肝膽排泄轉(zhuǎn)運(yùn)體講訴課件

1、藥物藥物(yow)排泄的研究進(jìn)展排泄的研究進(jìn)展講演(jingyn)人：王婷婷2014年4月第一頁(yè)，共三十三頁(yè)。目目 錄錄第二頁(yè)，共三十三頁(yè)。（一）藥物排泄（一）藥物排泄(pixi)途徑途徑排泄途徑排泄途徑排泄物收集法排泄物收集法腎 臟大鼠代謝籠法、導(dǎo)尿管法、膀胱造瘺法、輸尿管法膽 汁膽總管插入法乳 汁乳頭按摩收集唾 液腮腺與頜下腺插管收集呼 氣密封代謝籠吸收劑收集汗 腺第三頁(yè)，共三十三頁(yè)。（二）轉(zhuǎn)運(yùn)體的分類（二）轉(zhuǎn)運(yùn)體的分類(fn li)第四頁(yè)，共三十三頁(yè)。第五頁(yè)，共三十三頁(yè)。轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)典型底物典型底物血血管管側(cè)側(cè)膜膜Na+ -?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)多肽(NTCP)膽汁酸；膽鹽；膽汁

2、酸類似物雌酮-3-硫酸有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（OATs）陰離子化合物、中性類固醇、生理物質(zhì)(如前列腺素類和甲狀腺激素)和某些B類疏水性陽(yáng)離子前列腺素E2,5-氟尿嘧啶、紫杉酚、茶堿有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（OATPs）雌二醇-17-葡糖醛酸、雌酮-3-硫酸、羅舒伐他汀、非索非那定、替米沙坦有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（OCTs）有機(jī)陽(yáng)離子藥物及內(nèi)源性物質(zhì)(膽堿、胍等)撲熱息痛葡萄糖醛酸苷、MPP+、四乙胺、胍丁胺（三）肝臟（三）肝臟(gnzng)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體第六頁(yè)，共三十三頁(yè)。轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)典型底物典型底物膽膽管管側(cè)側(cè)膜膜P-糖蛋白(P-gp)脂溶性較高的陽(yáng)性或中性藥物多柔比星、 長(zhǎng)春新堿、

3、紅霉素、塞利洛爾、地西泮等多藥耐藥相關(guān)蛋白2(MRP2 )陰離子化合物及共軛代謝物普伐他汀、替莫普利拉、甲氨蝶呤、多柔比星、順鉑膽酸鹽外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（BSEP）未共扼結(jié)合的膽酸鹽?；悄懰猁}、甘氨膽酸鹽、膽酸鹽、牛磺石膽酸、?；蛆Z去氧膽酸鹽、?；敲撗跄懰猁}、牛熊去氧膽酸鹽和他莫昔芬 乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）某些藥物的膽汁排泄多種抗癌藥如甲基蝶呤、多柔比星等（三）肝臟（三）肝臟(gnzng)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體第七頁(yè)，共三十三頁(yè)。一、體內(nèi)試驗(yàn) 基因(jyn)缺陷動(dòng)物模型先天遺傳性基因(jyn)缺陷模型基因(jyn)敲除模型二、體內(nèi)/體外試驗(yàn) 肝臟灌流技術(shù)離體肝臟灌流在體肝臟灌流（四）研究肝臟藥物轉(zhuǎn)

4、運(yùn)體的常用方法（四）研究肝臟藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的常用方法第八頁(yè)，共三十三頁(yè)。三、體外試驗(yàn)(shyn)非洲(fi zhu)爪蟾卵母細(xì)胞：cRNA注射單轉(zhuǎn)染細(xì)胞(xbo)：HEK293雙轉(zhuǎn)染細(xì)胞：Hela、MDCK-、LLC-PK1CMVs（微管膜囊泡）實(shí)驗(yàn)四、RT-PCR技術(shù)半定量測(cè)蛋白表達(dá) Western Blot技術(shù)定量測(cè)蛋白表達(dá) （四）研究肝臟藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的常用方法（四）研究肝臟藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的常用方法第九頁(yè)，共三十三頁(yè)。（五）文獻(xiàn)（五）文獻(xiàn)(wnxin)研究研究頭孢妥侖（頭孢妥侖（CDRT）膽汁排泄的分子）膽汁排泄的分子(fnz)機(jī)制及機(jī)制及其對(duì)肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)節(jié)作用的研究其對(duì)肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)節(jié)作用的研究

5、第十頁(yè)，共三十三頁(yè)。一、實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)(shyn)目的目的頭孢妥侖轉(zhuǎn)運(yùn)體(Mrp2、Bcrp或P-gp)？轉(zhuǎn)運(yùn)(zhun yn) 頭孢妥侖？影響(yngxing)(Mrp2、Bcrp或P-gp)蛋白表達(dá)第十一頁(yè)，共三十三頁(yè)。在體肝灌流CDRT+抑制劑CDRT出口灌流液膽汁肝攝取率膽汁累積排泄率抑制劑是否影響肝攝?。哭D(zhuǎn)運(yùn)體參與膽汁排泄大鼠口服不同濃度CDRT一周肝組織總RNART-PCR各轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)情況膜蛋白Western Blot證實(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)情況HPLC二、實(shí)驗(yàn)二、實(shí)驗(yàn)(shyn)思路思路第十二頁(yè)，共三十三頁(yè)。三、實(shí)驗(yàn)三、實(shí)驗(yàn)(shyn)材料材料實(shí)驗(yàn)(shyn)動(dòng)物Wistar大鼠，

6、雄性，體重(tzhng)230250g主要試劑頭孢妥侖標(biāo)準(zhǔn)品等主要儀器肝灌流儀，HPLC等第十三頁(yè)，共三十三頁(yè)。肝臟的血液供應(yīng)非常豐富，接受兩種來(lái)源的血供。（1）門靜脈。主要接受來(lái)自胃腸和脾臟的血液；（2）腹腔動(dòng)脈的分支肝動(dòng)脈。門靜脈與肝動(dòng)脈進(jìn)入肝臟后，反復(fù)分支，在肝小葉(xioy)周圍形成小葉(xioy)間動(dòng)脈和小葉(xioy)間靜脈進(jìn)入肝血竇中，再經(jīng)中央靜脈注入肝靜脈。四、實(shí)驗(yàn)四、實(shí)驗(yàn)(shyn)方法方法1.肝灌流肝灌流(un li)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)第十四頁(yè)，共三十三頁(yè)。肝灌流裝置肝灌流裝置=灌流系統(tǒng)灌流系統(tǒng)+ 恒溫恒溫(hngwn)系統(tǒng)系統(tǒng)+氣體交換系氣體交換系統(tǒng)統(tǒng)第十五頁(yè)，共三十三頁(yè)。1.1.

7、實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)相關(guān)溶液的配制相關(guān)溶液的配制 (1)抗凝緩沖液的配制 枸櫞酸三鈉 15.6g 枸椽酸 5.7g ddH2O 600m1(2)磷酸鹽緩沖液(PBS)的配制(pizh) NaCl(58.44) 8.0g KCl(74.55) 0.2g Na2HPO4.12H2O(358.14) 2.9g KH2PO4(136.09) 加dd H2O 1000ml 調(diào)pH 7.4 with HCl第十六頁(yè)，共三十三頁(yè)。(3)灌流(un li)緩沖液的配制NaCl(58.44) 118mM 6.9gKCl(74.55) 4.7 mM 0.35gMgSO4.7H2O(246.27) 1.2 mM 0

8、.30gKH2PO4(136.09) 1.2 mM 0.16gNaHCO3(84.01) 25 mM 2.10gGlu(198.17) 5 mM 0.96gCaCl2(110.99) 2.5 mM 0.28g加ddH2O 1000m1調(diào)pH 7.4 with NaOH第十七頁(yè)，共三十三頁(yè)。1.2灌流所需的牛血紅細(xì)胞制備灌流所需的牛血紅細(xì)胞制備 (1) 3 L新鮮牛血與600m1抗凝緩沖液混勻，過濾，三層紗布置于大漏斗中。使牛血貼壁流下，以免紅細(xì)胞因機(jī)械外力被破碎; (2)離心,5000rpm, l0min, 4 ，將上層的血漿、血小板和白細(xì)胞棄去，下層為牛血紅細(xì)胞; (3)加入等體積的磷酸鹽緩

9、沖液(PBS),混勻，離心，3000rpm, l0min,4 ，清洗紅細(xì)胞，棄上清; (4)重復(fù)步驟(3)3次，收集(shuj)下層干凈的牛血紅細(xì)胞，4保存，備灌流時(shí)使用。第十八頁(yè)，共三十三頁(yè)。1.3.原位肝灌流法原位肝灌流法 (1)灌流室預(yù)熱，使溫度達(dá)37;將牛血紅細(xì)胞與灌流緩沖液混勻，使紅細(xì)胞的終濃度為20%，作為灌流液。設(shè)立對(duì)照組(頭孢妥侖(1 uM)和實(shí)驗(yàn)組(頭孢妥侖(1 uM)和不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的特異性抑制劑(20 uM)，具體研究如下。把灌流緩沖液和含藥的灌流液放入水浴鍋中加熱(ji r)至37 ，同時(shí)供氧;第十九頁(yè)，共三十三頁(yè)。第二十頁(yè)，共三十三頁(yè)。 (2) Wistar雄性大鼠于實(shí)

10、驗(yàn)前夜禁食(不禁水)，烏拉坦麻醉，腹部U型開口，將內(nèi)臟移至右側(cè)，剝離并充分暴露門靜脈、下腔靜脈、右腎動(dòng)靜脈和膽管; (3)膽管插管，固定，此時(shí)可見膽汁緩慢流出; (4)門靜脈插管，固定，用預(yù)熱的灌流緩沖液灌流肝臟，流速為12m1/min; (5)迅速剪斷下腔靜脈腹腔(fqing)段，沖去肝臟內(nèi)原有的血液，結(jié)扎右腎動(dòng)靜脈;第二十一頁(yè)，共三十三頁(yè)。 (6)迅速打開胸腔，右心耳插管，使液體緩慢流出; (7)肝臟平衡l0min后，實(shí)驗(yàn)組用含抑制劑(20 uM)的灌流液灌流5min，再換含頭孢妥侖(1 uM)和抑制劑(20 uM)的灌流液灌流;對(duì)照組用含等體積的抑制劑溶劑的灌流液灌流5min，再換含頭孢

11、妥侖(1uM)和等體積的抑制劑溶劑的灌流液灌流肝臟; (8)于0.5、1、3、 10、15、20、25、30min收集出口灌流液; (9)于5, 15, 25min收集膽汁樣品; (10)高效液相色譜法測(cè)定頭孢妥侖含量(hnling)，考察肝攝取率和膽汁累積排泄率的差別。肝臟攝取率 EH=1-Cin/Cout 膽汁中藥物濃度膽汁體積(tj) 灌流液中藥物濃度灌流速度灌流時(shí)間膽汁(dnzh)累積排泄率= 第二十二頁(yè)，共三十三頁(yè)。1.4.高效液相色譜法測(cè)定樣品中頭孢妥侖的含量高效液相色譜法測(cè)定樣品中頭孢妥侖的含量(1)色譜條件 色譜柱:Capcell pak C18 UG120 4.6X250mm

12、(日本資生堂); 流動(dòng)相:0.1%醋酸銨:甲醇(65: 35); 流速:0.8 ml/min; 檢測(cè)波長(zhǎng)(bchng):295nm; 進(jìn)樣器溫度:4; 進(jìn)樣體積:25 ul第二十三頁(yè)，共三十三頁(yè)。 (2)出口灌流液樣品預(yù)處理 離心(lxn)，3000 rpm, 5 min, 4 ，取上清液90 ul置新的Ep管，加內(nèi)標(biāo)(25 ug/ml)10 ul,混勻，再加入甲醇200 u1,混勻，離心12000 rpm,15 min,4 。取上清液100 u1進(jìn)樣; (3)膽汁樣品預(yù)處理 取膽汁樣品10 ul，加30 u1 ddHzO，內(nèi)標(biāo)l0 ul,混勻，加50 u1甲醇，混勻，離心，12000rpm,

13、 15 min, 4 。取上清液70 u1進(jìn)樣。第二十四頁(yè)，共三十三頁(yè)。2.頭孢妥侖對(duì)肝臟Mrp2,Bcrp,P-gp,Oct1和Oat2 mRNA表達(dá)的影響RT-PCR3.證實(shí)頭孢妥侖對(duì)肝臟Mrp2蛋白(dnbi)表達(dá)情況Western Blot五、實(shí)驗(yàn)五、實(shí)驗(yàn)(shyn)結(jié)果結(jié)果1.肝灌流(un li)實(shí)驗(yàn)1.1肝攝取率肝攝取率 加入抑制劑不影響CDRT的肝攝取第二十五頁(yè)，共三十三頁(yè)。第二十六頁(yè)，共三十三頁(yè)。1.2膽汁累積排泄率膽汁累積排泄率 Mrp2和Bcrp參與CDRT膽汁排泄 P-gp不參與第二十七頁(yè)，共三十三頁(yè)。2.RT-PCR Mrp2、Bcrp和Oat2的mRNA上調(diào) P-gp

14、和Oct1的mRNA下調(diào)第二十八頁(yè)，共三十三頁(yè)。3. Western Blot CDRT對(duì)Mrp2蛋白表達(dá)的影響有劑量依賴性第二十九頁(yè)，共三十三頁(yè)。謝 謝 大 家！2014年4月第三十頁(yè)，共三十三頁(yè)。人有了知識(shí)，就會(huì)具備各種分析能力，明辨是非的能力。所以我們要勤懇讀書，廣泛閱讀，古人說“書中自有黃金屋?！蓖ㄟ^閱讀科技書籍，我們能豐富知識(shí)，培養(yǎng)邏輯思維能力；通過閱讀文學(xué)作品，我們能提高文學(xué)鑒賞水平，培養(yǎng)文學(xué)情趣；通過閱讀報(bào)刊，我們能增長(zhǎng)(zngzhng)見識(shí)，擴(kuò)大自己的知識(shí)面。有許多書籍還能培養(yǎng)我們的道德情操，給我們巨大的精神力量，鼓舞我們前進(jìn)。第三十一頁(yè)，共三十三頁(yè)。第三十二頁(yè)，共三十三頁(yè)。肝膽排泄轉(zhuǎn)運(yùn)體講訴內(nèi)容(n