第11章、定量分析技術(shù)

1、生物活性分子的分離與表征第10章、電泳技術(shù)第第1111章、定量分析技術(shù)章、定量分析技術(shù)第12章、組分分析技術(shù)第13章、生物活性測定技術(shù)第第11章、定量分析技術(shù)章、定量分析技術(shù)一、紫外吸收法二、Bradford法三、BCA法四、如何選擇合適的蛋白定量方法物理性質(zhì)：紫外吸收法化學(xué)性質(zhì)：Folin酚試劑法（Lowry法），BCA法（Bicinchoninic acid 法），凱氏定氮法，雙縮脲法（Biuret法），膠體金測定法，等等染色性質(zhì)：考馬斯亮藍(lán)染色法（Bradford法）、銀染法 測定絕對含量應(yīng)用凱氏定氮法（蛋白質(zhì)的含氮量為16）。蛋白質(zhì)的定量分析方法 蛋白質(zhì)在紫外光區(qū)（蛋白質(zhì)在紫外光區(qū)（1

2、90nm-360nm）有兩有兩個強烈吸收峰：個強烈吸收峰：280nm和和190nm。 280nm有吸收的電子所需能量較少，因為這有吸收的電子所需能量較少，因為這些光子存在于芳香環(huán)的共軛雙鍵中，些光子存在于芳香環(huán)的共軛雙鍵中，色氨酸色氨酸(Trp)、和酪氨酸和酪氨酸(Tyr)有芳香環(huán)，可吸收有芳香環(huán)，可吸收280nm波長的光波長的光子，子，苯丙氨酸（苯丙氨酸（Phe）也也有微弱吸收有微弱吸收。蛋白質(zhì)的。蛋白質(zhì)的吸收強度與上述幾種氨基酸的含量有關(guān)，因此吸收強度與上述幾種氨基酸的含量有關(guān)，因此相相同濃度的不同種類蛋白質(zhì)，其同濃度的不同種類蛋白質(zhì)，其280nm的吸收值差的吸收值差別很大別很大(圖圖1)

3、。 一、紫外吸收法圖圖1.1.蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸收光譜蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸收光譜圖圖A A是是1515g /mlg /ml蛋白的吸收光譜。圖蛋白的吸收光譜。圖A A中插圖是中插圖是1 1mg/mlmg/ml的牛免疫球蛋白的牛免疫球蛋白IgG(I)IgG(I)、牛血清白蛋白牛血清白蛋白( (B)B)和白明膠和白明膠( (G)G)的的吸收光譜吸收光譜 圖圖B B是是1010g /ml RNAg /ml RNA和和DNADNA的吸收光譜。的吸收光譜。 280 nm280 nm光吸收法：光吸收法： 根據(jù)吸光值或蛋白質(zhì)摩爾消光系數(shù)的文獻(xiàn)值，可直接計算出樣品溶液中蛋白質(zhì)的濃度。 如果已知某一蛋白質(zhì)在28

4、0 nm處的摩爾消光系數(shù)() ，測定蛋白質(zhì)溶液280 nm吸光值后，根據(jù)公式：c =A/，可直接計算出蛋白質(zhì)濃度。 280 nm280 nm和和260 nm260 nm吸收差法：吸收差法： 若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外線的核酸類物質(zhì)，用280nm來測定蛋白質(zhì)濃度時，會有較大的干擾。由于核酸在210 nm的光吸收比280 nm強，因此可利用280 nm及260nm的吸光值之差來計算蛋白質(zhì)的濃度。常用下列經(jīng)驗式估算： 蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度=1.45 =1.45 A A280nm 280nm - 0.74 - 0.74 A A260nm260nm (mg/(mg/mLmL) ) 假設(shè)1 mg/m

5、L蛋白質(zhì)溶液的A280nm為1。 215 nm215 nm和和225 nm225 nm的吸收差法的吸收差法: : 蛋白質(zhì)的肽鍵在200-250 nm有強的紫外線吸收。其光吸收強弱在一定范圍內(nèi)與濃度成正比，且波長越短，光吸收越強。若選取215 nm可減少干擾及光散射，用215 nm和225 nm吸光值之差與單一波長測定相比，可減少非蛋白質(zhì)成分引起的誤差。因此，對稀溶液中蛋白質(zhì)濃度的測定可用215 nm和225 nm光吸收差法。常用下列經(jīng)驗式估算： 蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度=0.144=0.144（A A215nm 215nm - 0.74 - 0.74 A A225nm225nm） (mg/(mg/

6、mLmL) )優(yōu)點：優(yōu)點：不需添加任何試劑，因而對樣品沒有任何不需添加任何試劑，因而對樣品沒有任何破壞；破壞；測量極其簡單迅速；測量極其簡單迅速；蛋白濃度和吸光度是線性關(guān)系，容易計算。蛋白濃度和吸光度是線性關(guān)系，容易計算。 適合測試純度較高、成分相對單一的蛋白適合測試純度較高、成分相對單一的蛋白質(zhì)。質(zhì)。 缺點：缺點：干擾測定的影響因素多，尤其是干擾測定的影響因素多，尤其是RNA和和DNA在在此波長均此波長均有強吸收有強吸收, 所以一定要考慮樣品中是所以一定要考慮樣品中是否有否有核酸。要得核酸。要得到準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，必須嚴(yán)格到準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，必須嚴(yán)格控制樣品溶液的控制樣品溶液的pH和化學(xué)組成，和

7、化學(xué)組成，使待測樣品和使待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品的實驗條件一致。標(biāo)準(zhǔn)樣品的實驗條件一致。敏感度低，要求樣品的濃度較高，量較大。敏感度低，要求樣品的濃度較高，量較大。用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋白質(zhì)含量時，對于那些與用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋白質(zhì)含量時，對于那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白標(biāo)準(zhǔn)蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，誤差較大。質(zhì)，誤差較大。 蛋白質(zhì)定量方法的改進(jìn)原法 雙縮脲法改進(jìn) Folin-酚試劑法（Lowry法）改進(jìn) BCA法蛋白質(zhì)+CuCu2 2+ + 化合物1+CuCu+ +蛋白質(zhì)+CuCu2 2+ + 化合物1+CuCu+ +CuCu+ + +TyrTyr等等+ +試劑乙試劑乙化

8、合物2蛋白質(zhì)+CuCu2 2+ + 化合物1+CuCu+ +CuCu+ + +BCA化合物2 Lowry 法的改進(jìn)法。法的改進(jìn)法。 堿性條件下，蛋白分子中的肽鍵與堿性條件下，蛋白分子中的肽鍵與Cu2+形形成絡(luò)合物，并成絡(luò)合物，并將將Cu2+還原成還原成Cu+；Cu+與與BCA結(jié)合成紫色復(fù)合物，在結(jié)合成紫色復(fù)合物，在562nm處吸收值與濃度呈處吸收值與濃度呈正比。正比。二、BCA法與Lowry方法相比，BCA法的操作更簡單，試劑更加穩(wěn)定，靈敏度更高（微量檢測可達(dá)到0.5g/ml），應(yīng)用更加靈活?？赡褪芨哌_(dá)5%的表面活性劑。原理：原理：該方法由該方法由Bradford于于1976年建立。年建立。在

9、在酸性條酸性條件件下，考馬斯亮藍(lán)與蛋白下，考馬斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)結(jié)合后最大光吸收波長質(zhì)結(jié)合后最大光吸收波長由由465465nmnm（紅色）紅色）轉(zhuǎn)移為轉(zhuǎn)移為595595nmnm（藍(lán)色），藍(lán)色），起作用的起作用的主要氨基酸是主要氨基酸是ArgArg，另外，另外，His, Lys, Tyr, His, Lys, Tyr, TrpTrp和和PhePhe也有作用。也有作用。2 25 5minmin呈最大光吸收，至呈最大光吸收，至少可穩(wěn)定少可穩(wěn)定1 1小時小時三、考馬斯亮藍(lán)染色法（Bradford法）簡便簡便, 迅速，靈敏度較高。只需要一種反應(yīng)試迅速，靈敏度較高。只需要一種反應(yīng)試劑劑影響因素較少。去污劑和兩

10、性物質(zhì)對測定有影響因素較少。去污劑和兩性物質(zhì)對測定有干擾干擾小于小于3000Da 的多肽無法測定的多肽無法測定蛋白濃度高時非線性蛋白濃度高時非線性配制的染色液需過濾除去未溶解的考馬斯亮配制的染色液需過濾除去未溶解的考馬斯亮藍(lán)藍(lán)G250實驗操作步驟實驗操作步驟 室溫室溫放置放置5分鐘后測分鐘后測595nm的光吸。的光吸?？捡R斯亮藍(lán)染料極易吸附于比色皿壁，每次測量后應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)染料極易吸附于比色皿壁，每次測量后應(yīng)用乙醇乙醇洗滌后，用雙蒸水清洗。洗滌后，用雙蒸水清洗。注意混勻，但不要劇烈震蕩。注意混勻，但不要劇烈震蕩。 管號 0 1 2 3 4 5 6 7 標(biāo)準(zhǔn)蛋白 ul 0 10 20 40 6

11、0 80 100 0 蒸餾水 ul 100 90 80 60 40 20 0 0 待測蛋白 ul - - - - - - - 100 Bradford 試劑 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml A595 四、如何選擇合適的蛋白定量方法？定性分析（如純化過程中）：可以使用簡單、快捷的紫外吸收法；定量分析（蛋白純品、雙向電泳、west-blot等）：使用精度高的Bradford法或BCA法。Bradford法法BCA法法檢測限0.5g0.5g檢測時間30 min去污劑耐受范圍SDS0.01%Triton X-1000.05%Tween 20, 60, 800.015%5

12、% SDS5% Triton X-1005% Tween 20, 60, 80還原劑耐受范圍1M -巰基乙醇5mM二硫蘇糖醇-巰基乙醇0.01%二硫蘇糖醇1 mM檢測值穩(wěn)定時長1 h顏色會隨著時間的延長不斷加深其他染色液易沾染比色皿，最好使用一次性比色皿。EDTA10mM不能含有EGTABradford法和BCA法的選擇注意事項1、由于各種方法測定原理不同，所以同時使用幾、由于各種方法測定原理不同，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度可能會有較大差種方法對同一樣品得出的樣品濃度可能會有較大差異。異。 2、即使是用同一種比色法測定同一樣品，選擇的、即使是用同一種比色法測定同一樣品，選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致，測試后的濃度也不一致。因此，標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致，測試后的濃度也不一致。因此，在選擇比色法之前，最好是參照要測試的樣本的化在選擇比色法之前，最好是參照要測試的樣本的化學(xué)構(gòu)成，學(xué)構(gòu)成，尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)