UV三點校正法測定維生素A的含量

1、UV三點校正法測定維生素三點校正法測定維生素A的含量的含量王宇 石慧l維生素A的結(jié)構(gòu)為具有一個共軛多烯醇側(cè)鏈的環(huán)己烷，由于其中有多個不飽和鍵，性質(zhì)不穩(wěn)定，易被空氣中氧或氧化劑氧化，易被紫外光裂解，并且其對酸不穩(wěn)定。其醋酸酯比維生素A穩(wěn)定，臨床使用一般將本品或棕櫚酸酯溶于植物油中應(yīng)用。因此，維生素A及其制劑除需密封在涼暗處保存外，還需充氮或加入合適的抗氧劑。l維生素A與氯仿、乙醚、環(huán)己烷或石油醚能任意混合，在乙醇中微溶，在水中不溶一、目的掌握UV三點校正法的原理和維生素A含量測定的方法。二、主要儀器和試劑紫外分光光度儀（具掃描功能），100ml容量瓶，燒杯若干個，維生素A膠丸（規(guī)格2.5萬單位/

2、粒）環(huán)己烷，乙醚三、實驗原理l本法是在三個波長處測得吸收度，根據(jù)校正公式計算吸收度A校正值后，再計算含量，故本法稱為“三點校正法”。該原理主要基于（1）雜質(zhì)的無關(guān)吸收在310nm340nm的波長范圍內(nèi)幾乎呈一條直線，且隨波長的增長吸收度下降。（2）物質(zhì)對光吸收呈加和性的原理。即在某一樣品的吸收曲線上，各波長處的吸收度是維生素A與雜質(zhì)吸收度的代數(shù)和，因而吸收曲線也是二者的疊加。 四、實驗過程l精密稱取20粒膠丸2.4641g，破殼取內(nèi)容物，乙醚洗凈膠丸殼并稱量得總殼重0.7213g。l精密稱取內(nèi)容物0.0048g（915單位/ml范圍內(nèi)）于小燒杯，用少量環(huán)己烷溶解后轉(zhuǎn)移入100ml容量瓶，再用環(huán)

3、己烷定容至100ml。l先在紫外分光光度計下掃描出樣品溶液在200400nm范圍內(nèi)的吸收度曲線，確定最大吸收波長。然后分別在300nm,316nm,328nm,340nm,360nm五個波長下測定吸收度。計算l 求 ：由 A= CL，l 求得 =A/（CL）。l 求效價（IU/g）：效價系指每克供試品中所含維生素A的國際單位數(shù)（IU/g）。 即IU/g= 1900。 l 求維生素A占標(biāo)示量的百分含量： 標(biāo)示量%=（AD1900W100%）/ （W100L標(biāo)示量）100%。A值的選擇l首先計算吸收度比值（即Ai/A328）l 如果最大吸收波長在326nm329nm之間，并分別計算5個波長下的差值

4、，均不得超過0.02時，則不用校正公式計算吸收度，而直接用328nm處測得的吸收度A328求得。l 如果最大吸收波長在326nm329nm之間，并分別計算5個波長下的差值，如有一個或幾個超過0.02，這時應(yīng)按以下方法判斷：l 若A328（校正）與A328的吸收度相差不超過3.0%，則不用校正吸收度，仍以未經(jīng)校正的A328求得 。l 若A328（校正）與A328的吸收度相差在 -15%-3%之間，則以A328（校正）得 。l 若A328（校正）與A328的吸收度相差小于-15%或大于+3%，則不能用本法測定，而應(yīng)用第二法（皂化法）測定含量。l 如果最大吸收波長不在326nm329nm之間，也不能

5、用本法測定，而應(yīng)用第二法（皂化法）測定含量。l第一法校正公式：A328(校正)=3.52(2A328-A316-A340)維生素A吸收度差值l由掃描結(jié)果得最大吸收波長為327.7nm（326329nm）l各個差值均不超過0.02，不需用校正公式。故直接用A328進(jìn)行計算。l （328）= A328 /（100ms/D） =0.746/(1000.0048/100)=155.42l效價= 1900=155.421900=295298l標(biāo)示量%=(AD1900W)/(W100L標(biāo)示量) 100%=(0.74610019000.08714)/(0.0048 100125000) 100%=102.9

6、%二法：l方法：精密稱取一定量供試品，加氫氧化鉀乙醇溶液后煮沸回流，得到的皂化液再經(jīng)乙醚提取、洗滌、濾過、濃縮和干燥等處理，最后用異丙醇溶解殘渣并稀釋成每1ml中含維生素A為915單位的溶液，在300、310、325、334波長處測定吸光度，并確定最大吸收波長。計算同第一法，換算因子為1830。l二法校正公式：A325（校正）=6.815A3252.5553104.260A334 實驗報告實驗報告 檢品名稱：維生素A膠丸 批號 050831 規(guī)格 2.5萬單位/粒l原理：本法是在三個波長處測得吸收度， 根據(jù)校正公式計算吸收度A校正值后，再計算含量，故本法稱為“三點校正法”。雜質(zhì)的無關(guān)吸收在31

7、0nm340nm的波長范圍內(nèi)幾乎呈一條直線，且隨波長的增長吸收度下降。物質(zhì)對光吸收呈加和性的原理。即在某一樣品的吸收曲線上，各波長處的吸收度是維生素A與雜質(zhì)吸收度的代數(shù)和，因而吸收曲線也是二者的疊加。l結(jié)果：測得本品含量為標(biāo)示量的102.9%。l結(jié)論：符合規(guī)定（95.0%105.0%）。討論：l1、維生素A具有紫外吸收特征，在325nm328nm的范圍內(nèi)有最大吸收；并且，它能與三氯化銻試劑作用，產(chǎn)生不穩(wěn)定的藍(lán)色。故可利用這些性質(zhì)對其進(jìn)行鑒別和含量測定。l2、維生素A醋酸酯的吸收度校正公式是用直線方程式法（即代數(shù)法）推導(dǎo)而來；維生素A醇的吸收度校正公式是用相似三角形法（幾何法或稱6/7定位法）推

8、導(dǎo)而來。 l3、在應(yīng)用三點校正法時，除其中一點在最大吸收波長處測定外，其余兩點均在最大吸收峰的兩側(cè)進(jìn)行測定。如果儀器波長精度不準(zhǔn)確時，會產(chǎn)生較大誤差。因此，在測定前務(wù)必要校正波長，并可用全反式維生素A進(jìn)行測定，比較測定結(jié)果和比值是否與對照品相符合，以進(jìn)一步核對儀器波長是否準(zhǔn)確。測定的樣品應(yīng)不得少于兩份。l4、本組在對維生素A含量測定實驗中出現(xiàn)過一些問題。第一次用一法測定結(jié)果不符合規(guī)定，按照要求應(yīng)該用二法測定。但分析原因后，我們重新做了一遍，用一法測定取得了較好結(jié)果，所給維生素A含量符合規(guī)定。l我們發(fā)現(xiàn)第一次實驗失敗的原因是：紫外分光光度計出現(xiàn)了問題，波長不準(zhǔn)確，從而導(dǎo)致在相應(yīng)波長下測得的吸收度

9、不準(zhǔn)確?？梢妰x器波長的準(zhǔn)確與否在實驗中是致關(guān)重要的。整個操作過程沒有進(jìn)行暗室操作，在光照下暴露了較長時間，而維生素A不穩(wěn)定，見光易變質(zhì)，所以導(dǎo)致測定含量不準(zhǔn)。l另外，在操作中應(yīng)注意： 在含量測定時膠殼要盡量洗干凈，避免內(nèi)容物殘留，使粒重盡量準(zhǔn)確。 由于所取的樣品量非常小，所以用于收集樣品的小燒杯一定要用溶劑洗滌多次并合并入容量瓶中，容量瓶口也要沖洗使樣品全部轉(zhuǎn)入。 在測定不同波長下的吸收度時每一次都要用空白液進(jìn)行調(diào)零。l5、其他維生素A含量測定方法：lA 三氯化銻比色法l（1）原理：維生素A與三氯化銻的無水氯仿溶液作用，產(chǎn)生不穩(wěn)定的藍(lán)色，在618nm620nm的波長處有最大吸收，符合Beer定律。l（2）方法：取維生素A對照品，制成系列濃度的氯仿溶液，加入一定量的三氯化銻氯仿溶液，在5s10s內(nèi)，于620nm的波長處測定吸收度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按同法測定供測品溶液的吸收度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量。lB 高效液相色譜法 采用RP-HPLC法同時測定人血清中維生 素 A和維生素E的含量。 l維生素A的含量用生物效價即國際單位（IU/g）來表示。維生素A的國際單位規(guī)定如下：1IU=0.344ug維生素A醋酸酯；1IU=0.300ug維生素A醇。l每1g維生素A醋酸酯相當(dāng)?shù)膰H單位數(shù)為：1106/(