食品中金黃葡萄球菌的檢測方法

1、食品中金黃葡萄球菌的檢測方法        金黃色葡萄球菌是一種引起人類和動物化膿感染的重要致病菌，也是造成人類食物中毒的常見致病菌之一。本菌廣泛分布于自然界，如空氣、土壤、水及其它環(huán)境中。在人類和動物的皮膚及外界相通的腔道中，也經(jīng)常有本菌存在。據(jù)報導(dǎo)，在正常人群中的帶菌率可達30%80%，其中皮膚帶菌率為822%，鼻腔和咽喉部等上呼吸道的帶菌率在4050%以上，因此其可通過各種途徑和方式，尤其是經(jīng)工作人員的手和上呼吸道而污染食品。由于致病金黃葡萄球菌能產(chǎn)生腸毒素，故一旦細菌污染食品，并在合適的溫度環(huán)境下，細菌可以大量繁殖并

2、產(chǎn)生腸毒素，從而引起消費者食物中毒。    由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒，在世界各國都極為普遍。特別是在北美及歐洲等地區(qū)發(fā)病率更高。在上述這些國家中，每年有金黃色葡萄球菌引起的食物中毒病例，僅次于沙門氏菌，而在細菌性食物中毒病例排到第23位，有此而造成的經(jīng)濟損失也相當慘重，在我國由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒病例也時有報導(dǎo)，所以目前世界各國都把金黃色葡萄球菌列為食品衛(wèi)生的法定檢測項目。    我國對金黃色葡萄球菌目前采用的方法是以國家標準GB.4789-10-84及檢驗檢疫系統(tǒng)行業(yè)標準SN.0172-92作為依據(jù)。整個檢測過程獲得最

3、終結(jié)果須時5天左右，既費時又費力，并造成貨物積壓，也影響貨物的及時出運，并使貨主的倉儲成本提高，造成較大的經(jīng)濟損失。    多年來很多食品微生物實驗室都在探索和尋找一些準確性高，并快速的檢測方法，最近我們分別從美國3M公司和法國生物梅里埃公司獲得兩種快速檢測致病性金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基，其名稱為： Petrifilm RSA. Count Plate（由美國3M公司研制生產(chǎn)），是一種薄膜型快速檢測金黃色葡萄球菌的計數(shù)平板。 Baird-parker + RPF Agar.（由法國生物梅里埃公司研制生產(chǎn)的用Baird-Parker瓊脂加免血漿纖維蛋白原的金黃色葡萄球

4、菌檢測計數(shù)平板）。    原理：Petrifilm. RSA. 測試薄膜是由二部分組成。第一部分是由黃金色葡萄球菌培養(yǎng)基片，此培養(yǎng)基中含有經(jīng)修正的Barid-Parker，營養(yǎng)成分加上以冷水可溶解的膠質(zhì)。第二部分是一種耐熱核酸酶（TNase）反應(yīng)片，含有DNA及甲苯胺蘭 ( Toluidine Blue - O )及四唑指示劑 (Tetraeolium)。此指示劑有助于菌落的計數(shù)及確定葡萄球菌耐熱核酸酶的存在。    耐熱去氧核糖核酸（deoxyribonulcas Dnase）為產(chǎn)毒金葡菌之典型特征，此酶非常耐熱，在100加熱30m

5、in，不易喪失活性，在130之下，其D值為16.6min，此酶之分子量為16800，等電點PH為9.6,耐熱去氧核糖酸與檢測血漿凝固酶相似，是一種鑒定金黃色葡萄球菌的方法，在Petrifilm. RSA 檢測片上，耐熱DNA酶反應(yīng)看起來，呈粉紅色環(huán)帶包圍著一個紅色或蘭色的菌落。    Petrifilm.RSA檢測片，必須與Peyrifilm耐熱核酸酶反應(yīng)片一起使用，單獨使用將不會顯示菌落，因為具有輔助計數(shù)菌落的指示劑是在反應(yīng)片上，而不是在Petrifilm.RSA檢測片上。    Baird-parker + RPF agar，這一

6、培養(yǎng)基中含有豐富的營養(yǎng)成分，其中以氯化鋰代替亞碲酸鉀，使菌落顏色呈黑色，RPF補充有兔血漿和牛纖維蛋白原，以便檢測凝固酶活力，胰酶可以抑制全部或部分圍繞凝固酶陽性菌落周圍沉淀暈環(huán)纖維蛋白的溶解，因此凡存在血漿凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌，將在培養(yǎng)基中呈現(xiàn)有暈環(huán)的黑色菌落，即可確認，并作計數(shù)。 實驗實施材料和方法：本次實驗采用以下3種試劑：1. 美國3M公司提供的Petrifilm. Rapid. S. aureus Count Plate.2. 法國生物梅里埃公司提供的Baird-Parker + RPF agar .3. 實驗室自配Baird-Park瓊脂（英國Oxoid）及新鮮兔血

7、漿。菌種來自美國菌種保存中心（America TyP Culture Collection）。金黃色葡萄球菌共10株菌株，其菌號分別為：ATCC 27661 ATCC 27664 ATCC 13565 ATCC 51704ATCC(K) 12600 ATCC(R) 65389 ATCC 25923 ATCC 29213ATCC 8095 ATCC 12598非金黃色葡萄球菌菌種5株，其菌號分別為：ATCC 51813 （大腸桿菌）、ATCC 624 （無乳鏈球菌）、ATCC 51816 （陰溝腸桿菌）、ATCC 6051 （枯草桿菌）、ATCC 49214 （腸炎沙門氏菌）、自然食品檢樣，任意

8、購自市場。本次實驗是以同一測試樣品經(jīng)均質(zhì)并通過無菌生理鹽水作10倍遞增稀釋后取1至2個稀釋度同時接種上述三種培養(yǎng)基作平行實驗，在取得最終結(jié)果后相互進行比對。上述三種培養(yǎng)基的接種方法是按生產(chǎn)商所提供的使用說明進行操作，另外Baird-Parker Agar 培養(yǎng)基是按SN0172-92標準進行操作。A、本次實驗共測試已知標準菌種共15株，其中葡萄球菌10株，其他菌種5株（包括大腸桿菌、陰溝腸桿菌、腸炎沙門氏菌、枯草桿菌和無乳鏈球菌）。B、測試自然食品檢樣共101只（其中包括肉11只、肉類14只、水產(chǎn)品17只、牛奶25只、蔬菜22只、豆制品12只）。結(jié)果：A、被檢菌種10株，金黃色葡萄球菌在三種培

9、養(yǎng)基上都能檢出生長情況良好，同一稀釋度的菌液，除個別菌株外在3種培養(yǎng)基計數(shù)檢測結(jié)果基本都在一個數(shù)量級上，無顯著差異。而5株非金黃色葡萄球菌的菌株在三種培養(yǎng)基上全部不能生長。B、自然食品檢樣共接種101只，每一檢樣同一稀釋濃度分別同時種三種培養(yǎng)基，最終共檢出金黃色葡萄球菌45只，占全部檢樣的44.5，其中Petrifilm RSA 檢出陽性結(jié)果為42只，占全部陽性檢樣的93.3，Baird-ParkerRPF Agar. 檢出陽性結(jié)果26只，占全部陽性檢樣的57.7。Baird-Parker. Agar 檢出陽性結(jié)果32只，占全部陽性檢樣的71.1。討論. 用15株標準菌在3種培養(yǎng)基中的檢測，1

10、0株金黃色葡萄球菌以同一濃度接種，結(jié)果生長良好，其最終計數(shù)基本一致，定位在同一數(shù)量級，5株非金黃色葡萄球菌接種上述三種培養(yǎng)基全部不長，說明上述三種培養(yǎng)基對金黃色葡萄球菌選擇良好。. 以101只自然樣品同一均質(zhì)稀釋液，同時接種三種培養(yǎng)基，從最終結(jié)果來看，對金黃色葡萄球菌的陽性檢出率為44.5. 從檢測程序來年，Petrifilm. RSA及Baird-ParkerRPF. Agar. 都在樣品接種后2830h觀察結(jié)果，并不必再做證實試驗，而如以Baird-Parker Agar檢測，須在接種后48h觀察平板，并挑取可疑菌落轉(zhuǎn)種到營養(yǎng)肉湯中，在經(jīng)18-24h后做血漿凝固酶或耐熱DNA酶試驗進行證實

11、，最終計數(shù)，前后約須80h。. 從本次試驗中觀察，使用上述三種培養(yǎng)基對食品中金黃色葡萄球菌含量的直接計數(shù)檢測，其樣品接種液的含量擬控制在100個/ml以內(nèi)，比較容易分清并計數(shù)，如菌量過濃，則將會影響最后的讀數(shù)，因此對新送的被檢樣品，如在不了解污染的情況下一般必須要做2個以上的稀釋度，同時分別接種，才能獲得較為滿意的結(jié)果。而在Baird-ParkerRPF Agar及Baird-Parker. Agar接種時必須將1ml樣液作三只平板涂布（0.3、0.3、0.4ml）這樣就會造成手續(xù)繁瑣試劑消耗較大，但Baird-Parker. RPF. 培養(yǎng)基也可以1ml樣液作傾注培養(yǎng)，并作計數(shù)。. 在整個測試過程中，我們發(fā)現(xiàn)，按使用說明對Petrifilm. RSA. 及Barid-ParkerRPF. Agar，操作規(guī)定在接種24h后觀察結(jié)果，此時往往由于菌落長得經(jīng)較小，特征瓜不明顯，但如果繼續(xù)放置一夜以后金葡萄菌落特征明顯，并可能會經(jīng)第一天觀察數(shù)量有所增加，這樣可以提高檢測結(jié)果的可信度。. 由于對上述兩種培養(yǎng)基的試用期間我們尚未獲得供應(yīng)商的報價，故無法測算每一樣品的測試成本價格。但可以予計上述兩面種快速檢測培養(yǎng)基的耗材費用要高于常規(guī)經(jīng)典方法（Baird-Parker Agar）的費用。. 通過本