多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增DNA片段

1、 課題課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增DNA片段片段自學(xué)提綱：知識回顧：知識回顧：1.DNA分子的結(jié)構(gòu)（外側(cè)、內(nèi)側(cè)、基本單位）；分子的結(jié)構(gòu)（外側(cè)、內(nèi)側(cè)、基本單位）；2. DNA復(fù)制過程和特點；復(fù)制過程和特點；3.PCR技術(shù)概念及應(yīng)用。技術(shù)概念及應(yīng)用。基本概念：變性、復(fù)性、基本概念：變性、復(fù)性、Taq DNA聚合酶、引物聚合酶、引物理解理解PCR技術(shù)的原理技術(shù)的原理掌握掌握PCR技術(shù)的全過程技術(shù)的全過程比較比較PCR技術(shù)和體內(nèi)技術(shù)和體內(nèi)DNA復(fù)制的異同點。復(fù)制的異同點。1、DNA分子的分子的3 端與端與5 端端-OH端為端為3 ; 磷酸基團的末端為磷酸基團的末端為5 。2、DNA分子由

2、兩條分子由兩條反向平行反向平行的脫氧核苷的脫氧核苷酸鏈根據(jù)酸鏈根據(jù)堿基互補配對原則堿基互補配對原則形成形成氫鍵氫鍵連接連接而成。而成。解旋酶解旋酶DNA母鏈母鏈4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸DNA聚合酶聚合酶引物（引物（ RNA）打開打開DNA雙鏈雙鏈模板模板合成子鏈原料合成子鏈原料催化子鏈合成催化子鏈合成使使DNA聚合酶能從聚合酶能從引物引物3端開始連接端開始連接脫氧核苷酸脫氧核苷酸 思考：思考：3、是什么？是什么？ 體外擴增體外擴增DNA 如何提供相似環(huán)境？如何提供相似環(huán)境？ 變性（變性（ 80-100 ）Taq聚合酶（耐高溫）聚合酶（耐高溫）1530個核苷酸構(gòu)個核苷酸構(gòu)成成DNA或或RNAD

3、NA雙鏈雙鏈單鏈單鏈變性（加熱變性（加熱94左右左右 ）復(fù)性（緩慢冷卻）復(fù)性（緩慢冷卻）4、DNA 分子的熱變性原理：分子的熱變性原理：變性的目的：變性的目的：復(fù)性的目的：復(fù)性的目的：解開雙鏈解開雙鏈有利于引物有利于引物和引物和引物與兩條單與兩條單鏈的結(jié)合鏈的結(jié)合一 、PCR技術(shù)的原理利用利用DNA分子的分子的熱變性熱變性原理，通過控原理，通過控 制制溫度溫度來控制雙鏈的來控制雙鏈的解聚解聚與與結(jié)合，結(jié)合，從而從而完成完成體外體外DAN分子的擴增分子的擴增。體外體外DNA復(fù)制的條件：復(fù)制的條件： 四種脫氧核四種脫氧核苷酸、耐高溫的聚合酶、引物、苷酸、耐高溫的聚合酶、引物、 模板；模板；緩沖溶液

4、和嚴(yán)格控制溫度的溫控設(shè)備。緩沖溶液和嚴(yán)格控制溫度的溫控設(shè)備。復(fù)制的方向：復(fù)制的方向：子鏈的子鏈的5 端向端向 3端延端延伸。伸。二、二、PCRPCR的反應(yīng)過程的反應(yīng)過程每個循環(huán)包括：每個循環(huán)包括：變性變性 復(fù)性復(fù)性延伸延伸 從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也可以作為模板參與反應(yīng)，并且產(chǎn)物也可以作為模板參與反應(yīng)，并且由由引物引物延伸而成的延伸而成的DNADNA單鏈會與引物單鏈會與引物結(jié)合，進行結(jié)合，進行DNADNA的延伸，的延伸，這樣，這樣，DNADNA聚合聚合酶只能特異性地復(fù)制酶只能特異性地復(fù)制處于兩個引物之間處于兩個引物之間的的DNADNA序列序列，使這段固定

5、長度的序列，使這段固定長度的序列呈呈指數(shù)擴增指數(shù)擴增。三、實驗步驟：三、實驗步驟：準(zhǔn)備準(zhǔn)備好好PCR反應(yīng)體系的配方反應(yīng)體系的配方用微量用微量移液移液器按配方在往微量器按配方在往微量離心管中加入各組分離心管中加入各組分蓋嚴(yán)蓋子，用手指輕輕彈擊蓋嚴(yán)蓋子，用手指輕輕彈擊管壁管壁混合混合反應(yīng)液反應(yīng)液離心離心10分鐘分鐘將離心管放入將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好儀上，設(shè)置好循環(huán)程序進行循環(huán)程序進行反應(yīng)反應(yīng)注意事項：詳見操作提示注意事項：詳見操作提示 四、結(jié)果分析與評價四、結(jié)果分析與評價DNA 含量的測定：稀釋含量的測定：稀釋對照調(diào)零對照調(diào)零測定測定計算（公式見計算（公式見P63）波長波長260nm處讀數(shù)

6、處讀數(shù)蒸餾水蒸餾水做對照做對照50倍倍PCRPCR技術(shù)與體內(nèi)技術(shù)與體內(nèi)DNADNA復(fù)制的區(qū)別：復(fù)制的區(qū)別： 1. 1. PCRPCR不需要解旋酶；體內(nèi)不需要解旋酶；體內(nèi)DNADNA復(fù)制復(fù)制需要；需要； 2. 2. PCRPCR需要耐熱的需要耐熱的DNADNA聚合酶（常用聚合酶（常用TaqDNATaqDNA聚合酶），而生物體內(nèi)的聚合聚合酶），而生物體內(nèi)的聚合酶在高溫時會變性；酶在高溫時會變性； 3. 3. PCRPCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，而一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，而生物體內(nèi)生物體內(nèi)DNADNA復(fù)制需要生物體自身的復(fù)復(fù)制需要生物體自身的復(fù)制。制。 練習(xí)鞏固練習(xí)鞏固1、關(guān)于、關(guān)于PCR技術(shù)的應(yīng)用

7、，錯誤的一項是技術(shù)的應(yīng)用，錯誤的一項是A 古生物學(xué)、刑偵破案、古生物學(xué)、刑偵破案、DNA序列測定序列測定B 診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學(xué)診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學(xué)C DNA序列測定、基因克隆、刑偵破案序列測定、基因克隆、刑偵破案D 診斷遺傳疾病、合成核苷酸、診斷遺傳疾病、合成核苷酸、DNA序列測定序列測定2、DNA的合成方向總是從子鏈的哪一端向的合成方向總是從子鏈的哪一端向哪一端延伸？哪一端延伸？3、PCR技術(shù)最突出的優(yōu)點是技術(shù)最突出的優(yōu)點是A 原理簡單原理簡單 B 原料易找原料易找C TaqDNA聚合酶有耐熱性聚合酶有耐熱性D 快速、高效、靈活、易于操作快速、高效、靈活、易于操作4、做、做PCR使用的