第六章植物離體培養(yǎng)育種講述

1、 第六章第六章 植物離體培養(yǎng)育種植物離體培養(yǎng)育種 Tissue culture and breeding1 植物離體培養(yǎng)發(fā)展簡史、意義和生物學(xué)原理組織培養(yǎng)的概念組織培養(yǎng)的概念組織培養(yǎng)（組織培養(yǎng)（Tissue culture）是指用無菌方法使植物體的離是指用無菌方法使植物體的離體器官、組織和細(xì)胞在人為提體器官、組織和細(xì)胞在人為提供的條件下生長和發(fā)育的所有供的條件下生長和發(fā)育的所有培養(yǎng)技術(shù)的總稱，也稱之為離培養(yǎng)技術(shù)的總稱，也稱之為離體培養(yǎng)（體培養(yǎng)（In vitro culture）。）。 利用植物體的器官、組織或細(xì)利用植物體的器官、組織或細(xì)胞，通過無菌操作接種于人工配胞，通過無菌操作接種于人工配制

2、的培養(yǎng)基上，在一定的光照和制的培養(yǎng)基上，在一定的光照和溫度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使之生長溫度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使之生長發(fā)育的技術(shù)稱為組織培養(yǎng)發(fā)育的技術(shù)稱為組織培養(yǎng) 按培養(yǎng)材料分為（按培養(yǎng)材料分為（Gamborg等等)：組織培養(yǎng)的類型組織培養(yǎng)的類型愈傷組織培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)細(xì)細(xì) 胞胞 培培 養(yǎng)養(yǎng)器器 官官 培培 養(yǎng)養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)最為常見的組織培養(yǎng)最為常見的組織培養(yǎng) 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng) 單細(xì)胞培養(yǎng)單細(xì)胞培養(yǎng)胚、胚乳、珠心、子房、根、莖、胚、胚乳、珠心、子房、根、莖、葉、花和幼果的部分組織的培養(yǎng)葉、花和幼果的部分組織的培養(yǎng)類別 依外植體的不同劃分 胚胎培養(yǎng) （embryo culture）未

3、成熟或成熟了的胚器官培養(yǎng)（organ culture）根尖、莖尖、子葉、葉片、葉原基、花原基、或花果的未熟部分組織培養(yǎng)或愈傷組織培養(yǎng)（狹義，tissue culture）維管束形成層、貯藏薄壁組織及愈傷組織等細(xì)胞培養(yǎng) 單個游離細(xì)胞 （分離出的體細(xì)胞/花粉細(xì)胞/卵細(xì)胞） 原生質(zhì)體培養(yǎng) 除去細(xì)胞壁的原生質(zhì)體 植物組織培養(yǎng)是二十世紀(jì)發(fā)展起來的新技術(shù)，近三十年來由于組織培養(yǎng)基礎(chǔ)理論研究的深入，發(fā)展極為迅速，發(fā)表的文獻(xiàn)浩如煙海，幾乎以植物為研究對象的各個分支學(xué)科都在廣泛進(jìn)行組織培養(yǎng)。發(fā)展簡史發(fā)展簡史1838-1839年，德國科學(xué)家Schleide 和Schwann發(fā)表了細(xì)胞學(xué)說，奠定了組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)

4、。1902年，德國植物學(xué)家Haberlandt 根據(jù)細(xì)胞學(xué)說，提出單個細(xì)胞的植物細(xì)胞全能性（totipotency）理論。1904年，Hanning 最先成功地培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚。1922年，Knudson 采用胚培養(yǎng)法獲得大量蘭花幼苗。1934年，White 用番茄根尖建立起第一個活躍生長的無性繁殖系，從而使非胚器官的培養(yǎng)首先獲得成功。1958年，英國科學(xué)家Steward 等用胡蘿卜根的愈傷組織細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)出胚狀體并分化為完整的小植株，不但使細(xì)胞全能性理論得到證實，而且為組織培養(yǎng)的技術(shù)程序奠定了基礎(chǔ)。1962年，Murashinge 和Skoog 在煙草培養(yǎng)中篩選出至今仍被

5、廣泛使用的MS培養(yǎng)基。1964-1966年，印度科學(xué)家Guha 和Maheswari 在曼陀羅花藥培養(yǎng)中首次由花粉誘導(dǎo)得到了單倍體植株。1972年，Carlson 通過兩個種的煙草原生質(zhì)體融合培養(yǎng)，獲得了第一個體細(xì)胞雜交的雜種植株。發(fā)展簡史發(fā)展簡史植物組織培養(yǎng)在技術(shù)上的發(fā)展植物組織培養(yǎng)在技術(shù)上的發(fā)展q研究材料范圍逐步擴大q培養(yǎng)方法逐步完善q培養(yǎng)基不斷改進(jìn)q實驗手段逐步完備胚、胚軸、子葉、幼苗、莖尖、根、葉等；動物細(xì)胞+植物細(xì)胞/微生物原生質(zhì)體固體培養(yǎng)發(fā)展到液體振蕩或旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)、液滴培養(yǎng)、雙層培養(yǎng)、包埋培養(yǎng)White培養(yǎng)基、培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基、培養(yǎng)基、MT培養(yǎng)基等培養(yǎng)基等植物組織培養(yǎng)在農(nóng)業(yè)

6、上的應(yīng)用植物組織培養(yǎng)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用q倍性育種：花藥培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)倍性育種：花藥培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)q突變體篩選：愈傷組織培養(yǎng)突變體篩選：愈傷組織培養(yǎng)q創(chuàng)造新種質(zhì)：細(xì)胞融合創(chuàng)造新種質(zhì)：細(xì)胞融合 克服胚敗育：胚培養(yǎng)克服胚敗育：胚培養(yǎng)q植物性藥物和生物制品的生產(chǎn)植物性藥物和生物制品的生產(chǎn)組織培養(yǎng)的意義組織培養(yǎng)的意義 胚胎培養(yǎng) 主要克服遠(yuǎn)緣雜交中胚不能在種子中正常發(fā)育而早期敗育的問題。胚珠和子房培養(yǎng) 進(jìn)行試管內(nèi)受精和雜種胚的分化成長，以克服不育性和不親和性等障礙。細(xì)胞及組織培養(yǎng) 進(jìn)行優(yōu)良單系的快速繁殖，自交不親和系、雄性不育系的無性繁殖，突變體的誘導(dǎo)與分離及種質(zhì)的保存和運輸?shù)确矫??；ㄋ幖盎ǚ叟囵B(yǎng) 單倍體育種

7、，加速獲得純二倍體。原生質(zhì)體培養(yǎng) 進(jìn)行體細(xì)胞雜交、核移植和核置換等工作。 愈傷組織愈傷組織培養(yǎng)是最為常見的組織培養(yǎng)方式？培養(yǎng)是最為常見的組織培養(yǎng)方式？愈傷組織（愈傷組織（Callus）：）：原指植物在受傷后，于傷口表面形成的一團薄壁細(xì)胞。原指植物在受傷后，于傷口表面形成的一團薄壁細(xì)胞。在組織培養(yǎng)中，指在人工培養(yǎng)基上由外植體長出來的在組織培養(yǎng)中，指在人工培養(yǎng)基上由外植體長出來的一團無序生長的薄壁細(xì)胞。一團無序生長的薄壁細(xì)胞。原因：原因： 大部分組織培養(yǎng)經(jīng)歷大部分組織培養(yǎng)經(jīng)歷callus再生途徑長出植株；再生途徑長出植株； callus可以用于懸浮培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)?？梢杂糜趹腋∨囵B(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)

8、。 按培養(yǎng)方法：固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)、微室培按培養(yǎng)方法：固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)、微室培養(yǎng)、包埋培養(yǎng)等養(yǎng)、包埋培養(yǎng)等 按培養(yǎng)過程：初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)按培養(yǎng)過程：初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)組織培養(yǎng)的類型組織培養(yǎng)的類型q外植體外植體（Explants）由活植物體上切取下來的可以用于組織培養(yǎng)的組織或器官由活植物體上切取下來的可以用于組織培養(yǎng)的組織或器官q初代培養(yǎng)（初代培養(yǎng)（Primary culture）q繼代培養(yǎng)（繼代培養(yǎng)（Subculture）指外植體的最初培養(yǎng)指外植體的最初培養(yǎng)將初代培養(yǎng)得到的培養(yǎng)體移植于新鮮培養(yǎng)基中，這種反將初代培養(yǎng)得到的培養(yǎng)體移植于新鮮培養(yǎng)基中，這種反復(fù)多次移植的培養(yǎng)，

9、稱為繼代培養(yǎng)復(fù)多次移植的培養(yǎng)，稱為繼代培養(yǎng)生物學(xué)原理生物學(xué)原理 植物的再生作用：植物的根、莖、葉等器官、組織和細(xì)胞都具有再生成完整植株的能力。其是無性繁殖的基礎(chǔ)，它是受內(nèi)源激素調(diào)控的。人工控制和調(diào)整培養(yǎng)基成分，可使其發(fā)育成完整的植株。細(xì)胞的分化和形態(tài)發(fā)生：指細(xì)胞在分裂過程中發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能方面的改變，從而在植物個體發(fā)育過程中形成各類組織和器官，完成整個生活周期。植物細(xì)胞的全能性（totipotent）：是指植物每個細(xì)胞都 具有該植物體的全部遺傳信息和發(fā)育成完整植株的能力。原理原理：生物體的每一個細(xì)胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)，都有發(fā)育成為完整個體所必需的全部基因，從理論上講，生物體的每一

10、個活細(xì)胞都應(yīng)該具有全能性。差異：差異：（1） 受精卵的全能性最高 （2） 受精卵分化后的細(xì)胞中，體細(xì)胞的全能性比生殖細(xì)胞的低。潛在全能性的原因潛在全能性的原因：基因表達(dá)的選擇性 科學(xué)研究表明，處于離體狀態(tài)的植物活細(xì)胞，在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件的作用下，就可能表現(xiàn)出全能性，發(fā)育成完整的植株。人工條件下實現(xiàn)的這一過程，就是植物組織培養(yǎng)。 生物學(xué)原理生物學(xué)原理 植物細(xì)胞全能性的表達(dá) 脫分化脫分化（dedifferentiation)：將來自已分化組織的已停止分裂的細(xì)胞從植物體部分的抑制性影響下解脫出來，恢復(fù)細(xì)胞的分裂活性。 再分化再分化（redifferentiation):經(jīng)脫分化的組

11、織或細(xì)胞在一定的培養(yǎng)條件下可有轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N不同細(xì)胞類型的能力。離體的植物離體的植物器官、組織、器官、組織、細(xì)胞細(xì)胞脫分化脫分化愈愈傷傷組組織織再分化再分化根根芽芽植植物物體體植物植物組織組織培養(yǎng)培養(yǎng)過程過程植物組織培養(yǎng)特點植物組織培養(yǎng)特點培養(yǎng)條件可以人為控制培養(yǎng)條件可以人為控制 組織培養(yǎng)擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災(zāi)害性氣組織培養(yǎng)擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災(zāi)害性氣候的不利影響，且條件均一，對植物生長極為有利，便于穩(wěn)候的不利影響，且條件均一，對植物生長極為有利，便于穩(wěn)定地進(jìn)行周年培養(yǎng)生產(chǎn)。定地進(jìn)行周年培養(yǎng)生產(chǎn)。生長周期短，繁殖率高生長周期短，繁殖率高 植物組織培養(yǎng)是由于人為控制培養(yǎng)條

12、件，根據(jù)不同植物不植物組織培養(yǎng)是由于人為控制培養(yǎng)條件，根據(jù)不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培養(yǎng)條件，因此生長較快。同部位的不同要求而提供不同的培養(yǎng)條件，因此生長較快。總體來說成本低廉，且能及時提供規(guī)格一致的優(yōu)質(zhì)種苗或脫總體來說成本低廉，且能及時提供規(guī)格一致的優(yōu)質(zhì)種苗或脫病毒種苗。病毒種苗。管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動化控制管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動化控制 植物組織培養(yǎng)是在一定的場所和環(huán)境下，人為提供一定的溫植物組織培養(yǎng)是在一定的場所和環(huán)境下，人為提供一定的溫度、光照、濕度、營養(yǎng)、激素等條件，既利于高度集約化和度、光照、濕度、營養(yǎng)、激素等條件，既利于高度集約化和高密度工廠化生產(chǎn)，也利

13、于自動化控制生產(chǎn)。高密度工廠化生產(chǎn)，也利于自動化控制生產(chǎn)。技術(shù)用途技術(shù)用途q快繁：人工種子、莖尖培養(yǎng)快繁：人工種子、莖尖培養(yǎng)q脫毒：微芽嫁接、莖尖培養(yǎng)脫毒：微芽嫁接、莖尖培養(yǎng)q克服雜交不親和：花藥培養(yǎng)、細(xì)胞克服雜交不親和：花藥培養(yǎng)、細(xì)胞 融合融合q種質(zhì)資源保存和交換：愈傷組織培養(yǎng)、莖尖培養(yǎng)種質(zhì)資源保存和交換：愈傷組織培養(yǎng)、莖尖培養(yǎng)MSMS培養(yǎng)基培養(yǎng)基 它是它是19621962年由年由MurashigeMurashige和和SkoogSkoog為培養(yǎng)煙草細(xì)胞為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計的。特點是無機鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平而設(shè)計的。特點是無機鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例

14、較合適，可滿足植物的營養(yǎng)衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足植物的營養(yǎng)和生理需要。它的硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高，廣泛地和生理需要。它的硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高，廣泛地用于植物的器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。用于植物的器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變而來的。有些培養(yǎng)基是由它演變而來的。B B5 5培養(yǎng)基培養(yǎng)基 是是19681968年由年由GalmborgGalmborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計的。其主要特點是含有較低的銨，這可能對不少培養(yǎng)物的的。其主要特點是含有較低的銨，這可能對不少培養(yǎng)物的生長有抑制作用。從實踐得知有些植

15、物在生長有抑制作用。從實踐得知有些植物在B B5 5培養(yǎng)基上生長培養(yǎng)基上生長更適宜，如雙子葉植物特別是木本植物。更適宜，如雙子葉植物特別是木本植物。一、目前國際上流行的培養(yǎng)基及特點一、目前國際上流行的培養(yǎng)基及特點2 2 植物離體培養(yǎng)需要的基本條件植物離體培養(yǎng)需要的基本條件White培養(yǎng)基培養(yǎng)基 是是1943年由年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計的。為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計的。1963年又作了改良，稱作年又作了改良，稱作White改良培養(yǎng)基，提高了改良培養(yǎng)基，提高了MsSO4的濃度和增加了硼素。其特點是無機機鹽數(shù)量較低，的濃度和增加了硼素。其特點是無機機鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。適于生根培養(yǎng)。N6培

16、養(yǎng)基培養(yǎng)基 是是1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計的。其特點是成分較簡單，而設(shè)計的。其特點是成分較簡單，KNO3和（和（NH4）2SO4含含量高。在國內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花藥量高。在國內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養(yǎng)和其他組織培養(yǎng)。培養(yǎng)和其他組織培養(yǎng)。KM8P培養(yǎng)基培養(yǎng)基 它是它是1974年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計的。其年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計的。其特點是有機成分較復(fù)雜，它包括了所有的單糖和維生素，特點是有機成分較復(fù)雜，它包括了所有的單糖和維生素，廣泛用于原生質(zhì)融合的培養(yǎng)。廣泛用于原生質(zhì)融合的培養(yǎng)。 包括包括無機成分無機

17、成分和和有機成分有機成分。無機成分包括大量元素和微。無機成分包括大量元素和微量元素。有機成分主要包括糖類、維生素、氨基酸和酰胺量元素。有機成分主要包括糖類、維生素、氨基酸和酰胺類、含氮堿基、生長調(diào)節(jié)劑、自然復(fù)合物（如水解蛋白、類、含氮堿基、生長調(diào)節(jié)劑、自然復(fù)合物（如水解蛋白、酵母提取物、果肉和果汁等）以及其他成分如瓊脂等。酵母提取物、果肉和果汁等）以及其他成分如瓊脂等。培養(yǎng)基的基本成分培養(yǎng)基的基本成分 植物對無機鹽類的需求具有廣泛的一致性，偶然加植物對無機鹽類的需求具有廣泛的一致性，偶然加以變動。一般多采用蔗糖。維生素中最關(guān)鍵的是以變動。一般多采用蔗糖。維生素中最關(guān)鍵的是B1，一般用量為一般用

18、量為0.1-0.4毫克毫克/升。氨基酸和酰胺只用于某些升。氨基酸和酰胺只用于某些組織培養(yǎng)，而在器官增殖階段加入腺嘌呤也可能是需組織培養(yǎng)，而在器官增殖階段加入腺嘌呤也可能是需要的。關(guān)鍵的有機成分主要是激素和細(xì)胞分裂素。要的。關(guān)鍵的有機成分主要是激素和細(xì)胞分裂素。培養(yǎng)基成分的性質(zhì)培養(yǎng)基成分的性質(zhì) 可以采用固體或者液體培養(yǎng)基，根據(jù)不同植物和不同培可以采用固體或者液體培養(yǎng)基，根據(jù)不同植物和不同培養(yǎng)階段而定。固體培養(yǎng)基中以瓊脂質(zhì)量好，配制時可以通養(yǎng)階段而定。固體培養(yǎng)基中以瓊脂質(zhì)量好，配制時可以通過調(diào)節(jié)過調(diào)節(jié)pH值來達(dá)到適合的凝膠狀態(tài)即可。液體培養(yǎng)基養(yǎng)值來達(dá)到適合的凝膠狀態(tài)即可。液體培養(yǎng)基養(yǎng)時也有固定和攪

19、動兩種時也有固定和攪動兩種。培養(yǎng)基的物理性質(zhì)培養(yǎng)基的物理性質(zhì)大量元素大量元素N、P、S、K、Ca、MgN：各種氨基酸、維生素、蛋白質(zhì)和核酸的重要成分各種氨基酸、維生素、蛋白質(zhì)和核酸的重要成分Ca：細(xì)胞壁穩(wěn)定細(xì)胞壁穩(wěn)定Mg：酶及輔酶的成分酶及輔酶的成分微量元素微量元素Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo用量少，過多容易導(dǎo)致中毒用量少，過多容易導(dǎo)致中毒激素激素v細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素v赤霉素赤霉素v生長素生長素促進(jìn)促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化不定芽細(xì)胞分裂和分化不定芽6-BA6-BA、KTKT、ZAZA、2iP2iP誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂和根的分化誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂和根的分化IBAIBA、IAAIAA、NAANAA、2,4-

20、D2,4-DIBAIBA、IAAIAA和和IAAIAA誘導(dǎo)生根，誘導(dǎo)生根，2,4-D2,4-D誘導(dǎo)愈傷組織誘導(dǎo)愈傷組織抑制愈傷組織形成，促進(jìn)芽的形成抑制愈傷組織形成，促進(jìn)芽的形成GAGA3 3 幾種激素的配制方法幾種激素的配制方法生長素生長素細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素赤霉素赤霉素95%95%的酒精或的酒精或0.1mol/L0.1mol/L的的NaOHNaOH或或KOHKOH0.50.5或或1mol/L1mol/L的的HCl+HCl+微熱微熱溶于水，溶于水，pH5.7pH5.7但不穩(wěn)定，用但不穩(wěn)定，用95%95%的酒精的酒精I(xiàn)AAIAA母液（母液（stock solutionstock solutio

21、n）每周制備新鮮備用，容易見光分解（幾天內(nèi)），）每周制備新鮮備用，容易見光分解（幾天內(nèi)），也容易被植株組織在幾小時到幾天內(nèi)分解。生長素也容易被植株組織在幾小時到幾天內(nèi)分解。生長素110-120110-120 C C穩(wěn)定保存穩(wěn)定保存1 1小時，小時，但但I(xiàn)AAIAA可以被低可以被低pHpH、光、氧和過氧化物破壞。、光、氧和過氧化物破壞。NAANAA和和2,4-D2,4-D比比IAAIAA穩(wěn)定。穩(wěn)定。CTKCTK母液可以在冰箱中保存幾個月，在長時間的實驗中，也可能被分解。母液可以在冰箱中保存幾個月，在長時間的實驗中，也可能被分解。KTKT和和ZTZT在在120120 C C處理處理1 1小時仍能穩(wěn)

22、定存在，小時仍能穩(wěn)定存在，BA100BA100 C C時時2020分鐘。分鐘。在堿性條件下，在堿性條件下，GAGA變成無活性的異構(gòu)體，在強酸性環(huán)境和高溫下，變成無活性的異構(gòu)體，在強酸性環(huán)境和高溫下，GAGA也變也變成無活性的形式。成無活性的形式。GAGA熱不穩(wěn)定，熱不穩(wěn)定，114114 C C處理處理2020分鐘降低其活性達(dá)分鐘降低其活性達(dá)90%90%，母液，母液需制備新鮮的，并且采用過濾滅菌。需制備新鮮的，并且采用過濾滅菌。激素配比模式生長素與細(xì)胞分裂素的比例決定著發(fā)育的方向，是愈生長素與細(xì)胞分裂素的比例決定著發(fā)育的方向，是愈傷組織、長根還是長芽。如為了促進(jìn)芽器官的分化，傷組織、長根還是長芽

23、。如為了促進(jìn)芽器官的分化，應(yīng)除去或降低生長素的濃度，或者調(diào)整培養(yǎng)基中生長應(yīng)除去或降低生長素的濃度，或者調(diào)整培養(yǎng)基中生長素與細(xì)胞分裂素的比例。素與細(xì)胞分裂素的比例。高 有利于根的形成和愈傷組織的形成;適中 有利于根芽的分化;低 有利于芽的形成;生長素生長素/細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用甚微，一般用生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用甚微，一般用mgL表示濃度。在組織表示濃度。在組織培養(yǎng)中生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用濃度，因植物的種類、部位、時培養(yǎng)中生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用濃度，因植物的種類、部位、時期、內(nèi)源激素等的不同而異，一般生長素濃度的使用為期、內(nèi)源激素等的不同而異，一般生長素濃度的使用為0.05-5mgL，細(xì)胞分

24、裂素，細(xì)胞分裂素0.0510mgL。 Growth medium is optimised for regeneration of plantletsNo sucrose (0%)Sucrose reduced to 1%Sucrose increased to 5%The explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface Very few shoots have developed on the explant. No roots and no call

25、us.Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occuredShoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control mediumtissue culture in the African Violet No BAP BAP reduced to 0.1 mg. l-1 N

26、o NAAPoor shoot development and no roots. Extensive callus generationPoor shoot development and no rootsNAA reduced to 0.1 mg. l-1 More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explantProfuse development of roots and a reduced numbe

27、r of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explantNo BAP BAP reduced to 0.1 mg. l-1 No NAAPoor shoot development and no roots. Extensive callus generationPoor shoot development and no rootsNAA reduced to 0.1 mg. l-1 More balanced development of roots and shoots. However,

28、undifferentiated callus is developing at the edges of the explantProfuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant 有機物質(zhì)有機物質(zhì)(Vitamins and amino acids)Vit B1Vit B6Vit B3Vit B5肌醇肌醇CHLHMEYE硫胺素硫胺素鹽酸吡哆醇鹽酸吡哆醇煙酸煙酸泛酸鈣泛酸鈣水解酪蛋白水解酪蛋白(c

29、asein hydrolysate)水解乳蛋白水解乳蛋白(lactoalbumin hydrolysate)麥芽提取物麥芽提取物(malt extract)酵母浸出物酵母浸出物(yeast extract)促進(jìn)細(xì)胞對培養(yǎng)基的反應(yīng)固化劑（固化劑（gelling agent）v瓊脂瓊脂來于來于seaweedseaweed對植物組織有一定的生理作用對植物組織有一定的生理作用用量一般為用量一般為7-10g/L7-10g/L，即，即0.7-1%0.7-1%（W/VW/V）太大，培養(yǎng)基過硬；太大，培養(yǎng)基過硬；太小，培養(yǎng)基不易凝固太小，培養(yǎng)基不易凝固不同品牌的瓊脂對外植體的反應(yīng)也不一樣。不同品牌的瓊脂對外植

30、體的反應(yīng)也不一樣。v其它其它gelling agent：Gelrite（脫乙酰吉蘭糖膠）：（脫乙酰吉蘭糖膠）：透明，透明，Pseudomanas種發(fā)酵產(chǎn)物（多糖）種發(fā)酵產(chǎn)物（多糖）成分穩(wěn)定。成分穩(wěn)定。碳源碳源營養(yǎng)物質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)滲透壓穩(wěn)定劑滲透壓穩(wěn)定劑類型類型蔗糖蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、麥芽糖、淀粉等葡萄糖、果糖、山梨醇、麥芽糖、淀粉等濃度濃度2-5%2-5%（W/VW/V）低濃度適合于原生質(zhì)體培養(yǎng)低濃度適合于原生質(zhì)體培養(yǎng)高濃度適合于胚和花藥培養(yǎng)高濃度適合于胚和花藥培養(yǎng)作用作用蔗糖長時間高溫處理會發(fā)生焦糖化，形成蔗糖長時間高溫處理會發(fā)生焦糖化，形成 蛋白黑素，抑蛋白黑素，抑制細(xì)胞生長制細(xì)胞生長

31、pHpH計計培養(yǎng)基的培養(yǎng)基的pH pH值：值：5.56v6：the gel may be too firmv滅菌后滅菌后pH會降低會降低0.6-1.3v培養(yǎng)材料降低培養(yǎng)材料降低pH：產(chǎn)生有機酸，：產(chǎn)生有機酸，N利用利用測定方法測定方法vpH試紙試紙vpH計計pH調(diào)整方法調(diào)整方法v1N的的HCl和和NaOHv在加入在加入agar前調(diào)前調(diào)pH培養(yǎng)基的選擇和配制培養(yǎng)基的選擇和配制選擇選擇擇材料和種類而異擇材料和種類而異參考前人的研究參考前人的研究MS培養(yǎng)基最為基本：培養(yǎng)基最為基本：高濃度的高濃度的N、K和和NH4+自己試驗自己試驗配制配制配母液（配母液（Stock solution)取樣取樣加成分加

32、成分測測pHok母液的配制母液的配制大量元素大量元素微量元素微量元素v濃縮濃縮1010倍（量加大倍（量加大1010倍）倍）v在配制在配制1L1L培養(yǎng)培養(yǎng)基時，只取培養(yǎng)培養(yǎng)基時，只取100ml100mlv濃縮濃縮100100倍（量加大倍（量加大100100倍）倍）v在配制在配制1L1L培養(yǎng)培養(yǎng)基時，只取培養(yǎng)培養(yǎng)基時，只取10ml10ml以以KNO3為例為例1L培養(yǎng)基需要量為培養(yǎng)基需要量為19g。在配制母液時，增加在配制母液時，增加10倍量，為倍量，為190g。在母液。在母液中的濃度為中的濃度為190g/L，即，即0.19g/ml在配制培養(yǎng)基時，取在配制培養(yǎng)基時，取10ml，10ml0.19g/m

33、l=19g無菌室無菌室培養(yǎng)室和接種室培養(yǎng)室和接種室室內(nèi)滅菌可用室內(nèi)滅菌可用2%2%新潔爾敏擦洗新潔爾敏擦洗75%75%乙醇噴霧乙醇噴霧UVUV照射照射2020分鐘分鐘培養(yǎng)基培養(yǎng)基滅菌方法滅菌方法v高溫高壓蒸氣滅菌高溫高壓蒸氣滅菌v過濾滅菌過濾滅菌121121C C，1.1kg/cm1.1kg/cm2 2,15-20,15-20分鐘，時間過長，培養(yǎng)基成分鐘，時間過長，培養(yǎng)基成分易變性失效分易變性失效在高溫高壓下易分解的培養(yǎng)基和激素類在高溫高壓下易分解的培養(yǎng)基和激素類器皿和接種工具的滅菌器皿和接種工具的滅菌解剖刀、鑷子、剪刀等工具采用干熱滅菌法，解剖刀、鑷子、剪刀等工具采用干熱滅菌法，用烘箱滅菌，

34、用烘箱滅菌，120 120 C C時時1 1小時小時外植體的滅菌原則外植體的滅菌原則 充分滅菌，但不能損傷外植體充分滅菌，但不能損傷外植體 不同外植體，滅菌要求不一樣不同外植體，滅菌要求不一樣常用方法常用方法v75%乙醇乙醇v氯化汞（升汞）氯化汞（升汞）v次氯酸鈉次氯酸鈉表面殺菌，具濕潤和殺菌作用，浸表面殺菌，具濕潤和殺菌作用，浸3030秒秒常用濃度常用濃度0.1%0.1%處理處理5-105-10分鐘，有殘毒分鐘，有殘毒濃度濃度2-10%2-10%，時間，時間15-3015-30分鐘，對植物無害分鐘，對植物無害 培養(yǎng)所需環(huán)境條件培養(yǎng)所需環(huán)境條件 光照強度光照強度：一般而言，愈傷組織的形成并不需

35、要光照； 培養(yǎng)前期1000-4000lx，后期10000 lx。 光照時數(shù)光照時數(shù)：不同培養(yǎng)的組織其光照時間不同，如煙 草愈傷組織采用1000 lx 16小時/日培養(yǎng)； 而花椰菜組織培養(yǎng)則以4000 lx 9小時/日 光照為宜。 光質(zhì)光質(zhì)：一般采用日光燈作為光源。組織培養(yǎng)中關(guān)鍵 的器官形成作用，是種光形態(tài)發(fā)生現(xiàn)象， 是受光敏色素控制的。 溫度溫度：一般習(xí)慣將培養(yǎng)物置于恒溫下，通常應(yīng)用的溫度 為25OC 左右。光光3 通過花藥及花粉培養(yǎng)的單倍體育種 單倍體植物在育種上的意義單倍體植物在育種上的意義 概念：凡是具有配子體的染色體數(shù)的植物稱為單倍體植物。單倍體一倍體，是一個“半倍體”。單倍體在自然界

36、普遍存在，1922年發(fā)現(xiàn)了曼陀羅的單倍體植株，但自然發(fā)生率很低（0.0020.02%）。 人工誘導(dǎo)單倍體在育種上的用途人工誘導(dǎo)單倍體在育種上的用途 從單倍體的染色體加倍即可獲得純合的二倍體，也可獲得純合的多倍體，育種途徑快速。 有利于遠(yuǎn)緣雜種新類型的培育和穩(wěn)定。 單倍體植物與誘變育種相結(jié)合，可以加速誘變育種的進(jìn)程?；ㄋ幖盎ǚ叟囵B(yǎng)工作的進(jìn)展花藥及花粉培養(yǎng)工作的進(jìn)展 起始于20世紀(jì)40年代，最初研究目的是調(diào)節(jié)和控制從花粉母細(xì)胞到成熟花粉的生長發(fā)育。大約經(jīng)過半個世紀(jì)的發(fā)展，通過花藥和花粉培養(yǎng)誘導(dǎo)形成單倍體植物，目前在世界范圍內(nèi)已得到普及，已從170多種植物成功地誘導(dǎo)形成花粉起源植株或愈傷組織，以茄科

37、、十字花科蔬菜作物研究居多。在曼陀羅、番茄、麝香百合、銀杏、煙草、矮牽牛等植物上都較早誘導(dǎo)成功單倍體植物。 花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù) 1.花藥培養(yǎng)技術(shù)流程圖花藥培養(yǎng)技術(shù)流程圖切下花蕾切下花蕾消毒消毒1010分鐘分鐘 沖洗兩次沖洗兩次花藥接種培養(yǎng)花藥接種培養(yǎng)愈傷組織或胚狀體愈傷組織或胚狀體再生培養(yǎng)再生培養(yǎng)完整植株完整植株 花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)花粉培養(yǎng)花粉培養(yǎng) 的花粉分離和培養(yǎng)方法的花粉分離和培養(yǎng)方法機械分離培養(yǎng)法機械分離培養(yǎng)法（包括液體培養(yǎng)基培養(yǎng)法和固體培養(yǎng)基培養(yǎng)法）；2.散落花粉散落花粉（shed pollen）培養(yǎng)法培養(yǎng)法。花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)之比較花藥培養(yǎng)和花粉培

38、養(yǎng)之比較 統(tǒng)計表明，通過花藥培養(yǎng)獲得單倍體的植物種類或品統(tǒng)計表明，通過花藥培養(yǎng)獲得單倍體的植物種類或品種較多；設(shè)備上要求簡單?；ǚ叟囵B(yǎng)有花藥培養(yǎng)不能比擬種較多；設(shè)備上要求簡單。花粉培養(yǎng)有花藥培養(yǎng)不能比擬的優(yōu)點的優(yōu)點完全排除了花藥組織的干擾，避免花粉與花藥完全排除了花藥組織的干擾，避免花粉與花藥組織的體細(xì)胞形成分裂和增殖的競爭，更有利于花粉植株組織的體細(xì)胞形成分裂和增殖的競爭，更有利于花粉植株的形成，所誘導(dǎo)形成的胚狀體、愈傷組織及植株均來自花的形成，所誘導(dǎo)形成的胚狀體、愈傷組織及植株均來自花粉，可省略對其鑒定的程序；在誘導(dǎo)形成單倍體的同時，粉，可省略對其鑒定的程序；在誘導(dǎo)形成單倍體的同時，若結(jié)合

39、突變體篩選和進(jìn)行基因操作研究時，花粉培養(yǎng)更具若結(jié)合突變體篩選和進(jìn)行基因操作研究時，花粉培養(yǎng)更具優(yōu)勢。優(yōu)勢。花藥培養(yǎng)技術(shù)花藥培養(yǎng)技術(shù)1964年年Guha&Maheshwari南洋金花花藥培養(yǎng)發(fā)育成胚；南洋金花花藥培養(yǎng)發(fā)育成胚；1967年年Bourgin&Nitsch花藥培養(yǎng)獲得煙草植株；花藥培養(yǎng)獲得煙草植株；花藥培養(yǎng)方法：花藥培養(yǎng)方法： 接種了花藥的培養(yǎng)基一般在24-27OC，光照為2000lx ，每天14小時培養(yǎng)。大約經(jīng)過20-30天，即可發(fā)現(xiàn)花藥開裂，長出愈傷組織或釋放出胚狀體。將愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，便可以進(jìn)一步分化再生出完整植株來。花藥材料的選取花藥材料的選取

40、選材關(guān)鍵在于選取花粉處于合適發(fā)育期的花藥，離體選材關(guān)鍵在于選取花粉處于合適發(fā)育期的花藥，離體培養(yǎng)后才能啟動花粉發(fā)育。實踐表明，從減數(shù)分裂期至雙培養(yǎng)后才能啟動花粉發(fā)育。實踐表明，從減數(shù)分裂期至雙核期的花藥，均有可能誘導(dǎo)離體孤雌發(fā)育。核期的花藥，均有可能誘導(dǎo)離體孤雌發(fā)育。 大多數(shù)園藝植物的花藥培養(yǎng)，成功率最高的時期為單大多數(shù)園藝植物的花藥培養(yǎng)，成功率最高的時期為單核期，或單核中晚期。核期，或單核中晚期?；ㄋ幣囵B(yǎng)技術(shù)步驟花藥培養(yǎng)技術(shù)步驟選幼年樹花蕾選幼年樹花蕾取下花蕾取下花蕾3-5度低溫冷處度低溫冷處理理3-10天天取花藥取花藥鏡檢鏡檢消毒接消毒接種培養(yǎng)種培養(yǎng)再生再生花粉培養(yǎng)花粉培養(yǎng) 50年代開始裸

41、子植物花粉培養(yǎng)，獲得愈傷組織；年代開始裸子植物花粉培養(yǎng)，獲得愈傷組織； 50、60年代被子植物花粉培養(yǎng)失??；年代被子植物花粉培養(yǎng)失敗； 1974年年Nitsch等次曼陀羅和煙草花粉獲得植株等次曼陀羅和煙草花粉獲得植株花粉培養(yǎng)的優(yōu)點花粉培養(yǎng)的優(yōu)點q 從少量花粉獲得大量花粉植株；從少量花粉獲得大量花粉植株；q 避免花藥壁產(chǎn)生的體細(xì)胞愈傷組織干擾，直接觀察小孢子避免花藥壁產(chǎn)生的體細(xì)胞愈傷組織干擾，直接觀察小孢子發(fā)育過程；發(fā)育過程；花粉培養(yǎng)技術(shù)步驟花粉培養(yǎng)技術(shù)步驟v藥壁向花粉提供營養(yǎng)物質(zhì)；藥壁向花粉提供營養(yǎng)物質(zhì)；v通過藥壁吸收、貯存和轉(zhuǎn)化培通過藥壁吸收、貯存和轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中的外源物質(zhì)養(yǎng)基中的外源物質(zhì)選幼

42、年樹花蕾選幼年樹花蕾取下花蕾取下花蕾（鏡檢）（鏡檢）預(yù)培養(yǎng)數(shù)天預(yù)培養(yǎng)數(shù)天取花藥取花藥接種接種分離分離花粉花粉低溫預(yù)處理低溫預(yù)處理消毒消毒過濾離心過濾離心再生再生影響花藥（粉）培養(yǎng)的因素影響花藥（粉）培養(yǎng)的因素q供體基因型差異和發(fā)育差異供體基因型差異和發(fā)育差異 甜椒、天竺葵甜椒、天竺葵 旺盛植株，早期花蕾旺盛植株，早期花蕾q花藥（花粉）的生理狀態(tài)花藥（花粉）的生理狀態(tài)q花粉發(fā)育期花粉發(fā)育期四分體期、小孢子早期、中期和四分體期、小孢子早期、中期和晚期（單核靠邊期）晚期（單核靠邊期）、有絲分裂期和雙核花粉期有絲分裂期和雙核花粉期 利用花粉和花藥培養(yǎng)于育種時，需足量供選擇單倍體植利用花粉和花藥培養(yǎng)于育

43、種時，需足量供選擇單倍體植株。故如何提高誘導(dǎo)形成率十分重要。培養(yǎng)條件很關(guān)鍵株。故如何提高誘導(dǎo)形成率十分重要。培養(yǎng)條件很關(guān)鍵。q培養(yǎng)前低溫預(yù)處理培養(yǎng)前低溫預(yù)處理q培養(yǎng)基與培養(yǎng)方式的影響培養(yǎng)基與培養(yǎng)方式的影響花藥、花粉培養(yǎng)前和培養(yǎng)初期的短期高溫、低溫、離心、花藥、花粉培養(yǎng)前和培養(yǎng)初期的短期高溫、低溫、離心、減壓等。減壓等。 3-53-5 C3-10C3-10天，提高小孢子反應(yīng)能力：曼陀羅、天，提高小孢子反應(yīng)能力：曼陀羅、天仙子、柑桔天仙子、柑桔 花藥培養(yǎng)采用最多的培養(yǎng)基為花藥培養(yǎng)采用最多的培養(yǎng)基為MSMS。我國科學(xué)工作者研制。我國科學(xué)工作者研制的的N6N6和馬鈴薯培養(yǎng)基；和馬鈴薯培養(yǎng)基； 液體懸浮

44、培養(yǎng)比固體培養(yǎng)基好；液體懸浮培養(yǎng)比固體培養(yǎng)基好； 細(xì)胞分裂素有利于花粉胚形成；細(xì)胞分裂素有利于花粉胚形成； 早期要求高蔗糖濃度：早期要求高蔗糖濃度：5-10%5-10%再生植株倍性和單倍體植株的保存及其加倍再生植株倍性和單倍體植株的保存及其加倍 在通過花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng)獲得的再生植株中，除單倍體植株外，非單倍體出現(xiàn)的頻率與植物種類、再生途徑以及培養(yǎng)基的成分有關(guān)。一般來說，在通過胚狀體途徑獲得的再生植株中，其單倍體植株占有率較高。但種類不同也存在差異。例如從煙草花藥再生植株幾乎全部是單倍體植株，而在大白菜和油菜上，單倍體植株則分別占74%和22%。在經(jīng)過愈傷組織、器官分化途徑所獲得的再生植株中，倍

45、性變化更為常見。如在水稻的花藥培養(yǎng)中，再生植株的倍性變化為x5x。1. 再生植株的倍性再生植株的倍性 隨著培養(yǎng)基中植物激素濃度的增加也會降低從中再生植株的單倍體占有率。為什么有此倍性變化？為什么有此倍性變化？單倍體植株當(dāng)然來自花粉。二倍體或多倍體植株則較復(fù)雜，可能是花粉的自然加倍，可能來自花藥組織的體細(xì)胞及其變異。鑒定方法：觀察后代遺傳性狀是否分離；同工酶分析；分子標(biāo)記技術(shù)等。 花粉培養(yǎng)再生的植株倍性也有變化花粉培養(yǎng)再生的植株倍性也有變化，但由于操作上完全排除了體細(xì)胞的干擾，形成二倍體或多倍體均來自花粉的自然加倍。所以，可直接用于育種實際。2. 單倍體植株的保存和加倍 單倍體植株不能正常結(jié)實，

46、為了保持所獲得的單倍體材料，常用的方法是將無菌苗的莖尖培養(yǎng)在無激素或低濃度激素的培養(yǎng)基上并定期轉(zhuǎn)移。然而，單倍體非最終育種目標(biāo)，需要染色體加倍。方法有：A.單倍體植株組織培養(yǎng)再生 切取單倍體植株的莖、葉等組織進(jìn)行培養(yǎng)，可獲加倍植株。B.人工處理誘導(dǎo)加倍 常用秋水仙素處理，洗靜后轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)基中誘導(dǎo)植株再生。具體方法有培養(yǎng)細(xì)胞的處理；試管小苗的處理；頂芽、腋芽處理；花軸處理等。4 組織和器官培養(yǎng) 組織和器官培養(yǎng)是植物離體培養(yǎng)中研究最早和比較廣泛的。1904年就有十字花科的蘿卜、辣根的胚培養(yǎng)苗問世。莖尖培養(yǎng)近年發(fā)展快，觀賞植物如蘭花、非洲菊和經(jīng)濟作物如甘蔗采用組織培養(yǎng)進(jìn)行生產(chǎn)性的大量繁殖。果樹上利

47、用莖尖和腋芽培養(yǎng)進(jìn)行砧木的快速繁殖，如蘋果矮化砧的1莖尖，8月可繁殖60000株。石刁柏、花椰菜、木立花椰菜等快繁，比傳統(tǒng)方法大大提高繁殖系數(shù)。 自交不親和系也可通過組織培養(yǎng)方式大量繁殖，可免蕾期授粉之人工和防止自交衰退。 無性繁殖作物的“無病苗”生產(chǎn)，據(jù)此取得重大進(jìn)展。馬鈴薯、芋、大蒜、姜、柑橘等莖尖脫毒。 組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行種質(zhì)資源的保存可節(jié)省空間，方法簡便，繁殖潛力大，避免田間種植的天然雜交，結(jié)合低溫和超低溫的冷凍貯藏，對于保存遺傳資源和運輸、交換都很方便。組織培養(yǎng)技術(shù)的主要階段組織培養(yǎng)技術(shù)的主要階段 組織和器官培養(yǎng)技術(shù)包括實驗室設(shè)計、建造和設(shè)備；培養(yǎng)基的配制；表面滅菌和接種；試管苗出瓶移

48、栽及后期管理。整個過程分三個階段：1.無菌培養(yǎng)的建立無菌培養(yǎng)的建立 主要考慮選擇外植體、培養(yǎng)基和環(huán)境條件的性質(zhì)。2.培養(yǎng)再生植株養(yǎng)再生植株 利用誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織和利用莖尖培養(yǎng)誘生不定新梢等途徑。3.準(zhǔn)備將再生植株移栽入土準(zhǔn)備將再生植株移栽入土 包括新梢插條的生根、植株的鍛煉和使植株由異樣狀態(tài)變?yōu)樽责B(yǎng)狀態(tài)。是指植物某一器官的全部或部分或器官原基的培養(yǎng)，包括莖是指植物某一器官的全部或部分或器官原基的培養(yǎng)，包括莖段、莖尖、球莖、葉片、子葉、花序、花瓣、子房、花藥、段、莖尖、球莖、葉片、子葉、花序、花瓣、子房、花藥、花托、果實、種子等?；ㄍ?、果實、種子等。此處指形成層組織、分生組織、表皮組織、薄壁組織

49、和各種此處指形成層組織、分生組織、表皮組織、薄壁組織和各種器官器官 組織以及愈傷組織的培養(yǎng)。組織以及愈傷組織的培養(yǎng)。器官培養(yǎng)（器官培養(yǎng)（Organ culture ）組織培養(yǎng)（組織培養(yǎng)（Tissue culture）莖尖培養(yǎng)莖尖培養(yǎng)1、類型、類型q小莖尖：小莖尖：q大莖尖：大莖尖：材料體積小，不帶葉原基的培養(yǎng)難，成苗所需時間長，體材料體積小，不帶葉原基的培養(yǎng)難，成苗所需時間長，體積大的則易于成功。積大的則易于成功。2、作用、作用無性系快速繁殖；無性系快速繁殖；培養(yǎng)無病毒苗，品種改良；培養(yǎng)無病毒苗，品種改良；理論基礎(chǔ)研究理論基礎(chǔ)研究10-100 m的莖尖分生組織（脫毒）的莖尖分生組織（脫毒）幾十

50、幾十mm莖尖或更大的芽（快繁）莖尖或更大的芽（快繁）3、建立無菌材料及培養(yǎng)、建立無菌材料及培養(yǎng)健康植株上選健壯的枝梢健康植株上選健壯的枝梢去葉片用自來水沖洗去葉片用自來水沖洗 再生再生培養(yǎng)培養(yǎng)MS培養(yǎng)基培養(yǎng)基75%酒精酒精1分鐘分鐘次氯酸鈉次氯酸鈉5-10分鐘分鐘0.1%升汞升汞4、莖尖培養(yǎng)的發(fā)育方向、莖尖培養(yǎng)的發(fā)育方向v腋芽萌發(fā)腋芽萌發(fā)v脫分化后產(chǎn)生胚狀體脫分化后產(chǎn)生胚狀體v脫分化后直接產(chǎn)生不定器官脫分化后直接產(chǎn)生不定器官v脫分化后形成愈傷組織脫分化后形成愈傷組織離體繁殖離體繁殖建立懸浮系或分化建立懸浮系或分化胚狀體及不定芽胚狀體及不定芽影響發(fā)育方向的因素影響發(fā)育方向的因素q 外植體大小外植

51、體大小q 培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件q 培養(yǎng)基生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度培養(yǎng)基生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度微形外植體或分生組織易產(chǎn)生愈傷組織微形外植體或分生組織易產(chǎn)生愈傷組織細(xì)胞分裂素和生長素的配比是關(guān)鍵細(xì)胞分裂素和生長素的配比是關(guān)鍵技術(shù)上的問題技術(shù)上的問題 愈傷組織往往經(jīng)過多次繼代以后，其分化器官的能愈傷組織往往經(jīng)過多次繼代以后，其分化器官的能力日衰力日衰,甚至喪失；甚至喪失； 如何使愈傷組織分化的植株保持遺傳性的穩(wěn)定性。如何使愈傷組織分化的植株保持遺傳性的穩(wěn)定性。 污染、褐變與玻璃化污染、褐變與玻璃化真菌污染長孢子真菌污染長孢子真菌污染長孢子真菌污染長孢子污染的情況污染的情況細(xì)菌污染長菌落細(xì)菌污染長菌落細(xì)菌污染長

52、菌落細(xì)菌污染長菌落初代培養(yǎng)外植體的褐變初代培養(yǎng)外植體的褐變 外植體褐變是指在接種后，其表面開始褐變，有時甚外植體褐變是指在接種后，其表面開始褐變，有時甚至?xí)拐麄€培養(yǎng)基褐變的現(xiàn)象。它的出現(xiàn)是由于植物組至?xí)拐麄€培養(yǎng)基褐變的現(xiàn)象。它的出現(xiàn)是由于植物組織中的多酚氧化酶被激活，而使細(xì)胞的代謝發(fā)生變化所織中的多酚氧化酶被激活，而使細(xì)胞的代謝發(fā)生變化所致。在褐變過程中，會產(chǎn)生醌類物質(zhì)，它們多呈棕褐色，致。在褐變過程中，會產(chǎn)生醌類物質(zhì)，它們多呈棕褐色，當(dāng)擴散到培養(yǎng)基后，就會抑制其他酶的活性，從而影響當(dāng)擴散到培養(yǎng)基后，就會抑制其他酶的活性，從而影響所接種外植體的培養(yǎng)。所接種外植體的培養(yǎng)。褐褐 化化褐變的主要

53、原因褐變的主要原因植物品種植物品種 在不同品種間的褐變現(xiàn)象不同。多酚氧化酶活性上的差異。在不同品種間的褐變現(xiàn)象不同。多酚氧化酶活性上的差異。因此，在培養(yǎng)過程中應(yīng)該有所選擇，對不同的品種分別進(jìn)行處理。因此，在培養(yǎng)過程中應(yīng)該有所選擇，對不同的品種分別進(jìn)行處理。生理狀態(tài)生理狀態(tài) 由于外植體的生理狀態(tài)不同，所以在接種后褐變程度也有所由于外植體的生理狀態(tài)不同，所以在接種后褐變程度也有所不同。一般幼齡期的植物材料褐變程度較淺，成年的植株采收的外植體，不同。一般幼齡期的植物材料褐變程度較淺，成年的植株采收的外植體，由于含醌類物質(zhì)較多，因此褐變較為嚴(yán)重。幼嫩的組織在接種后褐變程由于含醌類物質(zhì)較多，因此褐變較為

54、嚴(yán)重。幼嫩的組織在接種后褐變程度并不明顯，老熟的組織較為嚴(yán)重。度并不明顯，老熟的組織較為嚴(yán)重。培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基成分 濃度過高的無機鹽會使某些觀賞植物的褐變程度增加，濃度過高的無機鹽會使某些觀賞植物的褐變程度增加，此外，細(xì)胞分裂素的水平過高也會刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，此外，細(xì)胞分裂素的水平過高也會刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變現(xiàn)象加深。從而使褐變現(xiàn)象加深。培養(yǎng)條件不當(dāng)培養(yǎng)條件不當(dāng) 如果光照過強、溫度過高、培養(yǎng)時間過長等，均可使如果光照過強、溫度過高、培養(yǎng)時間過長等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的外植體的褐變程度。多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的外植體的

55、褐變程度。減輕褐變現(xiàn)象發(fā)生的方法減輕褐變現(xiàn)象發(fā)生的方法選擇合適的外植體選擇合適的外植體 一般來說，最好選擇生長處于旺盛的一般來說，最好選擇生長處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。合適的培養(yǎng)條件合適的培養(yǎng)條件 無機鹽成分、植物生長物質(zhì)水平、適宜無機鹽成分、植物生長物質(zhì)水平、適宜溫度、及時繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。溫度、及時繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。使用抗氧化劑使用抗氧化劑 在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸、在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸、PVPPVP等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕

56、很多外植體的褐變現(xiàn)象。另外，使用褐變現(xiàn)象。另外，使用0.1%-0.5%0.1%-0.5%的活性炭對防止褐變也的活性炭對防止褐變也有較為明顯的效果。有較為明顯的效果。連續(xù)轉(zhuǎn)移連續(xù)轉(zhuǎn)移 對容易褐變的材料可間隔對容易褐變的材料可間隔1224h1224h的培養(yǎng)后，再的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理7-l0d7-l0d后，褐變后，褐變現(xiàn)象便會得到控制或大為減輕?，F(xiàn)象便會得到控制或大為減輕。 繼代培養(yǎng)時材料的玻璃化繼代培養(yǎng)時材料的玻璃化實踐表明，當(dāng)植物材料不斷地進(jìn)行離體繁殖時，有些培養(yǎng)實踐表明，當(dāng)植物材料不斷地進(jìn)行離體繁殖時，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會

57、呈半透明水漬狀，這種現(xiàn)象通常稱物的嫩莖、葉片往往會呈半透明水漬狀，這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化。它的出現(xiàn)會使試管苗生長緩慢、繁殖系數(shù)有所為玻璃化。它的出現(xiàn)會使試管苗生長緩慢、繁殖系數(shù)有所下降。玻璃化為試管苗的生理失調(diào)癥。下降。玻璃化為試管苗的生理失調(diào)癥。因為出現(xiàn)玻璃化的嫩莖不宜誘導(dǎo)生根，因此，使繁殖系數(shù)因為出現(xiàn)玻璃化的嫩莖不宜誘導(dǎo)生根，因此，使繁殖系數(shù)大為降低。在不同的種類、品種間，試管苗的玻璃化程度大為降低。在不同的種類、品種間，試管苗的玻璃化程度也有所差異。當(dāng)培養(yǎng)基上細(xì)胞分裂素水平較高時，也容易也有所差異。當(dāng)培養(yǎng)基上細(xì)胞分裂素水平較高時，也容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。在培養(yǎng)基中添加少量聚乙烯醇、脫落酸出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。在培養(yǎng)基中添加少量聚乙烯醇、脫落酸等物質(zhì)，能夠在一定程度上減輕玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生等物質(zhì)，能夠在一定程度上減輕玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生. . 呈現(xiàn)呈現(xiàn)玻璃化玻璃化的試管苗，其莖、葉表面無蠟質(zhì)，體內(nèi)的極性的試管苗，其莖、葉表面無蠟質(zhì)，體內(nèi)的極性化合物水