GB∕T 41185-2021 水生動(dòng)物病原DNA檢測(cè)參考物質(zhì)制備和質(zhì)量控制規(guī)范 質(zhì)粒

?犐犆犛６５．０２０．３０犆犆犛犅４１

中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)

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水生動(dòng)物病原犇犖犃檢測(cè)參考物質(zhì)制備和質(zhì)量控制規(guī)范 質(zhì)粒

犛狆犲犮犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狆狉犲狆犪狉犪狋犻狅狀犪狀犱狇狌犪犾犻狋狔犮狅狀狋狉狅犾狅犳狉犲犳犲狉犲狀犮犲犿犪狋犲狉犻犪犾狊犳狅狉犇犖犃犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犪狇狌犪狋犻犮犪狀犻犿犪犾狊狆犪狋犺狅犵犲狀—犘犾犪狊犿犻犱

２０２１１２３１發(fā)布 ２０２０７０１實(shí)施

發(fā)布

國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)

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前 言

本文件按照ＧＢ／Ｔ１．１—２０２０《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第１部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。

本文件由全國(guó)水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（ＳＡＣ／ＴＣ１５６）歸口。

本文件起草單位：中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、北京海關(guān)、連云港海關(guān)。

本文件主要起草人：林祥梅、張、王娜、吳紹強(qiáng)、景宏麗、谷強(qiáng)、任彤、周毅、江育林。

Ⅰ

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水生動(dòng)物病原犇犖犃檢測(cè)參考物質(zhì)制備和質(zhì)量控制規(guī)范 質(zhì)粒

１范圍

本文件給出了作為水生動(dòng)物病原ＤＮＡ檢測(cè)陽(yáng)性參考物質(zhì)的質(zhì)粒，其質(zhì)量控制規(guī)范術(shù)語(yǔ)和定義、縮略語(yǔ)、原理、試劑或材料、儀器設(shè)備，規(guī)定了質(zhì)粒制備的通用要求、質(zhì)粒的質(zhì)量控制、質(zhì)粒的驗(yàn)證，以及質(zhì)粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。

本文件適用于水生動(dòng)物病原ＤＮＡ核酸檢測(cè)中質(zhì)粒的制備和質(zhì)量控制。

２規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

ＧＢ／Ｔ６８２分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

ＳＣ／Ｔ７０１９水生動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)室保存規(guī)范

３術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

３．１

３．２３．３３．４３．５３．６

變異系數(shù)犮狅犲犳犻犮犻犲狀狋狅犳狏犪狉犻犪狋犻狅狀

概率分布離散程度的一個(gè)歸一化量度，其定義為數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差與數(shù)據(jù)平均值之比。

初始樣犳狉狅狀狋狊犪犿狆犾犲

按照制備先后順序，最先制備的１／３批次產(chǎn)品。

均勻性狌狀犻犳狅狉犿犻狋狔

同一生產(chǎn)批次的質(zhì)粒，每支含有等量目的基因的狀態(tài)。

溯源性狋狉犪犮犲犪犫犻犾犻狋狔

質(zhì)粒中目的基因序列與病原參考毒株序列的一致性。

穩(wěn)定性狊狋犪犫犻犾犻狋狔

質(zhì)粒在特定保存條件和保存時(shí)間范圍內(nèi)，保證檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的能力。

陽(yáng)性參考物質(zhì)狆狅狊犻狋犻狏犲狉犲犳犲狉犲狀犮犲犿犪狋犲狉犻犪犾

與病原擁有某些完全相同的特征，如相同的目的基因序列、抗原性、敏感性等，用于該病原檢測(cè)一定

會(huì)得出理想的陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果，通常作為陽(yáng)性對(duì)照判定待測(cè)樣品是否為病原陽(yáng)性。

１

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３．７

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３．８３．９

中間樣 犿犻犱犾犲狊犪犿狆犾犲

按照制備先后順序，中間制備的１／３批次產(chǎn)品。

終止樣犳犻狀犪犾狊犪犿狆犾犲

按照制備先后順序，最后制備的１／３批次產(chǎn)品。

最小有效取樣量 犿犻狀犻犿狌犿犲犳犲犮狋犻狏犲狊犪犿狆犾犲狏狅犾狌犿犲

使用病原檢測(cè)方法，可檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果的最小陽(yáng)性參考物質(zhì)的量。

４縮略語(yǔ)

下列縮略語(yǔ)適用于本文件。Ａｍｐ：氨芐青霉素（ａｍｐｉｃｉｌｉｎ）Ｃｔ：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（ｃｙｃｌｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）

ＤＮＡ：脫氧核糖核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）

ｄＡＴＰ：三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸（ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ｄＣＴＰ：三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ｄＧＴＰ：三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸（ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ｄＮＴＰ：脫氧核糖核苷三磷酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ｄＴＴＰ：三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸（ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ＥＢ：溴化乙錠（ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）

ＩＰＴＧ：異丙基βＤ硫代半乳糖苷（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｂｅｔａＤｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）

ＬＢ：營(yíng)養(yǎng)肉湯（ｌｕｒｉａｂｅｒｔａｎｉｂｒｏｔｈ）

ＰＣＲ：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）

ｑＰＣＲ：實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）

犜犪狇：水生嗜熱菌（犜犺犲狉犿狌狊犪狇狌犪狋犻犮狌狊）

５原理

利用基因重組技術(shù)，將目的ＤＮＡ片段連接入空質(zhì)粒中，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，篩選出含有陽(yáng)性重組質(zhì)粒的細(xì)胞，再?gòu)募?xì)胞中提取質(zhì)粒，制備流程按照附錄Ａ進(jìn)行。為滿足病原分子生物學(xué)檢測(cè)要求，作為ＤＮＡ參考物質(zhì)的質(zhì)粒應(yīng)具備以下特征：包含有針對(duì)檢測(cè)病原的目的ＤＮＡ片段；不易降解，不會(huì)丟失病原ＤＮＡ片段；易于大量制備提純；可用于病原定性或定量檢測(cè)。

６試劑或材料

６．１水：符合ＧＢ／Ｔ６８２中一級(jí)水規(guī)定。

６．２ＰＣＲ試劑和ｑＰＣＲ試劑：商品化試劑。

６．３擴(kuò)增病原目的基因的引物：可參照相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)合成。

６．４瓊脂糖：電泳純。

２

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６．５空質(zhì)粒：商品化試劑。

６．６經(jīng)高溫高壓滅菌處理的水、緩沖液、離心管、試管、ＰＣＲ管、移液器槍頭、培養(yǎng)皿、三角瓶、涂布棒或棉簽。

６．７制備質(zhì)粒所需的其他試劑：按照附錄Ｂ配制。

７儀器設(shè)備

７．１超凈工作臺(tái)。７．２高速冷凍離心機(jī)。７．３電子天平。

７．４高壓滅菌鍋。

７．５ＰＣＲ儀。

７．６熒光定量ＰＣＲ儀。

７．７電泳儀。

７．８紫外分光光度計(jì)。７．９凝膠成像系統(tǒng)。７．１０移液器。

８質(zhì)粒制備的通用要求

８．１目的犇犖犃的選擇

目的ＤＮＡ片段應(yīng)含有該病原檢測(cè)方法中推薦的全部目的基因序列。

８．２空質(zhì)粒的選擇

空質(zhì)粒應(yīng)具備以下特征：

ａ）多克隆位點(diǎn)可以容納全部目的基因片段；

ｂ）性質(zhì)穩(wěn)定，不易產(chǎn)生基因變異；

ｃ）具備抗生素抗性基因或犾犪犮犣基因，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞后可進(jìn)行抗性篩選或藍(lán)白篩選。

８．３連接反應(yīng)

連接反應(yīng)前，目的ＤＮＡ片段和空質(zhì)粒應(yīng)提純。

８．４連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞

每批轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，應(yīng)設(shè)置未處理的感受態(tài)細(xì)胞作為空白對(duì)照、轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞作為陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)化已知重組質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。只有在空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照都成立的情況下，才能判定連接產(chǎn)物是否轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞。

８．５質(zhì)粒的純度檢測(cè)

使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量質(zhì)粒的犃２６０／犃２８０比值。若比值介于１．８～２．０之間，則純度合格；否則需重新提取。

３

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９質(zhì)粒的質(zhì)量控制９．１質(zhì)粒的定性檢測(cè)９．１．１犘犆犚檢測(cè)

以質(zhì)粒溶液為模板，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照（水）和陽(yáng)性對(duì)照（病原ＤＮＡ），進(jìn)行ＰＣＲ檢測(cè)，電泳觀察檢測(cè)結(jié)果，或使用質(zhì)粒上的通用引物做ＰＣＲ檢測(cè)。

９．１．２目的基因的溯源性分析

對(duì)質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與相應(yīng)病原參考株的序列進(jìn)行比對(duì)。

９．１．３結(jié)果判定

在陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照都成立的情況下：

ａ）可檢測(cè)到目的ＤＮＡ，且測(cè)序結(jié)果與相應(yīng)病原參考株的序列同源性至少達(dá)到９％，則質(zhì)?？勺鳛殛?yáng)性參考物質(zhì)用于病原的定性分子生物學(xué)檢測(cè)；

ｂ）無(wú)明顯的目的ＤＮＡ，或測(cè)序結(jié)果與相應(yīng)病原參考株的序列同源性低于９％，則說(shuō)明病原目的ＤＮＡ并未正確插入質(zhì)粒，或質(zhì)粒提純失敗，需重新制備提純。

９．２質(zhì)粒的定量檢測(cè)

９．２．１狇犘犆犚方法

以目的ＤＮＡ中的保守序列為模板，設(shè)計(jì)引物和探針。

分別以質(zhì)粒和空質(zhì)粒為模板進(jìn)行ｑＰＣＲ，對(duì)所設(shè)計(jì)的引物探針進(jìn)行特異性檢測(cè)。

ａ）質(zhì)粒檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，空質(zhì)粒為陰性，則該套引物探針可以特異性擴(kuò)增目的ＤＮＡ，可用于目的

ＤＮＡ的定量檢測(cè)；

ｂ）檢測(cè)結(jié)果都為陽(yáng)性，則該套引物探針也可以與空質(zhì)粒某段基因反應(yīng)，不能用于目的ＤＮＡ的定量檢測(cè)，應(yīng)重新設(shè)計(jì)引物探針；

ｃ）檢測(cè)結(jié)果都為陰性，則該套引物探針不能與目的ＤＮＡ反應(yīng)，應(yīng)重新設(shè)計(jì)引物探針，或優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

９．２．２標(biāo)準(zhǔn)品的選擇和定量

將純化的目的ＤＮＡ作為標(biāo)準(zhǔn)品，用于ｑＰＣＲ標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。

使用分光光度計(jì)測(cè)量目的ＤＮＡ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，再根據(jù)公式（１）換算成拷貝數(shù)濃度：

（６．０２×１０２０）×犖／犕犠＝犢 （１）

式中：

犖 ——目的ＤＮＡ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，單位為克每毫升（ｇ／ｍＬ）；

犕犠——分子量的數(shù)值，單位為克每摩爾（ｇ／ｍｏｌ）；

犢 ——目的ＤＮＡ溶液拷貝數(shù)濃度的數(shù)值，單位為拷貝數(shù)每微升（ｃｏｐｉｅｓ／μＬ）。

目的ＤＮＡ拷貝數(shù)濃度不應(yīng)低于１０１０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ拷貝數(shù)，若低于此濃度，應(yīng)加大ＤＮＡ提取量，再提純。

４

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９．２．３制備標(biāo)準(zhǔn)曲線

９．２．３．１將標(biāo)準(zhǔn)品（目的ＤＮＡ溶液）１０倍梯度稀釋５次。

９．２．３．２使用９．２．１設(shè)計(jì)的引物探針，以標(biāo)準(zhǔn)品原液及５次梯度稀釋溶液為模板，進(jìn)行ｑＰＣＲ擴(kuò)增。９．２．３．３以標(biāo)準(zhǔn)品Ｃｔ值和對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線橫坐標(biāo)為反應(yīng)體系中加入樣品的拷貝數(shù)，縱坐標(biāo)為Ｃｔ值；標(biāo)準(zhǔn)曲線犚值不低于０．９８。若各稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品的Ｃｔ值無(wú)法形成良好的線性關(guān)系，需重新梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

９．２．４質(zhì)粒中病原犇犖犃的定量

９．２．４．１使用９．２．１設(shè)計(jì)的引物探針，以提純的質(zhì)粒為模板，設(shè)置３個(gè)平行對(duì)照，測(cè)定質(zhì)粒的Ｃｔ值。

９．２．４．２以水為模板設(shè)置陰性對(duì)照，以病原ＤＮＡ為模板設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照。

９．２．４．３在陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照都成立的情況下，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，３個(gè)平行對(duì)照樣品Ｃｔ值分別對(duì)應(yīng)３個(gè)拷貝數(shù)，將拷貝數(shù)平均值除以反應(yīng)體系中加入的樣品體積，即為質(zhì)粒真實(shí)的拷貝數(shù)濃度。若質(zhì)粒的Ｃｔ值小于標(biāo)準(zhǔn)品原液的Ｃｔ值，需將質(zhì)粒稀釋１０倍或１０倍后，重新進(jìn)行定量。

９．３最小有效取樣量的測(cè)定

在已知濃度的基礎(chǔ)上，分別取０．５μＬ、１μＬ、２μＬ、５μＬ和１０μＬ質(zhì)粒溶液作為模板，按照相應(yīng)病原檢測(cè)方法推薦的方法進(jìn)行核酸擴(kuò)增，觀察檢測(cè)結(jié)果。獲得陽(yáng)性結(jié)果的最低模板量為最小有效取樣量。

９．４質(zhì)粒均勻性檢測(cè)

９．４．１檢測(cè)方法

９．４．１．１以初始樣、中間樣、終止樣三階段分別隨機(jī)抽取共１０份質(zhì)粒樣品。

９．４．１．２分別以１０份質(zhì)粒為模板，使用相應(yīng)病原檢測(cè)方法推薦的引物和實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行ＰＣＲ或ｑＰＣＲ擴(kuò)增。

９．４．１．３ＰＣＲ產(chǎn)物電泳，或ｑＰＣＲ產(chǎn)物讀數(shù)并計(jì)算變異系數(shù)。

９．４．２質(zhì)粒均勻性判定

均勻性判定方法如下：

ａ）１０份質(zhì)粒樣品的檢測(cè)結(jié)果全部為陽(yáng)性，ＰＣＲ擴(kuò)增的１０條ＤＮＡ條帶亮度相近，或ｑＰＣＲ得出的１０份樣品Ｃｔ值變異系數(shù)≤１０％，表明樣品均勻性良好；

ｂ）有樣品為弱陽(yáng)性，甚至為陰性；或ｑＰＣＲ的１０份樣品Ｃｔ值變異系數(shù)＞１０％，則表明樣品均勻

性不良，需重新混勻分裝。

９．５質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測(cè)

設(shè)置３組質(zhì)粒樣品，分別放置于３７℃、４℃、－２０℃保存。分別在第１天、第３天、第５天、第７天、第２周、第３周、第１月直至第１年時(shí)間段，每組各取３支樣品，１個(gè)樣品應(yīng)至少設(shè)３個(gè)重復(fù)，使用相應(yīng)病原檢測(cè)方法推薦的引物和實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行檢測(cè)。

若質(zhì)粒經(jīng)以下３種方法平行處理后，ＰＣＲ或ｑＰＣＲ檢測(cè)結(jié)果仍為陽(yáng)性，說(shuō)明穩(wěn)定性良好，否則需重

新制備：

ａ）３７℃至少保存７ｄ；

５

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ｂ）４℃至少保存３周；

ｃ）－２０℃以下至少保存１年。

９．６質(zhì)粒的保存

９．６．１質(zhì)粒溶液的保存

質(zhì)粒原液分裝成５０μＬ／管，低于－２０℃條件下保存不超過(guò)１年，避免反復(fù)凍融，４℃條件下保存不超過(guò)３周。使用時(shí)取出相應(yīng)的量，根據(jù)９．２規(guī)定的方法重新檢測(cè)合格后使用。

９．６．２攜帶質(zhì)粒菌株的保存

符合ＳＣ／Ｔ７０１９的規(guī)定。

１０質(zhì)粒參考物質(zhì)的驗(yàn)證

質(zhì)粒作為水生動(dòng)物病原ＤＮＡ檢測(cè)參考物質(zhì)，應(yīng)經(jīng)過(guò)至少５家具備核酸提取和分子生物學(xué)檢測(cè)能力的水生動(dòng)物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的協(xié)作定值，定值內(nèi)容包括病原目的ＤＮＡ片段的特異性、定性檢測(cè)、定量檢測(cè)等內(nèi)容，定性檢測(cè)要求檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，定量檢測(cè)要求Ｃｔ值誤差范圍不超過(guò)±３．３。定值結(jié)果都合格后，才能投入使用。

１ 質(zhì)粒參考物質(zhì)的質(zhì)量判定

經(jīng)９．１～９．６步驟檢測(cè)，質(zhì)粒應(yīng)同時(shí)滿足以下５項(xiàng)要求，才能作為水生動(dòng)物病原ＤＮＡ核酸檢測(cè)參考物質(zhì)使用：

ａ）重組了病原目的ＤＮＡ片段，且片段序列與相應(yīng)病原的參考株序列同源性不低于９％；ｂ）每個(gè)反應(yīng)體系的最小取樣量不高于病原檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)推薦的反應(yīng)體系的加樣量；

ｃ）同批次樣品均勻性良好，檢測(cè)結(jié)果基本一致；

ｄ）有效期：３７℃至少保存７ｄ，４℃至少保存３周，－２０℃至少保存１年；

ｅ）經(jīng)過(guò)至少５家水生動(dòng)物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室協(xié)作定值，且定值結(jié)果全部合格。

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附 錄犃

（規(guī)范性）

質(zhì)粒制備方法

犃．１試劑或材料

犃．１．１水：符合ＧＢ／Ｔ６８２中的一級(jí)水的要求。

犃．１．２目的基因凝膠回收試劑和質(zhì)粒提取試劑：商品化試劑盒。犃．１．３空質(zhì)粒：ｐＧＥＭＴ、ｐＵＣｍＴ、ｐＢＬＵＥＴ等商品化試劑。犃．１．４ｄＮＴＰ：含ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ各２．５ｍｍｏｌ／Ｌ。

犃．１．５犜犪狇ＤＮＡ聚合酶：５Ｕ／μＬ，－２０℃保存，避免溫度劇烈變化。

犃．１．６擴(kuò)增病原目的基因的引物：根據(jù)國(guó)內(nèi)外相應(yīng)病原檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)推薦的引物序列合成。

犃．１．７Ｔ４ＤＮＡ連接酶：３５０Ｕ／μＬ，－２０℃保存，避免溫度劇烈變化。

犃．１．８ＩＰＴＧ：２０％，按照附錄Ｂ的Ｂ．１配制。犃．１．９Ｘｇａｌ：２％，按照Ｂ．２配制。

犃．１．１０大腸桿菌感受態(tài)ＤＨ５α：商品化試劑。

犃．１．１ ＬＢ培養(yǎng)基：按照Ｂ．３配制。

犃．１．１２５０×電泳緩沖液：按照Ｂ．４配制，也可選擇商品化試劑。

犃．１．１３溴化乙錠：１０ｍｇ／ｍＬ，按照Ｂ．５配制，也可選擇商品化試劑。

犃．１．１４６×上樣緩沖液：按照Ｂ．６配制，也可選擇商品化試劑。

犃．１．１５經(jīng)高溫高壓滅菌處理的耗材。

犃．２儀器設(shè)備

犃．２．１生化培養(yǎng)箱。犃．２．２恒溫?fù)u床。犃．２．３超凈工作臺(tái)。

犃．２．４冷凍高速離心機(jī)。

犃．２．５電子天平。犃．２．６高壓滅菌鍋。犃．２．７ＰＣＲ儀。

犃．２．８熒光定量ＰＣＲ儀。

犃．２．９電泳儀。

犃．２．１０紫外分光光度計(jì)。犃．２．１ 凝膠成像系統(tǒng)。犃．２．１２移液器。

犃．３質(zhì)粒參考物質(zhì)的制備

犃．３．１目的犇犖犃的擴(kuò)增

ＰＣＲ擴(kuò)增所使用的引物和反應(yīng)條件采用國(guó)內(nèi)外已發(fā)布的病原檢測(cè)方法中推薦的引物和反應(yīng)條件，

以病原基因組ＤＮＡ為模板，使用犜犪狇ＤＮＡ聚合酶及其專用緩沖液進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增。反應(yīng)產(chǎn)物至少為

２０μＬ。

７

庫(kù)七七標(biāo)準(zhǔn)下載

犌犅／犜４１８５—２０２１

犃．３．２犘犆犚反應(yīng)產(chǎn)物的上樣和電泳

物和

將５０×電泳緩沖液稀釋５０倍，配制１％的瓊脂糖（含０．５μｇ／ｍＬＥＢ）凝膠平板。將全部ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)

１／５體積的上樣緩沖液混勻后加入樣品孔。在電泳時(shí)使用核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物作對(duì)照。５Ｖ／ｃｍ

電泳２０ｍｉｎ～３０ｍｉｎ，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠平板２／３處時(shí)停止。

犃．３．３目的犇犖犃的回收

在紫外燈下觀察電泳后的凝膠，切下含目的基因的條帶，放入離心管中。采用商品化凝膠回收試劑盒提取目的ＤＮＡ。最后使用２０μＬ水溶解ＤＮＡ，－８０℃保存?zhèn)溆谩?/p>

犃．３．４目的犇犖犃連接入空質(zhì)粒

根據(jù)分子量計(jì)算目的ＤＮＡ和ｐＧＥＭＴｅａｓｙ的摩爾濃度，質(zhì)粒連接目的基因體系應(yīng)符合表Ａ．１

要求。

表犃．１質(zhì)粒連接目的基因體系

試劑

加入量

１０×Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅＢｕｆｅｒ

２．５μＬ

目的ＤＮＡ

０．３ｐｍｏｌ

ｐＧＥＭＴｅａｓｙ

０．０３ｐｍｏｌ

Ｔ４ＤＮＡ連接酶

１μＬ

ｄＨ２Ｏ

加水至總體積２５μＬ

反應(yīng)條件：１６℃，至少１２ｈ。

犃．３．５連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化與藍(lán)白篩選

犃．３．５．１取１０μＬ大腸桿菌ＤＨ５α感受態(tài)溶液于１．５ｍＬ離心管中，加入１０μＬ連接產(chǎn)物，將離心管置冰?。常埃恚椋?，４２℃水浴９０ｓ，再冰?。担恚椋睿患尤耄梗唉蹋蹋蹋屡囵B(yǎng)液，混勻，３７℃振蕩培育１ｈ。

犃．３．５．２取１０μＬ菌液，加入４０μＬＸｇａｌ溶液（２％）和７μＬＩＰＴＧ（２０％），混勻后，均勻涂布于含

１５０μｇ／ｍＬＡｍｐ的ＬＢ平板（９０ｍｍ直徑）上；室溫放置５ｍｉｎ后，３７℃倒置培養(yǎng)１２ｈ～１６ｈ。

犃．３．５．３另?。保唉蹋谈惺軕B(tài)溶液，不加連接產(chǎn)物，為陰性對(duì)照，同Ａ．３．５．２操作。

犃．３．５．４培養(yǎng)結(jié)果觀察：藍(lán)色菌落攜帶空質(zhì)粒，乳白色菌落攜帶質(zhì)粒；若未加入連接產(chǎn)物的菌液也生長(zhǎng)出菌落，說(shuō)明培養(yǎng)基中Ａｍｐ失效，需重新制備平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。

犃．３．５．５將平板放于４℃保存?zhèn)溆?。將１．５ｍＬ攜帶質(zhì)粒