(完整word版)高效液相色譜儀使用注意事項(xiàng)[1]全解

1、1 . 流動(dòng)相必須用HPLC 級(jí)的試劑，使用前過(guò)濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)（使用0.45um 或更細(xì)的膜過(guò)濾）。2 .流動(dòng)相過(guò)濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應(yīng)該恢復(fù)到室溫后使用。3 .不能用純乙腈作為流動(dòng)相，這樣會(huì)使單向閥粘住而導(dǎo)致泵不進(jìn)液。4 .使用緩沖溶液時(shí)，做完樣品后應(yīng)立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時(shí)，然后用甲醇（或甲醇水溶液）沖洗 40 分鐘以上，以充分洗去離子。對(duì)于柱塞桿外部，做完樣品后也必須用去離子水沖洗20ml 以上。5 .長(zhǎng)時(shí)間不用儀器，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應(yīng)該用有機(jī)相（如甲醇等），因?yàn)榧兯组L(zhǎng)霉。6 .每次做完樣品后應(yīng)該用溶解樣品的溶劑

2、清洗進(jìn)樣器。7 .C18 柱絕對(duì)不能進(jìn)蛋白樣品，血樣、生物樣品。8 .堵塞導(dǎo)致壓力太大，按預(yù)柱-混合器中的過(guò)濾器 -管路過(guò)濾器-單向閥檢查并清洗。清洗方法；以異丙醇作溶劑沖洗：放在異丙醇中間用超聲波清洗；用10%稀硝酸清洗。9 .氣泡會(huì)致使壓力不穩(wěn)，重現(xiàn)性差，所以在使用過(guò)程中要盡量避免產(chǎn)生氣泡。10 .如果進(jìn)液管內(nèi)不進(jìn)液體時(shí)，要使用注射器吸液：通常在輸液前要進(jìn)行流動(dòng)相的清洗。11 .要注意柱子的pH 值范圍，不得注射強(qiáng)酸強(qiáng)堿的樣品，特別是堿性樣品。12 . 更換流動(dòng)相時(shí)應(yīng)該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動(dòng)邊靖洗，然后插入新的流動(dòng)相中。更換無(wú)互溶性的流動(dòng)相時(shí)要用異丙醇過(guò)渡一下。液相色譜柱使用經(jīng)驗(yàn)談

3、色譜柱在使用前，最好進(jìn)行柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來(lái)，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測(cè)試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行（出廠測(cè)試所使用的條件是最佳條件 ），只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。1 、樣品的前處理：a、最好使用流動(dòng)相溶解樣品。b、使用預(yù)處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。c、使用0.45 m的過(guò)濾膜過(guò)濾除去微粒雜質(zhì)。流動(dòng)相的配制液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：a、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不

4、會(huì)沉淀在柱中（或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中 ）。b、流動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)（特殊情況除外）。c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便在使用較長(zhǎng)的分析柱時(shí)能得到好的分離效果；同時(shí)降低柱壓降，延長(zhǎng)液體泵的使用壽命（可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度）。d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用 UV檢測(cè)器，最好使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行。f、在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。3、 流動(dòng)相流速的選擇：因柱效是柱中流動(dòng)相線(xiàn)性流速的函數(shù)，使用不同的流速

5、可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇 1ml/min,對(duì)于內(nèi)徑為 4.0mm柱，流速0.8ml/min為佳。 當(dāng)選用最佳流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長(zhǎng)?？刹捎酶淖兞鲃?dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間（如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量）。注意：a.由于甲醇廉價(jià)，對(duì)于反相柱推薦使用甲醇體系（必須使用乙睛的場(chǎng)合除外 ）。b.對(duì)于正相柱推薦使用沸程為30-60C的石油醍或提純后的己烷作流動(dòng)相，沒(méi)有提純的己烷不得使用。用水最好使用超純水（電阻率大于18 兆歐 ），去離子水及雙蒸水中含有酚類(lèi)雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果。c.含水

6、流動(dòng)相最好在臨實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過(guò)夜。最好加入疊氮化鈉，防止細(xì)菌生長(zhǎng)。d.流動(dòng)相要求使用 0.45用濾膜過(guò)濾，除去微粒雜質(zhì)。e.使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，提高柱性能常見(jiàn)故障的斷定及解決方法診狀可能的原因及解決方法（一 ）保留時(shí)間變化1 . 柱溫變化柱恒溫，必要時(shí)需配置恒溫箱2 .等度與梯度間未能充分平衡至少用 10 倍柱體積的流動(dòng)相平衡柱3 .緩沖液容量不夠用 25mmol/L 的緩沖液4 .柱污染每天沖洗柱5 .柱內(nèi)條件變化穩(wěn)定進(jìn)樣條件,調(diào)節(jié)流動(dòng)相6 .柱快達(dá)到壽命采用保護(hù)柱（二 ）保留時(shí)間縮短1 .流速增加檢查泵,重

7、新設(shè)定流速2 .樣品超載降低樣品量3 .鍵合相流失流動(dòng)相 pH 值保持在37.5，檢查柱的方向4 .流動(dòng)相組成變化防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀5 .溫度增加柱恒溫（三 ）保留時(shí)間延長(zhǎng)1 .流速下降管路泄漏, 更換泵密封圈, 排除泵內(nèi)氣泡2 .硅膠柱上活性點(diǎn)變化用流動(dòng)相改性劑,如加三乙胺,或采用堿質(zhì)鈍化柱3 .鍵合相流失同前（二 ）34 .流動(dòng)相組成變化同前（二 ）45 .溫度降低同前 （二 ）5（四 ） 出現(xiàn)肩峰或分叉1 .樣品體積過(guò)大用流動(dòng)相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15%2 .樣品溶劑過(guò)強(qiáng)采用較弱的樣品溶劑3 .柱塌陷或形成短路通道更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件4 .柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效更換燒結(jié)

8、不銹鋼,加在線(xiàn)過(guò)濾器,過(guò)濾樣品5 .進(jìn)樣器損壞更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子（五 ）鬼峰1 .進(jìn)樣閥殘余峰每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥,改進(jìn)閥和樣品的清洗2 .樣品中未知物處理樣品3 .柱未平衡重新平衡柱,用流動(dòng)相作樣品溶劑（尤其是離子對(duì)色譜）4 .三氟乙酸（TFA） 氧化 （肽譜 ） 每天新配,用抗氧化劑5 .水污染（反相） 通過(guò)變化平衡時(shí)間檢查水質(zhì)量，用HPLC 級(jí)的水（六 ） 基線(xiàn)噪聲1 .氣泡（尖銳峰） 流動(dòng)相脫氣,加柱后背壓2 .污染（隨機(jī)噪聲） 清洗柱,凈化樣品,用 HPLC 級(jí)試劑3 .檢測(cè)器燈連續(xù)噪聲更換氘燈4 .電干擾（偶然噪聲） 采用穩(wěn)壓電源,檢查干擾的來(lái)源（如水浴等）5 .檢測(cè)器中有氣泡流動(dòng)相

9、脫氣,加柱后背壓（七 ）峰拖尾1 .柱超載降低樣品量, 增加柱直徑采用較高容量的固定相2 .峰干擾清潔樣品,調(diào)整流動(dòng)相3 .硅羥基作用加三乙胺,用堿質(zhì)鈍化柱，增加緩沖液或鹽的濃度，降低流動(dòng)相pH 值，鈍化樣品4 .同前（四 ）4 同前（四 ）45 .同前（四 ）3 5.同前（四 ）36 .死體積或柱外體積過(guò)大連接點(diǎn)降至最低,對(duì)所有連接點(diǎn)作合適調(diào)整,盡可能采用細(xì)內(nèi)徑的連接管7 .柱效下降用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護(hù)柱（八 ）峰展寬1 .進(jìn)樣體積過(guò)大同 （四 ）12 .在進(jìn)樣閥中造成峰擴(kuò)展進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴(kuò)散3 .數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10 點(diǎn)4 .檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)過(guò)大設(shè)

10、定時(shí)間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的10%5 .流動(dòng)相粘度過(guò)高增加柱溫,采用低粘度流動(dòng)相6 .檢測(cè)池體積過(guò)大用小體積池,卸下熱交換器7 .保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等度洗脫時(shí)增加溶劑含量也可用梯度洗脫8 .柱外體積過(guò)大將連接管徑和連接管長(zhǎng)度降至最小9 .樣品過(guò)載進(jìn)小濃度小體積樣品液相色譜儀使用操作規(guī)程液相色譜儀使用操作規(guī)程總流程：超純水沖洗柱 流動(dòng)相分離樣品 超純水沖洗柱 純乙睛保存柱1 電源準(zhǔn)備打開(kāi)穩(wěn)壓器電源開(kāi)關(guān)，須待電壓指示至220V 后，才能開(kāi)啟其他有關(guān)設(shè)備。2 HP1100 高效液相色譜儀的準(zhǔn)備試劑：三氟乙酸乙腈 （Fisher 公司產(chǎn)品色譜純）超純水 （Millipore 超純水 ）冰乙酸 溶液配置：貯

11、液瓶與流動(dòng)相的準(zhǔn)備A液0.1%三氟乙酸（三氟乙酸 1ml,超純水 999ml）室溫保存B液60%乙睛 （乙睛600ml, 超純水400ml）室溫保存樣品液 0.01%乙酸 （冰乙酸0.01ml,超純水 100ml）室溫保存泵頭沖洗液：精濾后超純水或者是1%色譜純甲醇室溫保存注：貯液瓶應(yīng)用超純水清洗干凈，備用。流動(dòng)相溶劑用潔凈硼砂漏斗精濾除去微小顆粒。操作者必須清楚并注明A、 B 貯液瓶盛裝為何種溶劑。沖洗泵頭：用注射管于軟塑料管末端抽吸至有水流出，調(diào)節(jié) 流 速 開(kāi) 關(guān) 控 制 流 速 為 20-30drop/min. 。 流動(dòng)相管道排氣如果管道中氣泡較多，可通過(guò)彈擊管道，排除氣泡，并逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)

12、脫氣泵活塞使其松動(dòng)，用注射管于流動(dòng)相出口的塑料管末端抽吸至管道內(nèi)氣泡排除完全。操作時(shí)，我們通常已經(jīng)打開(kāi)了脫氣機(jī)（氣泡嚴(yán)重影響分離效果，所以觀察管道中液體是否有氣泡非常重要。） 開(kāi)機(jī) 進(jìn)入 HP1100 操作系統(tǒng)a雙擊 WIN-95操作界面中左下角 Instrument 1 online圖標(biāo)，進(jìn)入 HP1100工作站軟件 操作界面。單擊工作站操作界面上方Run control 菜單，在下拉菜單中找到Sample Info 子菜單，單擊。在Sample Info 信息框內(nèi)定義操作者、樣品前綴及編號(hào)、保存路徑等參數(shù)。在保存路徑項(xiàng)下，將可定義子目錄分別輸入操作者拼音縮寫(xiě)，以方便檢索時(shí)互不干擾。b.等待

13、工作站操作界面中泵、柱溫箱、檢測(cè)器各指示圖標(biāo)由灰色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色后，單擊泵、檢測(cè)器各圖標(biāo)可從其各自彈出的菜單中設(shè)定流動(dòng)相各溶劑比例、流速等。（ 1 ） 流速通常為1ml/min 。檢測(cè)波長(zhǎng)通常為280，或者254nm。（ 2） A 液設(shè)置為100%，運(yùn)行15-30 分鐘（目的是色譜柱的預(yù)平衡），觀察基線(xiàn)走勢(shì)，基線(xiàn)應(yīng)為直線(xiàn)，通過(guò)單擊“Balance鍵可將基線(xiàn)調(diào)至零點(diǎn)。待基線(xiàn)平穩(wěn)后可進(jìn)樣。（ 3） 調(diào)整 A 液為0， B 液為 100%再運(yùn)行 60 分鐘（此時(shí)乙腈實(shí)際濃度為60%）（4）在A液沖洗同時(shí)進(jìn)行進(jìn)樣環(huán)的沖洗：用 500“的針樣注射器，在 load狀態(tài)， 注入超純水 500”。（反復(fù)三次，若是

14、 20dl進(jìn)樣環(huán)，則加入 20“以上，多余的水可廢 液管流出。通常同一樣品上樣30 次后應(yīng)沖洗進(jìn)樣環(huán)，如果不同樣品，最好， 每次上樣前均進(jìn)行沖洗。）（ 5） 吸取一定量可直接進(jìn)樣的樣品溶液（上樣液最好用濾器濾過(guò)）， 將進(jìn)樣閥逆時(shí)針旋至 Load 檔，將進(jìn)樣針從進(jìn)樣孔處水平推入，按進(jìn)樣器活塞將樣品溶液注射入進(jìn)樣環(huán)后，立即將進(jìn)樣閥順時(shí)針?lè)较蛐罥nject 檔，與此同時(shí)，數(shù)據(jù)開(kāi)始自動(dòng)收集。（ 6） 此時(shí)樣品分析已經(jīng)完成。在HP1100 主操作界面的檢測(cè)器圖標(biāo)，關(guān)閉檢測(cè)器，然后關(guān)閉色譜儀主機(jī)檢測(cè)器開(kāi)關(guān)（目的是延長(zhǎng)檢測(cè)器壽命）。將 B 通道調(diào)為0， A 通道調(diào)為100%,即A液沖洗色譜柱約10-30m

15、in。用A液續(xù)沖洗色譜柱約10-30m （目的是沖出柱內(nèi)殘留的雜質(zhì)）（ 7） A 通道換為C 通道（100%乙腈）續(xù)沖洗色柱約10-30min。 （目的主要為保護(hù)柱） 數(shù)據(jù)記錄的終止與保存電腦將自動(dòng)收集并保存數(shù)據(jù)，終止運(yùn)行后，將自動(dòng)彈出數(shù)據(jù)框，或者可通過(guò)DATAANAL YSIS 菜單，調(diào)出資料。3 圖譜處理4 關(guān)機(jī)1） HP1100 的關(guān)閉在HP1100 的主操作界面上分別單擊關(guān)閉泵、檢測(cè)器圖標(biāo)，或通過(guò)菜單關(guān)閉。然后，單擊HP1100的主操作界面右上方"X；退出Instrument 1 online程序，返回至 WIN-95操作界面。單擊左下角“StarK單，單擊“Shut dow

16、n”等待關(guān)機(jī)，待出現(xiàn) “Resta址示后，按電腦主機(jī)電源鍵，關(guān)閉電腦主機(jī)及顯示器。將所有使用儀器用布蓋好。關(guān)閉排氣扇、空調(diào)與穩(wěn)壓器開(kāi)關(guān)。2） 清潔衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)完畢后，打掃儀器室桌面與地面清潔，保持桌面整潔。3） 儀器使用記錄記錄當(dāng)天的儀器使用情況于指定記錄本上，包括儀器使用起止時(shí)間與出現(xiàn)問(wèn)題的解決方 案，并簽上操作者的名字.液相色譜儀使用及維護(hù)方法液相色譜儀使用時(shí)要非常注意。使用卡套柱時(shí)，兩端的卡套應(yīng)時(shí)刻連接在柱芯上。不管您是平衡色譜柱或是清洗，任何時(shí)候都不能將卡套取下來(lái)，否則會(huì)造成填料的流失。液相色譜柱使用注意：卡套柱的安裝（加預(yù)柱）1 將卡套架套入柱芯2將兩片夾套片嵌入柱芯的凹槽，使夾套高于柱

17、芯（見(jiàn)下圖）3將已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高過(guò)夾套片4將"子彈頭"預(yù)柱放入卡套片內(nèi)5將卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手?jǐn)Q緊6然后依同樣的順序連接好柱子的另一端平衡色譜柱反相色譜柱在經(jīng)過(guò)出廠測(cè)試后是保存在乙腈/水中的。請(qǐng)一定確保您所使用的流動(dòng)相和乙腈/水互溶。由于色譜柱在儲(chǔ)存或運(yùn)輸過(guò)程中可能會(huì)干掉，因此在用流動(dòng)相分析樣品之前，應(yīng)使用10 20 倍柱體積的甲醇或乙腈平衡色譜柱；如果您所使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽，應(yīng)注意用純水" 過(guò)渡 "。硅膠柱或極性色譜柱在經(jīng)過(guò)出廠測(cè)試后是保存在正庚烷中的。如果該色譜柱需要使用含水的流動(dòng)相，請(qǐng)?jiān)谑褂昧鲃?dòng)相之前用乙醇或異丙

18、醇平衡如何平衡色譜柱？平衡過(guò)程中，將流速緩慢地提高用流動(dòng)相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線(xiàn)（緩沖鹽或離子對(duì)試劑度如果較低，則需要較長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)平衡）色譜柱的再生進(jìn)行色譜柱再生時(shí)，應(yīng)使用一個(gè)廉價(jià)的泵，我們建議最好不使用您的高效液相色譜儀上的泵。注意：在對(duì) NH2 改性的色譜柱進(jìn)行再生時(shí)，由于NH2 可能成銨根離子的形式存在，因此應(yīng)該在水洗后用0.1M 的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液完全流出。如果簡(jiǎn)單的有機(jī)溶劑/水的處理不能夠完全洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì)，用0.05M 稀硫酸沖洗非常有效。色譜柱的維護(hù)1 使用預(yù)柱保護(hù)分析柱(硅膠在極性流動(dòng)相/離子性流動(dòng)相中有一定的溶解度)2大多數(shù)反相色譜柱的pH 穩(wěn)定

19、范圍是2 7.5，盡量不超過(guò)該色譜柱的pH 范圍3避免流動(dòng)相組成及極性的劇烈變化4流動(dòng)相使用前必須經(jīng)脫氣和過(guò)濾處理5 如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢柱子沖洗干凈，并保存于/乙腈中6壓力升高是需要更換預(yù)柱的信號(hào)液相色譜的常用術(shù)語(yǔ)1、色譜曲線(xiàn)chromatogram):在色譜法中，當(dāng)樣品加入后，樣品中各組分隨著流動(dòng)相的不斷向前移動(dòng)而在兩相間反復(fù)進(jìn)行溶解、揮發(fā)，或吸附、解吸的過(guò)程。如果各組分在固定相中的分配系數(shù)(表示溶解或吸附的能力)不同，就有可能達(dá)到分離。分配系數(shù)小的組分滯留在固定相中的時(shí)間短，在柱內(nèi)移動(dòng)的速度快，先流出柱子；分配系數(shù)大的組分滯留在固定相中的時(shí)間長(zhǎng)，在柱內(nèi)移動(dòng)

20、的速度慢，后流出柱子；分離后的各組分經(jīng)檢測(cè)器轉(zhuǎn)換成電信號(hào)而記錄下來(lái)，得到一條信號(hào)隨時(shí)間變化的曲線(xiàn)，稱(chēng)為色譜流出曲線(xiàn)或“色譜峰 ”，理想的色譜流出曲線(xiàn)應(yīng)該是正態(tài)分布曲線(xiàn)。2、(色譜)峰(chromatographic peak):色譜柱流出組分通過(guò)檢測(cè)器系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的 響應(yīng)信號(hào)的微分曲線(xiàn)。3、峰底(peak base):峰的起點(diǎn)與終點(diǎn)之間的連接的直線(xiàn)。4、峰高(h , peak height):色譜峰最大值點(diǎn)到峰底的距離。5、峰寬(W , peak width):在峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作切線(xiàn)與峰底相交兩點(diǎn)的距離。6、半高峰寬(W h/2 ， peak withd at half height )：通過(guò)

21、峰高的中點(diǎn)作平行于峰底的直線(xiàn)，此直線(xiàn)與峰兩側(cè)相交兩點(diǎn)之間的距離(圖1 中的 HJ)。7、峰面積(A , peak area):峰與峰底之間的面積(圖 1中的CHEJDC )。8、拖尾峰(tailing peak):后沿較前沿平緩的不對(duì)稱(chēng)的峰。9、前伸峰(leading peak):前沿較后沿平緩的不對(duì)稱(chēng)的峰。(又叫伸舌峰、前延峰)10、假峰(ghost peak):除組分正常產(chǎn)生的色譜峰外，由于儀器條件的變化等原因而在譜圖上出現(xiàn)的色譜峰，即并非由試樣所產(chǎn)生的峰。這種色譜峰并不代表具體某一組分，容易給定性、定量帶來(lái)誤差。(又叫鬼峰)11、畸峰(distrorted peak):形狀不對(duì)稱(chēng)的色譜峰

22、，前伸峰、拖尾峰都屬于這類(lèi)。12、反峰(negative peak):也稱(chēng)倒峰、負(fù)峰，即出峰的方向與通常的方向相反的色譜峰。柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)( 推薦 )色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過(guò)程中，需要注意下列問(wèn)題，以維護(hù)色譜柱。 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過(guò)緩（如前所述）。 . 應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?一般說(shuō)來(lái)色譜柱

23、不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。 選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH）,以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠" 飽和" ，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。 經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí)，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過(guò)渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20 倍左右，即常規(guī)分析需要5075ml。下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再

24、以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴(yán)格脫水。甲醇能洗去殘留的強(qiáng)極性雜質(zhì)，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動(dòng)相不含緩沖液，那么可以省略最后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質(zhì)，在甲醇（乙腈）沖洗時(shí)重復(fù)注射100200 四氫味喃數(shù)次有助于除去強(qiáng)疏水性雜質(zhì)。四氫味喃與乙睛或甲醇的混合溶液能除去類(lèi)脂。有時(shí)也注射二甲亞砜數(shù)次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質(zhì)污染。陽(yáng)離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強(qiáng)的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在

25、固定相表面的有機(jī)物）、甲醇、水依次沖洗。 保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿(mǎn)乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間。 色譜柱使用過(guò)程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。在后兩種情況發(fā)生時(shí)，小心擰開(kāi)柱接頭，用潔凈小鋼勺將柱頭填料取出12mm 高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內(nèi)填料整平。然后用適當(dāng)溶劑濕潤(rùn)的固定相（與柱內(nèi)相同）填滿(mǎn)色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復(fù)到新柱的水平。柱子失效

26、通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（530mm）,可以起到保護(hù)、延長(zhǎng)柱壽命的作用。采用保護(hù)柱會(huì)損失一定的柱效，這是值得的。通常色譜柱壽命在正確使用時(shí)可達(dá)2 年以上 。以硅膠為基質(zhì)的填料，只能在pH29 范圍內(nèi)使用。柱子使用一段時(shí)間后，可能有一些吸附作用強(qiáng)的物質(zhì)保留于柱頂，特別是一些有色物質(zhì)更易看清被吸著在柱頂?shù)奶盍仙稀Ｐ碌纳V柱在使用一段時(shí)間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時(shí)也可補(bǔ)加填料使柱效恢復(fù)。每次工作完后，最好用洗脫能力強(qiáng)的洗脫液沖洗，例如ODS 柱宜用甲醇沖洗至基線(xiàn)平衡。當(dāng)采用鹽緩沖溶液作流動(dòng)相時(shí)，使用完后應(yīng)用無(wú)鹽流動(dòng)相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能

27、會(huì)腐蝕不銹鋼管道，不宜長(zhǎng)期與之接觸。裝在HPLC 儀上柱子如不經(jīng)常使用，應(yīng)每隔45 天開(kāi)機(jī)沖洗 15 分鐘。島津液相操作規(guī)程一、開(kāi)機(jī)操作規(guī)程1 .開(kāi)機(jī)按Power鍵，按以下順序依次開(kāi)啟HPLC系統(tǒng)各設(shè)備的電源：總電源 一泵一柱溫箱2 .脫氣將吸濾頭分別放入流動(dòng)相中，旋轉(zhuǎn)排液閥至180度，啟動(dòng)鍵板上的Purge鍵，排液12min;再按一次Purge鍵停止沖洗操作，關(guān)緊排液閥。3 .設(shè)定參數(shù)按Func鍵依次設(shè)定儀器參數(shù)：流速（或壓力）、壓力最大限、壓力最小限。當(dāng)屏幕顯示 區(qū)閃爍時(shí)，提示可以輸入數(shù)值，按Enter鍵確認(rèn)。在A泵面板上，按 Conc鍵，根據(jù)流動(dòng)相比例，設(shè)置B泵比例。4 .啟動(dòng)流速先按CE鍵顯示初始屏幕，然后按一下Func鍵，屏幕顯示區(qū)閃爍，提示可以輸入數(shù)值，按Enter鍵確認(rèn)。以0.2ml/min的梯度逐步升至所需流速（一般為pml/min）。按Ent