別報(bào)道了在實(shí)驗(yàn)室中微地衣體的重分化。他們成功地在瓊脂培養(yǎng)基上對地衣碎片進(jìn)行培養(yǎng)并使幾個(gè)松蘿屬

39、（Usnea）的種在無菌的條件下重分化。之后，Yoshimura和Yamamoto （1991) 成功地在培養(yǎng)皿中使一些藍(lán)細(xì)菌地衣體重分化。如地卷屬（Peltigera）的一些種?？傊?，我們用地衣碎片培養(yǎng)完成了5個(gè)屬（Peltigera、Lobaria、Cladonia、Usnea）的重分化。在該章，我們將對利用地衣碎片的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)以獲得地衣體的方法進(jìn)行祥述。另外，該方法也可作為無菌地衣共生菌藻群體的獲得。該書的其他章（1和3章）已涉及這方法。雖然，利用地衣碎片獲得重分化地衣體的方法并不能克服生長速度慢的問題，該法卻比通過分離的地衣共體來進(jìn)行地衣重建快的多。分離方案可見圖1 地衣碎片培養(yǎng)方法（

40、地衣的組織培養(yǎng)）。一、實(shí)驗(yàn)材料注意：除了每一個(gè)清洗步驟，所有的操作都應(yīng)在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，或無菌條件下操作。所有儀器在用之前均應(yīng)高壓滅菌（1520min，121，1atm）或干熱滅菌（180，30min）。1實(shí)驗(yàn)儀器：高壓滅菌器、竹棍（長為15cm）、超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、尼龍篩（篩孔為150500m）、解剖鏡2地衣材料：標(biāo)本應(yīng)為新采集未足1周的或采后1周內(nèi)放在紙帶中-25以下冷凍的。冷凍的標(biāo)本在存儲(chǔ)一年多后仍能用于培養(yǎng)。3培養(yǎng)基：MY 培養(yǎng)基（Molt/Yeast extract medium，Ahmadjian，1961） 麥芽抽提液 20g酵母抽提液 2g瓊脂 20g加蒸餾水補(bǔ)足1000m

41、l LB培養(yǎng)基（LillyBarnett medium，Lilly and Barnett，1951） 葡萄糖 10.0g L-天冬酰胺酸（Asparagine）2.0gKH2PO41.0g MgSO4·7H2O 0.5g Fe（NO3)3·9H2O 0.2mg ZnSO4·7H2O 0.2mgMnSO4·4H2O 0.1mg VB1氫氯化物（Thiamin hydrochloride）100g維生素H（biotin） 5g 蒸餾水補(bǔ)足1000mlWA培養(yǎng)基水-瓊脂培養(yǎng)基（Water-agar medium） 瓊脂 20g蒸餾水補(bǔ)足1000ml將所有培養(yǎng)

42、基進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，然后在超凈工作臺(tái)上將15ml倒入皮氏皿中或5ml加入試管中。二、操作步驟“地衣碎片的培養(yǎng)”同“地衣碎片的重分化或組織培養(yǎng)”有著相類似的操作。但這兩種方法所用的培養(yǎng)基和光照條件不同。前者所用培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基或MY培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為無光，而后者培養(yǎng)基多為乏營養(yǎng)或無營養(yǎng)培養(yǎng)基，在光照或光暗交替的條件下培養(yǎng)。第一個(gè)方法會(huì)形成不分化的細(xì)胞團(tuán)，第二個(gè)會(huì)產(chǎn)生小的地衣體。1地衣體碎片培養(yǎng)（地衣組織培養(yǎng)法）（1）用剪子或解剖刀從地衣體上切取一部分（枝狀地衣長為1cm，葉狀或殼狀地衣為1cm2），然后在自來水中沖洗30分鐘至1個(gè)小時(shí)。（2）在超凈工作臺(tái)上將所取部分放在研缽中，加入3ml無菌水

43、（要用無菌的移液管加入）研磨。（3）將勻漿通過一個(gè)網(wǎng)孔為500um的尼龍篩過濾。去除殘?jiān)?。然后再將所得的濾液通過一個(gè)網(wǎng)孔為150um的尼龍篩過濾。這樣通過雙重過濾就可以除去損壞細(xì)胞殘?jiān)洼^大的地衣碎片。所得到的地衣碎片大小為150500um。（4）在實(shí)體顯微鏡下用無菌竹棍從尼龍篩上挑取地衣碎片。接種到裝有5ml斜面MY瓊脂培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)。所用試管長為10.5cm，需要裝2550個(gè)試管。然后蓋上滅過菌的鋁蓋。（5）將試管放在溫度為15的培養(yǎng)箱中，無光培養(yǎng)。一周或兩周內(nèi)一些試管內(nèi)污染的真菌或酵母菌就會(huì)快速生長，并覆蓋地衣碎片，應(yīng)該在它們的孢子傳播之前就將污染試管去除。（6）接種兩周之后，地衣共

44、生菌的菌絲體或藻就會(huì)長出地衣碎片。（7）六個(gè)月以后，將含有共生菌藻的細(xì)胞團(tuán)移到新的MY瓊脂培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基應(yīng)裝在直徑為6090mm的皮氏皿中。（8）每3到6個(gè)月將細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，并在15無光的條件下培養(yǎng)。2通過地衣碎片重分化出微小地衣體14步同上 ，然后：（5）將試管在溫度為15的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光照下（2.6W/m2）或在光暗交替下。一周內(nèi)，污染的真菌或酵母菌會(huì)在一些試管內(nèi)快速生長。扔掉所有污染試管。（6）六個(gè)月以后，將由共生菌藻形成的未分化的細(xì)胞團(tuán)而長出來的地衣微體轉(zhuǎn)移到新的MY或WA培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基應(yīng)裝在直徑為6090mm的皮氏皿中。3共生菌的分離在1操作中第七步之后形

45、成包含共生菌藻的細(xì)胞團(tuán)可以用來共生菌的分離。之后進(jìn)行共生菌的無菌培養(yǎng)，如果有必要可以進(jìn)行重建實(shí)驗(yàn)。（1）將小的細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到研缽中，加入13ml無菌水進(jìn)行研磨。（2）用無菌水將1ml勻漿溶液稀釋10倍。（3）取1ml稀釋液轉(zhuǎn)移到裝有MY瓊脂塊的皮氏培養(yǎng)皿中（直徑為90mm）并在1520下進(jìn)行培養(yǎng)。（4）約36個(gè)月后，培養(yǎng)基表面上就會(huì)出現(xiàn)克隆體群體。分別挑取綠色的共生藻同絲狀的共生菌，并轉(zhuǎn)移到斜面培養(yǎng)基上。在一到三個(gè)月后，扔掉污染有其他共生體的試管。如果所有試管均污染了，就要從第一步重新開始。（5）將未污染試管作為純的共生體群體保存。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1地衣碎片的培養(yǎng)（1） 污染：表一顯示了16種地衣

46、在進(jìn)行地衣碎片培養(yǎng)時(shí)污染的程度。表面光滑的地衣或含有抗生素的地衣如Cetraria islandica、Evernia prunastri、Usnea diffracta和U.longissima污染率很低。然而，具有粉芽和裂芽的地衣，以及生長在土壤中的地衣如Cladonia coccifera、C.pleurota、Ramalina yasudae和Usnea rubeescens污染率很高。這說明外來微生物的污染發(fā)生在這些地衣體本身。地衣共生菌形成緊湊的克隆體，或產(chǎn)生較短且較厚的菌絲體，也有可能產(chǎn)生短棒狀的天線菌絲體。然而，僅接種一個(gè)月后，很難區(qū)分地衣共生菌與污染真菌。（表1 P41）（2

47、）季節(jié)變化：表2顯示了采集的季節(jié)并不影響Usnea bimolliuscula和U.rubescens 的生長與污染。（3）采集地點(diǎn)的變化 表三表明了在日本不同地點(diǎn)采集的地衣僅輕微影響地衣碎片的污染與培養(yǎng)。我們在對其他屬的地衣的培養(yǎng)如Cladonia sp.、Cetraria sp.和Umbilicaria sp.也得到了類似的結(jié)果。（4）培養(yǎng)條件：關(guān)于溫度與光照，Yamamoto et al.（1987）報(bào)道了光照與溫度對未分化細(xì)胞團(tuán)生長的影響。光對其最初生長的影響主要依據(jù)于培養(yǎng)的種類。阿爾匹斯地衣Alectoria ochrolecuca未分化細(xì)胞團(tuán)的生長僅在15度下受到誘導(dǎo)。然而，亞熱帶

48、雨林的地衣如 Ramalina boninensis 和R.pacifical的未分化細(xì)胞團(tuán)的生長可以同時(shí)在15，25下被誘導(dǎo)。（5）培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基，自從Ahmadjian最初使用MY培養(yǎng)基培養(yǎng)Cladonia的共生菌以來，我們經(jīng)常用該培養(yǎng)基。然而，MY培養(yǎng)基并不適合一些屬的地衣共生菌和地衣碎片的培養(yǎng)，這些包括Anzia、Gymnoderma和藍(lán)細(xì)菌類地衣（Lobararia、Nephroma、Peltigera、Soleria和Stictaetc等）。我們還注意到瓊脂培養(yǎng)基還可以抑制Letharia屬地衣孢子的萌發(fā)（yamamoto et al. 1998）。（6）培養(yǎng)條件：一些激素如生長

49、素、細(xì)胞分裂素、赤霉素可以調(diào)控植物細(xì)胞的生長與分化。然而，在地衣碎片的培養(yǎng)基中加入激素維生素和其他有機(jī)化合物并不能明顯的促進(jìn)其生長（Yamamotoet al.1998, Yamamoto et al.未公開資料）。（7）采集后地衣的存儲(chǔ)時(shí)間：了解地衣在采集后可以在實(shí)驗(yàn)室條件下存儲(chǔ)多長時(shí)間仍能保持活性是十分有意義的。表4顯示了生長在冰箱或培養(yǎng)箱中的地衣在各種溫度下存儲(chǔ)時(shí)間。當(dāng)?shù)匾麓娣旁跍囟葹?5的培養(yǎng)箱中，一個(gè)月內(nèi)Usnea屬的會(huì)死亡，而其他屬如Rimelia和Parmotrema卻仍能活著。當(dāng)保存在25的冰箱中時(shí)，許多地衣仍能存活13年，在-80的條件下則可以存活5年。2通過地衣碎片或細(xì)胞團(tuán)

50、的重分化獲得地衣微體（1）培養(yǎng)基的影響：Yoshimura et al.（1990）報(bào)道了培養(yǎng)基營養(yǎng)對Usnea rubescens和Peltigera praetextata地衣碎片重分化的影響。U.rubescens在含有更少的葡萄糖和天冬酰胺酸的改進(jìn)培養(yǎng)基上比標(biāo)準(zhǔn)的LB培養(yǎng)基上生長的更好。而P.pratextata則在WA培養(yǎng)基上比在MDM和MY培養(yǎng)基上長勢更好。Kon et al.（1997）研究了MY培養(yǎng)基中的瓊脂密度對U.confusa ssp.kitamiensis地衣碎片培養(yǎng)的影響。低水分瓊脂（即 高瓊脂密度）可以很明顯的影響地衣微體的重分化。（2）溫度的影響：地衣在自然界的最

51、適生長溫度為1520度。表5顯示了培養(yǎng)溫度對U.confusa ssp.kitamiensis 地衣碎片分化的影響。表明了該屬分化的最適溫度為18。四、一些問題解答1微生物污染地衣體的污染取決于它的基物。生長在土壤中的地衣難以培養(yǎng)。因?yàn)楫?dāng)在培養(yǎng)一個(gè)月后，僅有少數(shù)的試管未被污染，這樣就很難獲得培養(yǎng)的成功。如果碎片污染率較高，用較小的篩孔的篩子過濾也許會(huì)有用。也可以改變所用培養(yǎng)基、溫度或光暗周期，或干脆用另一個(gè)標(biāo)本或種類培養(yǎng)。2昆蟲的破壞通常地衣共生菌和真菌一樣容易招小蟲子而引起培養(yǎng)群體的污染。將瓊脂塊上長有蟲子的皮氏培養(yǎng)皿放在25下過夜，就會(huì)很容易的殺死小蟲，而不影響共生體生長。3地衣碎片不能生

52、長如果用LB和MY培養(yǎng)基不能使地衣微體或藍(lán)細(xì)菌地衣生長，就應(yīng)尋找適合這些地衣的培養(yǎng)基（可見第3章）五、評述：生長因素：在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行地衣群體或地衣碎片的培養(yǎng)十分慢，他們的生長速率不能夠滿足工業(yè)的大量需求，因此我們鼓勵(lì)其他學(xué)者對調(diào)控地衣生長的機(jī)理進(jìn)行研究。綠藻對地衣形態(tài)發(fā)育的影響：Kinoshita et al研究了Usnea hirta共生菌形成一個(gè)地衣的能力。首先共生菌在MY瓊脂培養(yǎng)基上形成小的分支，像線狀的地衣微體。然而在此后的7個(gè)月中地衣微體不再變大。這說明，共生藻對地衣的分化有重要的作用，另一個(gè)研究藻類對地衣形態(tài)發(fā)育影響的方法是地衣重建試驗(yàn)，我們可將原來的共生藻換用另一種不同的藻來研究

53、。光合共生體的研究：通過分離的地衣共生菌藻進(jìn)行地衣的人工重建，可以對光合共生體進(jìn)行研究，如：Yoshimuia et al報(bào)道的含有綠藻的藍(lán)細(xì)菌地衣Peltigeia aphthosa的重分化實(shí)驗(yàn)。詳細(xì)細(xì)節(jié)可見第三章。應(yīng)用次生代謝物的生產(chǎn)：培養(yǎng)的地衣碎片和共生菌菌落并不一定產(chǎn)生與原有完整地衣體一樣的次生代謝物，Yoshimuia et al對100份培養(yǎng)的地衣碎片和共生菌進(jìn)行了調(diào)查研究，只有20份產(chǎn)生了同自然地衣體一樣的次生代謝物，60份產(chǎn)生了不同于田野采集地衣的不明次生代謝物，而20份則沒產(chǎn)生地衣代謝物。很明顯，培養(yǎng)條件可以影響群體次生代謝物的產(chǎn)生。我們已經(jīng)知道，一些次生代謝物的成份取決于高

54、等植物群體組織分化的程度。Kinoshita et al稱由培養(yǎng)的Usnea hirta地衣碎片產(chǎn)生的usnic acid的成分同其的形態(tài)發(fā)育的復(fù)雜性成正比例增加。盡管還需要進(jìn)一步的研究，這種方法也許會(huì)邁出地衣經(jīng)濟(jì)利用的第一步。第三章 光合共生體的重建簡介有時(shí)，有些葉狀地衣是由一種共生菌同藍(lán)細(xì)菌或綠藻形成的共生體。甚至，同一種共生菌可以形成兩種不同的形態(tài)，這主要出現(xiàn)在生長在綠色葉狀地衣體上的藍(lán)細(xì)菌殼狀地衣。這種情況尤其發(fā)生在Peltigera,Lobaria,Nephroma,Sticata and Pseudocyphellaria屬的地衣。這種“一真菌-兩形態(tài)”假說說明了地衣共生菌可以同原

55、核藍(lán)細(xì)菌和/或真核綠藻產(chǎn)生共生關(guān)系。我們經(jīng)常所用的“光合共生體”來源于早期的“藻共生體“，包括了二形態(tài)地衣以及由不同綠藻或藍(lán)細(xì)菌形成的地衣和衣癭地衣。由于，光合共生體在自然生態(tài)系統(tǒng)中或有或無，因此，他們的起源難于理解。也許，共生子囊真菌進(jìn)化出高度可塑性的表型有助于他們適應(yīng)自然界中經(jīng)常變化的生長條件。對野外Sticta filix的研究表明光照的強(qiáng)度決定了共生藻是藍(lán)細(xì)菌還是綠藻，介于藍(lán)細(xì)菌和綠藻還存在著中間類型。三共生體系中的共生菌具有高度地對藍(lán)細(xì)菌有?；?，這種?；钥梢哉J(rèn)為是共生菌對藍(lán)細(xì)菌所提供營養(yǎng)的?；浴ＴS多這種地衣一般具有較大的地衣體，并且生長在營養(yǎng)貧乏的基物上。他們依靠于發(fā)生在藍(lán)細(xì)菌

56、循環(huán)中的高效的固氮合成體系，該體系已由Feige,Rai et al和Rai在衣癭和各種藍(lán)細(xì)菌地衣中進(jìn)行的研究。藍(lán)細(xì)菌?；匾鹿采姆蛛x具有很大的挑戰(zhàn)性，因?yàn)樗麄冃枰{(lán)細(xì)菌結(jié)合才能生長。一個(gè)方法是將他們同分離的藍(lán)細(xì)菌克隆體一同培養(yǎng)。另外，也可以在培養(yǎng)基上加一些富氮的化合物來彌補(bǔ)藍(lán)細(xì)菌的缺失，在過去的20年里，許多科學(xué)家已經(jīng)對很多新的光合共生體進(jìn)行了描述和研究，如James 1975;James and Henssen1976;Brodo and Richardson1978;Tnsberg and Holtan-Hartwig1983,Ott1988;Armaleo and Clerc1991。最近，對地衣的研究進(jìn)入了一個(gè)新的時(shí)期?，F(xiàn)代實(shí)驗(yàn)操作，使在人工創(chuàng)造的可控制的實(shí)驗(yàn)環(huán)境下進(jìn)行地衣的分離和重建成為現(xiàn)實(shí)。此方面的研究對于共生體的專性和人工重建地衣次生代謝物的產(chǎn)生以及共生體進(jìn)化的理解有著重要的意義。不久的將來，生物分子技術(shù)也許會(huì)用來產(chǎn)生具有新的特點(diǎn)的共生體。但是，這需要對影響人工重建共生體和自然共生體生長因素的進(jìn)行進(jìn)一步的研究。早期的共生實(shí)驗(yàn)主要針