基因工程大實(shí)驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 一、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備一、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 二、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化二、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 一、堿變性法抽提質(zhì)粒一、堿變性法抽提質(zhì)粒DNA實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 四、四、DNA的純度、濃度及分子量的測定的純度、濃度及分子量的測定實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 五、五、DNA的酶切、連接與轉(zhuǎn)化的酶切、連接與轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 六、動物基因組六、動物基因組DNA的提取和檢測的提取和檢測實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 七、植物基因組七、植物基因組DNA的提取和檢測的提取和檢測實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 八、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)八、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)-隨機(jī)擴(kuò)增隨機(jī)擴(kuò)增 多態(tài)性多態(tài)性DNA分析分析實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康南嚓P(guān)知識及原理相關(guān)知識及

2、原理儀器、材料和試劑儀器、材料和試劑操作步驟操作步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果儀器、材料和試劑儀器、材料和試劑v儀器儀器 瓊脂糖凝膠電瓊脂糖凝膠電 泳系統(tǒng)泳系統(tǒng) 凝膠成像系統(tǒng)凝膠成像系統(tǒng) 紫外紫外- -可見分光光可見分光光 度計(jì)度計(jì)v材料材料 pUC18pUC18v試劑試劑 DNA MarkerDNA Marker TAE/TBE TAE/TBE緩沖液緩沖液 點(diǎn)樣緩沖液點(diǎn)樣緩沖液 溴化乙錠（溴化乙錠（EBEB） 瓊脂糖瓊脂糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果v l ll l操作步驟操作步驟vDNADNA分子量測定分子量測定 （1 1）瓊脂糖凝膠的制備）瓊脂糖凝膠的制備 取取0.7g 0.7g 瓊脂糖，放入錐形瓶中，加瓊脂

3、糖，放入錐形瓶中，加100ml 100ml 0.5 0.5倍倍TBE/TAETBE/TAE緩沖液，置微波爐加熱至完全溶緩沖液，置微波爐加熱至完全溶 化，取出搖勻，則為化，取出搖勻，則為0.7%0.7%瓊脂糖凝膠。待凝膠瓊脂糖凝膠。待凝膠 冷卻至冷卻至60 60 ，加入，加入EBEB，使終濃度為，使終濃度為0.5g/ml0.5g/ml。 （2 2）膠板的制備）膠板的制備 將有機(jī)玻璃內(nèi)槽、梳子等洗凈烘干。將有機(jī)玻璃內(nèi)槽、梳子等洗凈烘干。 將有機(jī)玻璃放置于凝膠槽內(nèi)，并放好梳子。將有機(jī)玻璃放置于凝膠槽內(nèi)，并放好梳子。 將將6060左右的瓊脂糖凝膠液緩慢而連續(xù)地左右的瓊脂糖凝膠液緩慢而連續(xù)地 倒入有機(jī)玻

4、璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層 均勻的膠板（注意：若有氣泡產(chǎn)生，用小槍頭吸均勻的膠板（注意：若有氣泡產(chǎn)生，用小槍頭吸出）。出）。 待膠凝固后，取出梳子（豎直、迅速待膠凝固后，取出梳子（豎直、迅速 拔出），取有機(jī)玻璃內(nèi)槽（帶膠板），放在拔出），取有機(jī)玻璃內(nèi)槽（帶膠板），放在 電泳槽內(nèi)。電泳槽內(nèi)。 加電泳緩沖液至稍沒過膠面（不要太加電泳緩沖液至稍沒過膠面（不要太 多或太少）。多或太少）。 （3 3）加樣）加樣 用移液槍將樣品用移液槍將樣品DNADNA與上樣緩沖液混勻。與上樣緩沖液混勻。 操作步驟操作步驟 將吸有混合液的槍頭緩慢插入加樣孔液面將吸有混合液的

5、槍頭緩慢插入加樣孔液面 以下，緩慢將液體加入（注意：加樣后槍頭離開以下，緩慢將液體加入（注意：加樣后槍頭離開 液面后再松開槍）。液面后再松開槍）。 注意：記錄點(diǎn)樣順序及點(diǎn)樣量注意：記錄點(diǎn)樣順序及點(diǎn)樣量 （4 4）電泳）電泳 接通電泳槽與電泳儀的電源（接通電泳槽與電泳儀的電源（DNADNA帶負(fù)電）。帶負(fù)電）。 當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動到距膠前沿當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動到距膠前沿12cm12cm處，停處，停 止電泳。止電泳。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 八、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)八、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNADNA分析分析實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)掌握PCR反應(yīng)的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)學(xué)習(xí)掌握PCR儀的使用方法相關(guān)知識

6、及原理相關(guān)知識及原理 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain polymerase chain reaction,PCRreaction,PCR）的原理類似于）的原理類似于DNADNA的天然復(fù)的天然復(fù) 制過程。在待擴(kuò)增的制過程。在待擴(kuò)增的DNADNA片段兩側(cè)和與兩側(cè)片段兩側(cè)和與兩側(cè) 互補(bǔ)的兩個寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火互補(bǔ)的兩個寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火 和延伸若干個循環(huán)后，和延伸若干個循環(huán)后，DNADNA擴(kuò)增擴(kuò)增2 2n n倍。倍。操作步驟操作步驟1 1、在、在0.2m L Eppendorf0.2m L Eppendorf管內(nèi)配置管內(nèi)配置20L20L反應(yīng)體系：反應(yīng)

7、體系： 反應(yīng)物反應(yīng)物 體積體積/ L/ L ddH ddH2 2O 1 2O 1 2 10 10 PCR PCR緩沖緩沖 2.02.0 2.5 mmol/L dNTP 2.0 2.5 mmol/L dNTP 2.0 隨機(jī)引物隨機(jī)引物 1.01.0 模版模版DNA 2.0DNA 2.0 Taq Taq酶酶 1.0 1.0 （1U1U） 點(diǎn)動混勻，加點(diǎn)動混勻，加10 L10 L礦物油。礦物油。操作步驟2 2、按下述程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)條件：、按下述程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)條件：（1 1）9494C C 預(yù)變性預(yù)變性 4min4min；（2 2）9494C C 變性變性 30sec30sec；（3 3）3636

8、C C 退火退火 40sec40sec；（4 4）7272C C 延伸延伸 100s 100s ；（5 5）重復(fù)步驟（）重復(fù)步驟（2 2）（4 4） 3535次；次；（6 6）7272C C 延伸延伸 7min7min。操作步驟操作步驟3 3、瓊脂糖凝膠電泳分析、瓊脂糖凝膠電泳分析PCRPCR結(jié)果配置結(jié)果配置1.4%1.4%瓊瓊 脂糖凝膠，取脂糖凝膠，取10 L10 L擴(kuò)增產(chǎn)物電泳。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 六、動物基因組六、動物基因組DNADNA 的提取和檢測的提取和檢測實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康南嚓P(guān)知識及原理相關(guān)知識及原理儀器、材料和試劑儀器、材料和試劑操作步驟操作步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果

9、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)掌握從動物組織提取基因組學(xué)習(xí)掌握從動物組織提取基因組 DNA的原理和方法，以及相對分的原理和方法，以及相對分 子質(zhì)量較大的子質(zhì)量較大的DNA的瓊脂糖凝膠的瓊脂糖凝膠 電泳技術(shù)。電泳技術(shù)。相關(guān)知識及原理相關(guān)知識及原理 在在EDTAEDTA和和SDSSDS等去污劑存在下，用蛋等去污劑存在下，用蛋 白酶白酶K K消化細(xì)胞，隨后用酚抽提，可以得消化細(xì)胞，隨后用酚抽提，可以得 到哺乳動物基因組到哺乳動物基因組DNADNA，用此方法得到的，用此方法得到的 DNADNA長度為長度為100100150kb150kb，適用于，適用于噬菌體噬菌體 構(gòu)建基因組文庫和構(gòu)建基因組文庫和Southe

10、rnSouthern分析。分析。儀器、材料和試劑儀器、材料和試劑儀器儀器 臺式離心機(jī)臺式離心機(jī) 玻璃勻漿器玻璃勻漿器 高壓滅菌鍋高壓滅菌鍋 恒溫水浴器恒溫水浴器材料材料 兔肝兔肝試劑試劑 蛋白酶蛋白酶K K 組織勻漿液組織勻漿液 酶解液酶解液 RNARNA酶酶 TETE溶液溶液實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果提取的提取的DNADNA應(yīng)為一條帶應(yīng)為一條帶實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 七、植物基因組七、植物基因組DNADNA 的提取和檢測的提取和檢測實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康南嚓P(guān)知識及原理相關(guān)知識及原理儀器、材料和試劑儀器、材料和試劑操作步驟操作步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)掌握從植物組織中提取DNA的 方法學(xué)習(xí)掌握液氮的使用相關(guān)知

11、識及原理相關(guān)知識及原理 利用液氮對植物組織進(jìn)行研磨破碎利用液氮對植物組織進(jìn)行研磨破碎 細(xì)胞。細(xì)胞提取液中含有的細(xì)胞。細(xì)胞提取液中含有的SDSSDS溶解膜蛋溶解膜蛋 白而破壞細(xì)胞膜，使蛋白變性而沉淀下白而破壞細(xì)胞膜，使蛋白變性而沉淀下 來。來。EDTAEDTA抑制抑制DNADNA酶的活性。再用酚、氯酶的活性。再用酚、氯 仿提取的方法去除蛋白，得到的仿提取的方法去除蛋白，得到的DNADNA溶液溶液 經(jīng)乙醇沉淀。經(jīng)乙醇沉淀。儀器、材料和試劑儀器、材料和試劑儀器儀器 低溫離心機(jī)低溫離心機(jī) 恒溫水浴器恒溫水浴器 臺式離心機(jī)臺式離心機(jī) 瓊脂糖凝膠系統(tǒng)瓊脂糖凝膠系統(tǒng)材料材料 試劑試劑 CTABCTAB提取緩

12、沖液提取緩沖液 TETE實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 CTABCTAB提取法：提取法：（1 1）稱取）稱取0.50.5克植物材料放入預(yù)冷至克植物材料放入預(yù)冷至-20-20的研缽中的研缽中 （提前滅菌），加入少量石英沙，再倒入液氮（提前滅菌），加入少量石英沙，再倒入液氮 ( (分批加入分批加入) )，研成粉末狀，置于滅菌的，研成粉末狀，置于滅菌的10ml10ml離離 心管心管 中。中。（2 2）加入加入2ml 652ml 65預(yù)熱的預(yù)熱的CTABCTAB提取緩沖提取緩沖液液充分混勻充分混勻 后在后在6565保溫保溫90min90min; ; 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 CTAB CTAB提取緩沖液提取緩沖液: : 2

13、% 2%（w/vw/v）十六烷基三甲基溴化銨（）十六烷基三甲基溴化銨（CTABCTAB）: : 1.4M NaCl 1.4M NaCl； 20mM EDTApH8.020mM EDTApH8.0； 100Mm Tris- HCl pH8.0 100Mm Tris- HCl pH8.0 ； 2%(2%(w/vw/v) )聚乙烯吡咯烷酮（聚乙烯吡咯烷酮（PVPPVP）；）； 5%5%（v/vv/v）巰基乙醇（使用前加入）巰基乙醇（使用前加入）（3）加入等體積氯仿：異戊醇（24 ：1）充分搖 勻后，4 6000r/min離心15 min。實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟（4）用擴(kuò)口吸頭取上清液移入另一10ml離心管

14、中， 加入2/3體積-20預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛倒搖 勻后，-20放置20min , 在冷凍離心機(jī)上于 4 5000r/min離心10 min ,緩慢傾倒出上清 液。（5）在沉淀中加入1ml65預(yù)熱的CTAB提取緩沖液 ，溫浴1h,待沉淀充分溶解后，加入等體積氯 仿：異戊醇，充分混勻，4 6000r/min離心 10 min 。實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟（6）重復(fù)第4步；（7）用70 %乙醇洗沉淀兩次，在室溫晾干， 加入200l TE緩沖液溶解 DNA 2h。（8）配制0.7%的瓊脂糖凝膠電泳分析，取 5l的樣品電泳。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提取的DNA應(yīng)為靠近點(diǎn)樣孔的一條帶，操作步驟操作步驟1、取0.4g兔肝，用冰冷的

15、生理鹽水洗3次，然后 置于4ml勻漿液中，用玻璃勻漿器勻漿至無明 顯組織塊存在（冰浴操作）。2、將組織細(xì)胞移至10ml離心管中,4 4000 rpm離心1.5min,棄上清。3、沉淀加1ml無菌水迅速吹散，再加1ml酶解液， 翻轉(zhuǎn)混勻（動作一定要輕）55水浴處理12 18h。操作步驟操作步驟4、加RNase至終濃度100g/m（222l）,37水 浴2h。5、加入等體積酚(約2ml)抽提一次，（慢慢旋轉(zhuǎn) 混勻，水平搖床搖10min），4 8000 rpm離 心10min。6、用擴(kuò)口吸頭移出含DNA的 水相（注意勿吸出 雙相界面蛋白層），加等體積(約2ml)氯仿： 異戊醇（24：1）4 10mi

16、n,8000 rpm離心 10min。（有時如果DNA含量過高，水相在下 層，實(shí)驗(yàn)時注意觀察）操作步驟操作步驟7、用擴(kuò)口吸頭小心吸出上層含DNA的水相，移入 10ml離心管，加入250l 5mol/l NaCI(終濃 度0.1-0.25mol/l),小心混勻（要充分）， 在向每管中加入2.5倍體積(約6ml)的無水乙 醇-20 2h。8、12000rpm離心15min，棄上清，70%冷乙醇洗 滌一次， 12000rpm離心15min，室溫干燥， 加入100l TE緩沖液，輕搖混勻，存放4 過夜（或2h）。9、電泳鑒定（0.7%的瓊脂糖凝膠）。儀器、材料和試劑儀器、材料和試劑儀器 PCR儀 瓊脂

17、糖凝膠電泳系統(tǒng)材料 兔基因組DNA 隨機(jī)引物 試劑 PCR緩沖（10） dNTP Taq酶 礦物油實(shí)驗(yàn)五、實(shí)驗(yàn)五、 DNADNA的酶切、連接的酶切、連接 與轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康南嚓P(guān)知識及原理相關(guān)知識及原理儀器、材料和試劑儀器、材料和試劑操作步驟操作步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康膙學(xué)習(xí)掌握重組學(xué)習(xí)掌握重組DNADNA連接以及鑒定重連接以及鑒定重組子的方法。組子的方法。v學(xué)習(xí)掌握學(xué)習(xí)掌握X-gal X-gal 等試劑的配制保存。等試劑的配制保存。v重組子重組子vT4T4噬菌體噬菌體DNADNA連接酶催化連接酶催化DNADNA連接反應(yīng)連接反應(yīng): : （1 1）酶）酶 + ATP = +

18、ATP = 酶酶-AMP-AMP復(fù)合物復(fù)合物 （2 2）酶）酶-AMP-AMP復(fù)合物結(jié)合復(fù)合物結(jié)合DNADNA切口上，使切口上，使 DNADNA腺苷化腺苷化 （3 3）形成新的磷酸二酯鍵，封閉切口）形成新的磷酸二酯鍵，封閉切口v藍(lán)白斑選擇（藍(lán)白斑選擇（ Xgal Xgal 、IPTG IPTG ）、）、 互補(bǔ)互補(bǔ)儀器、材料和試劑儀器、材料和試劑v儀器儀器 電熱恒溫水浴電熱恒溫水浴 臺式臺式/ /低溫離心機(jī)低溫離心機(jī) 恒溫?fù)u床恒溫?fù)u床 恒溫培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)箱 恒溫水浴恒溫水浴v材料材料 DH5DH5、TOP10TOP10 pUC18/19 pUC18/19 植物植物DNADNAv試劑試劑 X-ga

19、l IPTG X-gal IPTG BamHIBamHI T T4 4DNADNA連接酶連接酶操作步驟操作步驟v制備重組制備重組DNA DNA （1 1）在滅菌的）在滅菌的EppendorfEppendorf管（管（0.5ml0.5ml）中）中, ,加入加入15l 15l pUC18,2l pUC18,2l酶切緩沖液，酶切緩沖液，1l1l（2U2U）BamHIBamHI酶酶, , 2l BSA 2l BSA （酶和緩沖液放在冰上（酶和緩沖液放在冰上),),混合物總體混合物總體 積積20l20l，離心混勻離心混勻，37 37 反應(yīng)反應(yīng)3h3h。（2 2）在另一無菌管中，加入植物）在另一無菌管中，

20、加入植物DNA 1.5gDNA 1.5g，1l1l 酶切緩沖液，酶切緩沖液，1l1l（ 2U2U） BamHIBamHI酶酶, 2l BSA , 2l BSA ，無菌水，無菌水6 .5l6 .5l，混合物總體積，混合物總體積10l,10l,離心混離心混 勻勻，3737反應(yīng)反應(yīng)3h3h。操作步驟操作步驟（3 3）各?。└魅?2l2l酶解液做電泳分析。酶解液做電泳分析。（4 4）剩余酶解液加入）剩余酶解液加入1/101/10體積的體積的3mol/l KAc(PH5.2)3mol/l KAc(PH5.2) 溶液，再加溶液，再加2 2倍體積的無水乙醇，置倍體積的無水乙醇，置-20 -20 冰冰 箱箱

21、2h2h（沉淀（沉淀DNADNA）。）。12000rpm 4 12000rpm 4 離心離心15min,15min, 棄上清，加棄上清，加70%70%乙醇洗沉淀物，再離心，去上乙醇洗沉淀物，再離心，去上 清，倒置干燥，加清，倒置干燥，加 5lTE5lTE溶液溶解。溶液溶解。( (替代方替代方 案：剩余酶解液案：剩余酶解液65 ,65 ,保溫保溫15min)15min)操作步驟操作步驟（5 5）將酶切后的）將酶切后的2 2個個DNADNA片段混合于一管中，加片段混合于一管中，加T T4 4 DNA DNA 連接酶緩沖液連接酶緩沖液1l1l， T T4 4DNADNA連接酶連接酶1l1l，14 1

22、4 保溫保溫14h14h。（6 6）制備感受態(tài)細(xì)胞（）制備感受態(tài)細(xì)胞（Top10Top10）。）。（7 7）同時制備含）同時制備含100 g/ml100 g/ml氨芐青霉素的固體氨芐青霉素的固體LBLB培養(yǎng)培養(yǎng) 基，待培養(yǎng)基冷卻，培養(yǎng)基（基，待培養(yǎng)基冷卻，培養(yǎng)基（90mm90mm）中央滴加）中央滴加 40l 2%X-gal40l 2%X-gal和和7l 20%IPTG(7l 20%IPTG(Top10Top10不加不加) )， 用無菌涂棒使之均勻涂布于培養(yǎng)基表面，然后用無菌涂棒使之均勻涂布于培養(yǎng)基表面，然后37 37 溫浴直至液體全部消失。溫浴直至液體全部消失。操作步驟操作步驟（8 8）轉(zhuǎn)化）

23、轉(zhuǎn)化 第一組：第一組：5l(50ng)5l(50ng)重組子重組子+ 200+ 200l l感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞， 此管為轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)組。此管為轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)組。 第二組：第二組：5l5l無菌水無菌水+ 200+ 200l l感受態(tài)細(xì)胞懸液。感受態(tài)細(xì)胞懸液。（9 9）實(shí)驗(yàn)組、對照組分別取）實(shí)驗(yàn)組、對照組分別取80l80l懸液均勻涂布在含懸液均勻涂布在含 X-galX-gal、AmpAmp的固體的固體LBLB培養(yǎng)基和含培養(yǎng)基和含AmpAmp的固體的固體LBLB培培 養(yǎng)基上；再取養(yǎng)基上；再取40l40l懸液均勻涂布普通固體懸液均勻涂布普通固體LBLB培培 養(yǎng)基上，養(yǎng)基上，37 37 過夜培養(yǎng)過夜培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)

24、果實(shí)驗(yàn)結(jié)果含含X-galX-gal、AmpAmp的固體的固體LBLB培養(yǎng)基培養(yǎng)基 白色菌落（重組子）和蘭色菌落（白色菌落（重組子）和蘭色菌落（pUC18pUC18） 蘭色菌落（蘭色菌落（pUC18pUC18）或無菌落）或無菌落含含AmpAmp的固體的固體LBLB培養(yǎng)基培養(yǎng)基 有菌落有菌落 無菌落無菌落普通固體普通固體LBLB培養(yǎng)基培養(yǎng)基 有菌落有菌落 無菌落無菌落成功成功成功失敗成功失敗實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 一、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備一、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)?zāi)康南嚓P(guān)知識及原理相關(guān)知識及原理儀器、材料和試劑儀器、材料和試劑操作步驟操作步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康牧私庵苽涓惺軕B(tài)細(xì)胞的的意義了

25、解制備感受態(tài)細(xì)胞的的意義掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制 備方法和技術(shù)備方法和技術(shù)掌握感受態(tài)細(xì)胞的保存方法掌握感受態(tài)細(xì)胞的保存方法v感受態(tài)感受態(tài)v感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞v原理：受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：原理：受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：CaCl2 等化學(xué)試劑法或電擊法）的處理后，細(xì)等化學(xué)試劑法或電擊法）的處理后，細(xì) 胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許多胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許多 有外源有外源DNA的載體分子通過的感受態(tài)細(xì)的載體分子通過的感受態(tài)細(xì) 胞胞v基本方法：細(xì)菌經(jīng)基本方法：細(xì)菌經(jīng)0 的低滲的低滲CaCl2處理，使細(xì)處理，使細(xì) 菌處于感受態(tài)，然后加入甘油菌處于感

26、受態(tài)，然后加入甘油-70條件條件 下保存下保存 v材料材料 大腸桿菌大腸桿菌DH5DH5 TOP10 TOP10v試劑試劑 0.1molL CaCl2溶液溶液 LBLB培養(yǎng)基（液態(tài)培養(yǎng)基（液態(tài)）v儀器儀器 超凈工作臺超凈工作臺 電熱恒溫水浴電熱恒溫水浴 分光光度計(jì)分光光度計(jì) 低溫離心機(jī)低溫離心機(jī) 制冰機(jī)制冰機(jī) 操作步驟操作步驟（1）從）從 DH5(或或TOP10)菌平板上挑取一單落，菌平板上挑取一單落， 接種于接種于15ml LB液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基中，37振蕩培振蕩培 養(yǎng)養(yǎng)12h左右。左右。（2）取該菌懸液）取該菌懸液150l 轉(zhuǎn)接于轉(zhuǎn)接于15ml LB液體培養(yǎng)液體培養(yǎng) 基中，基中，37

27、振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)2h左右（左右（ OD6000.5）（3）將菌液轉(zhuǎn)移到）將菌液轉(zhuǎn)移到10ml離心管（每管離心管（每管8ml），放），放 冰上冰上10min。 （4 4）離心）離心10min10min（4000r/min4000r/min），回收細(xì)胞（從這一），回收細(xì)胞（從這一 步開始，所有操作均在冰上進(jìn)行，速度盡量快步開始，所有操作均在冰上進(jìn)行，速度盡量快 而穩(wěn)）而穩(wěn)） 。（5 5）倒凈上清培養(yǎng)液）倒凈上清培養(yǎng)液( (倒置倒置1 min)1 min)，用，用1.6ml1.6ml冰冷的冰冷的 0.1mo10.1mo1L CaClL CaCl2 2溶液溶液輕輕懸浮細(xì)胞輕輕懸浮細(xì)胞，立即放在立即放在

28、 冰上冰上30 min 30 min 。 （6 6）44離心離心10min10min（5000r/min5000r/min），棄上清液，回收，棄上清液，回收 細(xì)胞。細(xì)胞。操作步驟操作步驟操作步驟操作步驟（7 7）用）用320ul320ul冰冷的冰冷的0.1mo10.1mo1L CaClL CaCl2 2溶液溶液輕輕輕輕 懸浮細(xì)胞，懸浮細(xì)胞，立即放在冰上立即放在冰上 。（8 8）分裝細(xì)胞，每管）分裝細(xì)胞，每管170ul170ul細(xì)胞懸液再加細(xì)胞懸液再加30ul30ul甘甘 油（滅菌）。油（滅菌）。（9 9）作標(biāo)記，）作標(biāo)記，-70-70保存。保存。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 二、大腸桿菌的轉(zhuǎn)化二、大腸桿菌的轉(zhuǎn)化

29、及轉(zhuǎn)化子的檢測及轉(zhuǎn)化子的檢測實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康南嚓P(guān)知識及原理相關(guān)知識及原理儀器、材料和試劑儀器、材料和試劑操作步驟操作步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆崭惺軕B(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的基本掌握感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的基本知識知識掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化的方法的方法了解感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的的意了解感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的的意義義v轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化v原理原理:轉(zhuǎn)化混合物中的外源轉(zhuǎn)化混合物中的外源DNADNA形成抗形成抗DNADNA酶的羥酶的羥 基基- -鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)4242 短時間熱擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收短時間熱擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNADNA復(fù)合物。復(fù)合物。 轉(zhuǎn)化是將異

30、源轉(zhuǎn)化是將異源DNADNA分子引入一細(xì)胞株系分子引入一細(xì)胞株系, ,使受使受 體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基 因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。v轉(zhuǎn)化方法：轉(zhuǎn)化方法：熱擊法、電轉(zhuǎn)化法熱擊法、電轉(zhuǎn)化法儀器、材料和試劑儀器、材料和試劑v儀器儀器 無菌超凈臺無菌超凈臺 電熱恒溫水浴電熱恒溫水浴 分光光度計(jì)分光光度計(jì) 低溫離心機(jī)低溫離心機(jī) 微型離心管微型離心管 移液器移液器v材料材料 感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞 pUC18pUC18、pUC19pUC19v試劑試劑 CaClCaCl2 2溶液溶液 （0.0.1mol1molL L）

31、LBLB培養(yǎng)基培養(yǎng)基 氨芐青霉素氨芐青霉素操作步驟操作步驟（1 1）分別?。┓謩e取2 2個個200200l l感受態(tài)細(xì)胞懸液感受態(tài)細(xì)胞懸液 第一組第一組轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)組：轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)組： 0.50.5l(50ng)pUC18/pUC19 + 200l(50ng)pUC18/pUC19 + 200l l感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞 第二組第二組受體菌對照組：受體菌對照組： 0.50.5l l無菌水無菌水 + 200+ 200l l感受態(tài)細(xì)胞懸液感受態(tài)細(xì)胞懸液（2 2）將以上各樣品輕輕搖勻，冰上放置）將以上各樣品輕輕搖勻，冰上放置30min30min，于于 4242水浴中保溫水浴中保溫1.5min1.5min，然后

32、迅速冰上冷卻，然后迅速冰上冷卻 2min2min。 操作步驟操作步驟（3 3）立即向上述管中分別加入）立即向上述管中分別加入0.8ml0.8ml LB LB液體培養(yǎng)液體培養(yǎng) 基（不需在冰上操作），使總體積到基（不需在冰上操作），使總體積到1ml1ml， 該溶液稱為轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液，搖勻后于該溶液稱為轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液，搖勻后于3737振振 蕩培養(yǎng)約蕩培養(yǎng)約1.5h1.5h（170rpm170rpm）。（4 4）取各樣品培養(yǎng)液）取各樣品培養(yǎng)液 0.1ml0.1ml，分別接種于含抗菌，分別接種于含抗菌 素素LBLB平板培養(yǎng)基和普通平板培養(yǎng)基和普通LBLB平板培養(yǎng)基上，涂平板培養(yǎng)基上，涂 勻（如果用玻璃棒涂抹

33、，酒精燈燒過后稍微勻（如果用玻璃棒涂抹，酒精燈燒過后稍微 涼一下再用，不要過燙）。涼一下再用，不要過燙）。（5 5）菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培 養(yǎng)皿，于養(yǎng)皿，于3737恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過 夜夜(12-16(12-16小時小時) )，出現(xiàn)菌落。，出現(xiàn)菌落。操作步驟操作步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果v含抗生素含抗生素LB平板培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基 第一組有菌落，第二組無菌落第一組有菌落，第二組無菌落 第一組、第二組均無或有菌落第一組、第二組均無或有菌落v 普通普通LB平板培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基 第一組、第二組均無菌落第一組、第二組均無菌落 第一組、第二組均有菌落第一組

34、、第二組均有菌落 成功成功失敗失敗失敗失敗成功成功實(shí)驗(yàn)一、堿變性法提取實(shí)驗(yàn)一、堿變性法提取 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康南嚓P(guān)知識及原理相關(guān)知識及原理儀器、材料和試劑儀器、材料和試劑操作步驟操作步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康膙學(xué)習(xí)掌握堿裂解法提取質(zhì)粒學(xué)習(xí)掌握堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的方法和技能；的方法和技能；v學(xué)習(xí)掌握質(zhì)粒學(xué)習(xí)掌握質(zhì)粒DNA濃度、純度的檢測方法；濃度、純度的檢測方法；v學(xué)習(xí)掌握瓊脂糖凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)方法；學(xué)習(xí)掌握瓊脂糖凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)方法；v堿裂解法提取法堿裂解法提取法是根據(jù)共價閉合環(huán)狀DNA與線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們。pH介于12.012.5范圍內(nèi)，線性的DNA雙螺旋解開變性；質(zhì)粒DNA的氫鍵會斷，但兩鏈彼此盤繞。當(dāng)恢復(fù)到中性時，質(zhì)粒DNA復(fù)性迅速而準(zhǔn)確；線性染色體DNA復(fù)性不迅速，而且纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心使他們分離。儀器、材料和試劑儀器、材料和試劑v儀器儀器 恒溫培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)箱 搖床搖床 電熱恒溫水浴電熱恒溫水浴 電泳儀電泳儀 低溫離心機(jī)低溫離心機(jī) 紫外線透射儀紫外線透射儀v材料材料 pUCpUC 18/19 18/19v試劑試劑 溶液溶液/ 胰胰RNARNA酶酶 TETE緩沖液緩沖液操作步驟操作步驟（1 1）15ml15ml的含氨芐氰霉素的含氨芐氰霉素LBLB培養(yǎng)基中接入上一培養(yǎng)基中接入上一 實(shí)驗(yàn)得到的轉(zhuǎn)化子，實(shí)驗(yàn)得到的轉(zhuǎn)化