核酸定量檢測技術(shù)

1、溫 州 醫(yī) 學(xué) 院 檢 驗 醫(yī) 學(xué) 院溫 州 醫(yī) 學(xué) 院 檢 驗 醫(yī) 學(xué) 院溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗科溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗科陶志華陶志華分子雜交定量分析技術(shù)(一一)分支鏈分支鏈DNA信號放大技術(shù)信號放大技術(shù) （bDNA)美國Chiron公司, 分別以微反應(yīng)板和瓊脂糖珠為載體，在定量檢測系統(tǒng)中，采用了一種人工合成的、結(jié)構(gòu)如同樹枝的DNA信號放大探針，分支鏈DNA（branched DNA）因此而得名。 （二）（二） 雙抗體夾心雜交法雙抗體夾心雜交法 英國Murex Diagnostics Ltd發(fā)明, 稱之為Digene系統(tǒng)。 該技術(shù)采用兩種抗DNA/RNA雜交體的抗體：一抗為捕獲抗體，

2、直接吸附在微孔反應(yīng)板上，二抗是偶聯(lián)了AP的標記抗體，通過酶促化學(xué)發(fā)光反應(yīng)檢測DNA/RNA雜交體的信號。真正的核酸探針是RNA，它能特異地與HBV DNA基因組負鏈互補。 （一）（一）PCR基因定量基礎(chǔ)基因定量基礎(chǔ)Yn=Yn-1*(1+Ev) 0 1Yn=X*(1+Ev)n LgY=LgX + n Lg(1+E)LgX = LgY - n Lg(1+E) 怎么辦？怎么辦？ YS n=XS*(1+ES)n YI n=XI *(1+EI)n YS n XS YI n XI ELISA-PCR技術(shù)技術(shù)Fam(495nm) Tamra(560nm) L640 Tet (520nm) Hex(537nm

3、) L705 Tamra/Fam Tamra/Tet Tamra/Hex 熒光定量熒光定量PCR技術(shù)技術(shù)熒光標記信號的產(chǎn)生熒光標記信號的產(chǎn)生特異性熒光探針特異性熒光探針 TaqmanTaqman雙熒光標記探針雙熒光標記探針 molecular Beaconmolecular Beacon熒光標記探針熒光標記探針 熒光標記雜交雙探針熒光標記雜交雙探針特異性熒光雙標記探針特異性熒光雙標記探針 Taq酶酶 5353外切酶活性外切酶活性lecu三. 熒光實時定量PCR的定量原理： Y=X(1+E)nLgY=LgX + n Lg(1+E)LgX = LgY - n Lg(1+E) n = LgY/ Lg

4、(1+E) 1/ Lg(1+E) LgX 熒光實時熒光實時PCR的定量概念的定量概念 標準曲線標準曲線未知標本未知標本Crossing Point (Cycles)log (copy number)nlog (F2/F1)nlog (F2/F1)Target在對數(shù)期進行定量分析的優(yōu)勢在對數(shù)期進行定量分析的優(yōu)勢l 擴增效率恒定擴增效率恒定 l 動態(tài)分析，變化靈敏動態(tài)分析，變化靈敏l 標準曲線呈線性標準曲線呈線性核酸定量檢測臨床應(yīng)用核酸定量檢測臨床應(yīng)用 免疫學(xué)診斷主要是抗原抗體反應(yīng)，應(yīng)用于臨床通常在免疫學(xué)診斷主要是抗原抗體反應(yīng)，應(yīng)用于臨床通常在體內(nèi)產(chǎn)生抗體以后，而許多病原體的免疫學(xué)檢測存在體內(nèi)產(chǎn)生

5、抗體以后，而許多病原體的免疫學(xué)檢測存在較長的較長的“窗口期窗口期”，比如，比如HCVHCV的的“窗口期窗口期”平均長達平均長達7070天，不利于對疾病的早期診斷；天，不利于對疾病的早期診斷；PCRPCR方法直接檢測病原方法直接檢測病原體的體的DNA/RNADNA/RNA，能大大縮短，能大大縮短“窗口期窗口期”，其高靈敏度的，其高靈敏度的檢測顯然也有利于疾病的早期診斷檢測顯然也有利于疾病的早期診斷。 熒光PCR可實現(xiàn)對點突變、缺失突變、插入突變、多基因突變等的檢測，對產(chǎn)前診斷具有其他方法不可比擬的優(yōu)勢，有利于優(yōu)生優(yōu)育，提高人口素質(zhì)。 熒光PCR可對病原體的母嬰傳播進行有效的監(jiān)控，為確定宮內(nèi)感染、圍產(chǎn)期感染或哺乳期感染等提供依據(jù)，為母嬰傳播的阻斷等提供參考。 可對原癌基因的突變和