實(shí)驗(yàn)室做細(xì)胞常用染色

1、WORD格式實(shí)驗(yàn)室做細(xì)胞常用的細(xì)胞固定與染色方法一、爬片前蓋玻片處理方法對(duì)于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，在進(jìn)展各種染色前常需先制備成涂片。為了保證細(xì)胞在長(zhǎng)時(shí)間的染色過(guò)程中不從載玻片脫落，必須使其結(jié)實(shí)貼附于載玻片上。在載玻片上涂布一層有助于細(xì)胞黏附的物質(zhì)是經(jīng)常采用的方法之一。能促進(jìn)細(xì)胞黏附的物質(zhì)主要有多聚賴氨酸、鉻礬明膠等，這里介紹多聚賴氨酸的涂布方法。1、將載玻片用玻璃專用洗滌劑(如 Decon)浸泡 5min，間或振蕩。2、用自來(lái)水沖洗 5min。3、以 1鹽酸70乙醇溶液浸泡5min。4、烤箱枯燥 (至此即可用于普通染色 )。5、多聚 L- 賴氨酸 (1:10 溶于去離子水 )浸泡 5min，振蕩。6

2、、入 60烤箱 1 h，或室溫過(guò)夜枯燥 (用于細(xì)胞化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)及原位雜交細(xì)胞化學(xué) )。二、細(xì)胞固定常用方法固定細(xì)胞的目的在于把組織和細(xì)胞的原有構(gòu)造盡可能完整地保存下來(lái)，避免組織和細(xì)胞發(fā)生降解、自溶、腐敗和變形等，使細(xì)胞和組織內(nèi)的各種酶失去活性，防止細(xì)胞和組織的各種分子變性、解離，使細(xì)胞的化學(xué)物質(zhì)和酶能準(zhǔn)確定位，并在以后的處理和制片過(guò)程中亦不發(fā)生改變和破壞。同時(shí)，固定還可使細(xì)胞的各局部易于著色，適于觀察、長(zhǎng)期保存和分析。1.固定組織、細(xì)胞的根本原那么：盡可能選用新鮮培養(yǎng)物；根據(jù)檢測(cè)工具、專業(yè)資料整理WORD格式對(duì)象、目的和要求選擇固定劑和固定方法。專業(yè)資料整理WORD格式2.培養(yǎng)物的準(zhǔn)備和

3、固定前處理：各種細(xì)胞培養(yǎng)物，如雙蓋片懸滴培養(yǎng)物、懸液培養(yǎng)物、單層培養(yǎng)物和蓋片單層培養(yǎng)物都可作固定材料。對(duì)雙蓋片懸滴培養(yǎng)物和懸液培養(yǎng)物來(lái)說(shuō)，常通過(guò)離心收集細(xì)胞，PBS漂洗 23 次后，備固定制片；對(duì)蓋片單層培養(yǎng)物來(lái)說(shuō)，將蓋片從培養(yǎng)器皿中取出后，PBS 液漂洗 23次，以洗去血清和附著于細(xì)胞外表的殘?jiān)?，備固定用?.常用固定液：常用的固定液分兩類，一類是以單一化學(xué)物質(zhì)配成的固定液，稱簡(jiǎn)單固定液。主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀、氯化汞、氯化鎘、四氧化鋨(鋨酸 )。另一類是用兩種或兩種以上化學(xué)物質(zhì)配合成的固定液，稱混合固定液。如Mueller 固定液、Flemmin

4、g 固液、 FAA 固定液、 Carnoy 固定液、 Rossman固定液、 Altmann 固定液、 Bouing 固定液等。不同的固定液對(duì)細(xì)胞的化學(xué)成分、酶類及細(xì)胞構(gòu)造固定效果不同。因此，選擇適宜的固定液是到達(dá)固定目的的根底。(1)4甲醛 -PBS:甲醛是一種氣體，其飽和水溶液無(wú)色，約含40甲醛。在很多情況下，甲醛常常產(chǎn)生多聚甲醛的白色沉淀。4甲醛 -PBS 使組織變硬速度比乙醇快，并能較好地保存組織的外部形式，固定效果不受制片影響，固定材料可用蘇木精和其他合成染料染色。甲醛的穿透力較強(qiáng)，對(duì)組織固定均勻，能增強(qiáng)組織的彈性，大標(biāo)本的固定和保存多用甲醛。甲醛是染色體、線粒體和高爾基體的固定液，

5、在冷凍切片中，甲醛作固定劑具有顯著的優(yōu)點(diǎn)。用40甲醛水溶液 :PBS=1:9配方制備甲醛固定液。(2)丙酮：丙酮為無(wú)色易揮發(fā)液體，用純冷丙酮(4 )固定細(xì)胞內(nèi)酶效果較專業(yè)資料整理WORD格式佳。專業(yè)資料整理WORD格式(3)乙醇：乙醇又稱酒精，固定血纖維蛋白、色素、彈性纖維、細(xì)菌和白細(xì)胞等效果優(yōu)良。無(wú)水乙醇或乙醇和醋酸的混合液是固定肝糖原及肌糖原的良好固定液。乙醇除有固定作用外，還具有硬化和脫水的作用。作為固定用乙醇的適宜濃度為 70 100。乙醇的缺點(diǎn)是滲透力差，并使組織收縮。(4)醋酸：常用 0.3 5濃度的醋酸作固定劑。醋酸能和水及乙醇、甲醇溶合，醋酸不固定蛋白質(zhì)，但能固定核酸。醋酸的穿

6、透力很大，它對(duì)細(xì)胞的膨脹作用顯著，這是由于它破壞了某些蛋白質(zhì)分子的結(jié)合，所以，常用醋酸來(lái)減少其他固定劑引起的細(xì)胞收縮。細(xì)胞學(xué)技術(shù)中，它能防止細(xì)胞收縮，并能較好地保存染色體，還能把染色質(zhì)沉淀成為可染色的塊狀體。(5)苦味酸：苦味酸是黃色結(jié)晶體，強(qiáng)酸，可溶于水、乙醇、苯和二甲苯，在水中的溶解度可因水溫變化而變化。苦味酸可以沉淀白蛋白、核蛋白、球蛋白、組蛋白和核酸。苦味酸的穿透力很慢，單獨(dú)使用時(shí)，造成組織嚴(yán)重收縮。它和其他藥物混合配制時(shí)，可以作為蛋白質(zhì)的沉淀劑，同時(shí)可防止組織收縮、硬化，而且易于染色。所以在很多混合固定液中被廣泛采用。作固定用的最適濃度為 1。(6)鋨酸 (四氧化鋨 )：鋨酸是一種強(qiáng)

7、氧化劑，不能同乙醇和甲醛混合使用。它的揮發(fā)性很強(qiáng)，揮發(fā)出來(lái)的氣體能固定結(jié)膜，對(duì)眼睛很有害，所以操作時(shí)應(yīng)特別注意。四氧化鋨是保存細(xì)胞構(gòu)造的最好固定劑之一，配制時(shí)先在棕色試劑瓶中盛入 50100ml 0.1mol/L 磷酸緩沖液 (pH7.0 7.4)，再將裝有 1g 鋨酸的安培瓶放人 PBS 中，以玻棒擊碎安培瓶，搖蕩使鋨酸溶解，備用。常用的固定液專業(yè)資料整理WORD格式濃度為 1 2。專業(yè)資料整理WORD格式(7)戊二醛：戊二醛對(duì)組織的滲透率高，與蛋白質(zhì)反響快，能較好地保存蛋白質(zhì)，對(duì)微管和膜性構(gòu)造保存亦比較好，并能較好地保存糖原。常用的戊二醛固定液配制方法列于表12-1。表 12-1 常用的戊

8、二醛固定液配制方法Ph7.2 的 0.1mol/L磷酸緩沖液 ml969692908825%戊二醛水溶液 ml 4681012戊二醛的終濃度1%1.5%2%2.5%3%(8)甲醇醋酸固定液：甲醇：醋酸為3:1 的固定液是應(yīng)用最廣的一種培養(yǎng)細(xì)胞固定劑。甲醇穿透力好，醋酸固定蛋白效果好，兩者結(jié)合，能使固定細(xì)胞形態(tài)不變。不僅最適用于固定染色體，而且固定的染色體適于Giemsa染色 (注意：此固定液宜現(xiàn)用現(xiàn)配)。(9)FAA 固定液：此固定液適用于固定蓋片單層培養(yǎng)的細(xì)胞，固定效果好。配制方法： 90ml 80酒精中加 5ml 冰乙酸和 5m140甲醛。(10)Carnoy 固定液： Carnoy 固定

9、液是較好的非水溶性固定液，是顯示細(xì)胞化學(xué)成分 (如粘多糖等 )時(shí)常用的固定劑，固定、保真效果好，但穿透力差，適于固定培養(yǎng)的單層細(xì)胞。配制方法：60ml 純酒精加 30ml 氯仿和 10ml 冰乙酸。(11)Bouin 固定液：用于固定雙蓋片法培養(yǎng)的標(biāo)本，固定30 分鐘后，用 70酒精褪去苦味酸黃色，如不立即染色，可將標(biāo)本保存在70酒精中。本試劑適于固定組織細(xì)胞的糖原。配制方法：先將75ml 飽和苦味酸 (100ml 水中加 1.2 1.4g)過(guò)濾，參加 25ml 福爾馬林 (40甲醛，有沉淀時(shí)禁用 )，最后參加 5ml 冰專業(yè)資料整理WORD格式醋酸，混和后存于4冰箱中備用。冰醋酸最好在臨用前

10、參加。該固定液對(duì)組專業(yè)資料整理WORD格式織細(xì)胞穿透力較強(qiáng)，固定效果較好，保存的細(xì)胞構(gòu)造完好。但因偏酸(pH 為 33.5)，對(duì)抗原有一定損害。(12)4多聚甲醛 -PBS 固定液：多聚甲醛為白色固體，在50ml 蒸餾水中加入 4g 多聚甲醛，加熱至 6070時(shí)，邊攪拌邊逐滴參加 2mol/LNaOH ，至液體清晰透明。用 1mol/LHCl 調(diào)節(jié) pH 至 7.4，冷卻后參加 0.01mol/LPBS 液至100ml，4保存。本試劑適于固定腎纖維蛋白和細(xì)胞骨架蛋白。三、常見(jiàn)的細(xì)胞染色方法1 普通染色觀察蘇木精 -伊紅 (hematoxylin-eosin，HE) 染色和 Giemsa染色是觀

11、察培養(yǎng)細(xì)胞一般形態(tài)的最常用方法，也是把細(xì)胞作為標(biāo)本保存的主要方法。對(duì)于貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，以生長(zhǎng)于蓋玻片和塑料培養(yǎng)瓶壁者便于操作。固定前先用Hanks 液、PBS、BSS 或生理鹽水清洗培養(yǎng)物2 次，去除阻礙染色的血清。固定后可將蓋玻片用樹(shù)膠貼于載玻片上，以利操作。對(duì)于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，須先經(jīng)離心沉淀(1000rmin，10min)，棄上清液后 (留少量液體 )，將細(xì)胞懸液滴于玻片上做成涂片，冷風(fēng)吹干。1.1HE 染色法1.1.1 染液配制(1)蘇木精染液：這里介紹鄂征(1995)改良的 Mayer 法。稱取 0.5g 蘇木精，5.0g專業(yè)資料整理WORD格式銨礬或鉀礬， 0.1g 碘酸鈉加溫溶于70

12、m1 蒸餾水。再參加30ml 甘油， 2ml冰醋酸。混勻。過(guò)濾后即成母液?？砷L(zhǎng)久保存。用蒸餾水以1:20 稀釋即成工作液，可用很長(zhǎng)時(shí)間。每次染色前宜過(guò)濾，去除氧化膜。(2)伊紅染液：伊紅有醇溶性與水溶性之分。將0.5g 伊紅溶于 100m170乙醇或蒸餾水即成工作液。1.1.2 染色程序1用 10甲醛 (福爾馬林 )固定培養(yǎng)物 30min，或以丙酮固定15min。2蒸餾水洗 1 次后，入蘇木精染液5 10min 染細(xì)胞核。3入 0.5鹽酸 -70乙醇溶液 30 1min，脫去胞質(zhì)的著色。此時(shí)核呈紫紅色。4入堿性溶液堿化，使細(xì)胞核變成藍(lán)色。如果時(shí)間允許，最好用自來(lái)水(呈弱堿性 )長(zhǎng)時(shí)間浸泡。也可

13、入1NaHCO3 溶液。此過(guò)程須不斷用顯微鏡監(jiān)視，以掌握堿化時(shí)間。5蒸餾水洗 1 min，去除殘留的堿性溶液，否那么影響伊紅著色。6入伊紅染液 30s1 min。7用梯度乙醇溶液脫水：70、 90、 95乙醇各 30s1 min； 100(2 次)各 2min。如伊紅為乙醇溶液，略去70乙醇。專業(yè)資料整理WORD格式8用二甲苯透明 2 次，各 5min。專業(yè)資料整理WORD格式9樹(shù)膠封固。1.1.3 染色結(jié)果細(xì)胞核呈紫藍(lán)色或深藍(lán)色，大局部細(xì)胞的胞質(zhì)呈粉紅色。如果胞質(zhì)內(nèi)含較多核糖體(例如淋巴細(xì)胞 )那么亦呈藍(lán)色。1.2 吉姆薩染色法此法可將細(xì)胞核與胞質(zhì)同時(shí)染色，故便捷快速；但染液配制技術(shù)不易準(zhǔn)確掌握，效果常不如 HE 染色穩(wěn)定。1.2.1 吉姆薩 (Giemsa)染液的配制1取 1.5g 吉姆薩粉末放入50m