NorthernBlot原理及實(shí)驗(yàn)方法

1、Northern Blot原理及實(shí)驗(yàn)方法原理：在變性條件下將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，繼而將在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。用途：檢測樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量。 實(shí)驗(yàn)方法：儀器、試劑、材料（一）儀器恒溫水浴箱，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)，真空轉(zhuǎn)移儀，真空泵，UV交聯(lián)儀，雜交爐，恒溫?fù)u床，脫色搖床，漩渦振蕩器，分光光度計，微量移液器，電爐（或微波爐），離心管，燒杯，量筒，三角瓶等。（二）材料總RNA樣品或mRNA樣品，探針模板DNA(25 ng)，尼龍膜（三）試劑：NorthernMax Kit（Ca

2、t. # 1940，Ambion, Inc.），瓊脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer， dNTP Mixture，111 TBq/mmola-32PdCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，雙氧水,滅菌水等。方法與步驟1.用具的準(zhǔn)備：180度烤器皿：三角錐瓶、量筒、鑷子、刀片等4小時。電泳槽：清洗梳子和電泳槽，并用雙氧水浸泡過夜，用DEPC水沖洗，干燥備用。處理DEPC水(2 L)備用。2用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RNAZap擦洗梳子，電泳槽，刀片等，然后用DEPC

3、水沖洗二次，去除RNAZap。3制膠： 1 稱取0.36mg瓊脂糖加入三角錐瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波爐加熱至瓊脂糖完全熔解。60空氣浴平衡溶液 (需加DEPC水補(bǔ)充蒸發(fā)的水分) 2 在通風(fēng)廚中加入3.6ml的10Denaturing Gel buffer，輕輕振蕩混勻。注意盡量避免產(chǎn)生氣泡。3 將熔膠倒入制膠板中，插上梳子如果膠溶液上存在氣泡，可以用熱的玻璃棒或其它方法去除，或?qū)馀萃频侥z的邊緣。注：膠的厚度不能超過0.5cm。4膠在室溫下完全凝固后，將膠轉(zhuǎn)移到電泳槽中，加入1x MOPS Gel Running buffer蓋過膠面約1cm，小心拔出梳子。（配制250ml1&

4、#215;MOPS Gel Running buffer，在電泳過程中補(bǔ)充蒸發(fā)的buffer。）5檢查點(diǎn)樣孔。4. RNA樣品的制備在RNA樣品中加入3倍體積的formaldehyde load dye和適當(dāng)?shù)腅B（終濃度為10ug/ml）?；靹蚝?，65空氣浴15min。短暫低速離心后，立即放置于冰上5min。5.電泳：1.將RNA樣品小心加到點(diǎn)樣孔中。2.在5V/cm下跑膠（514cm）。在電泳過程中，每隔30min短暫停止電泳，取出膠，混勻兩極的電泳液后繼續(xù)電泳。當(dāng)膠中的溴紛藍(lán)（500bp）接近膠的邊緣時終止電泳。3.紫外燈下，檢驗(yàn)電泳情況，并用尺子測量18S、28S、溴紛藍(lán)到點(diǎn)樣孔的距離

5、。注意不要讓膠在紫外燈下曝光太長時間。6.轉(zhuǎn)膜1用3%雙氧水浸泡真空轉(zhuǎn)移儀后，用DEPC水沖洗。2用RNAZap擦洗多孔滲水屏和塑膠屏，用DEPC水沖洗二次。3連接真空泵和真空轉(zhuǎn)移儀，剪取一塊適當(dāng)大小的膜（膜的四邊緣應(yīng)大于塑膠屏孔口的5mm），膜在Transfer buffer浸濕5分鐘后，放置在多孔滲水屏的適當(dāng)位置。4蓋上塑膠屏，蓋上外框，扣上鎖。5將膠的多余部分切除，切后的膠四邊緣要能蓋過塑膠屏孔，并至少蓋過邊緣約2mm，以防止漏氣。6將膠小心放置在膜的上面，膜與膠之間不能有氣泡。7打開真空泵，使壓強(qiáng)維持在5058mbar；立即將transfer buffer加到膠面和四周。每隔10min

6、在膠面加上1ml transfer buffer，真空轉(zhuǎn)移2小時。8轉(zhuǎn)膜后，用鑷子夾住膜，于1x MOPS Gel Running buffer中輕輕泡洗10秒，去除殘余的膠和鹽。9用吸水紙吸取膜上多余的液體后，將膜置于UV交聯(lián)儀中自動交聯(lián)。10將膠和紫外交聯(lián)后的膜，在紫外燈下檢測轉(zhuǎn)移效率。(避免太長的紫外曝光時間)12將膜在-20保存。7.探針的制備1在1.5ml離心管中配制以下反應(yīng)液：模板DNA(25 ng)1ulRandom Primer 2ul滅菌水 11ul總體積：14ul295°C加熱3分鐘后，迅速放置于冰冷卻5min。3在離心管中按下列順序加入以下溶液：10×

7、Buffer 2.5uldNTP Mixture 2.5ul111 TBq/mmola-32PdCTP 5 ulExo-free Klenow Fragment 1 ul4混勻后（25ul），37°C下反應(yīng)30分鐘。短暫離心，收集溶液到管底。565°C加熱5min使酶失活。8.探針的純化及比活性測定：1準(zhǔn)備凝膠：將1g凝膠加入30ml的DEPC水中，浸泡過夜。用DEPC水洗滌膨脹的凝膠數(shù)次，以除去可溶解的葡聚糖。2取1ml一次性注射器，去除內(nèi)芯推捍，將注射器底部用硅化的玻璃纖維塞住，在注射器中裝填Sephadex G-50凝膠。3將注射器放入一支15ml離心管中，注射器把手

8、架在離心管口上。1600g離心4分鐘，凝膠壓緊后，補(bǔ)加Sephadex G-50凝膠懸液，重復(fù)此步直至凝膠柱高度達(dá)注射器0.9ml刻度處4100ul STE緩沖液洗柱，1600g離心4min。重復(fù)3次。5倒掉離心管中的溶液后，將一去蓋的1.5ml離心管置于管中，再將裝填了Sephadex G-50凝膠的注射器插入離心管中，注射器口對準(zhǔn)1.5ml離心管。6將標(biāo)記的DNA樣品加入25 ul STE，取出0.5ul點(diǎn)樣于DE8paper上，其余上樣于層析柱上。71600g離心4min，DNA將流出被收集在去蓋的離心管中，而未摻入DNA的dNTP則保留在層析柱中。取0.5ul己純化的探針點(diǎn)樣于DE8-

9、paper. 8 測比活性。9預(yù)雜交：1將預(yù)雜交液在雜交爐中68預(yù)熱，并漩渦使未溶解的物質(zhì)溶解。2加入適當(dāng)?shù)腢LRAhyb到雜交管中(以100cm2膜面積加入10mlULRAhyb雜交液)，42預(yù)雜交4 hr。10探針變性：1用10 mM EDTA將探針稀釋10倍。290熱處理稀釋后探針10min后，立即放置于冰上5min。3短暫離心，將溶液收集到管底。11雜交：1加入0.5ml ULTRAhyb到變性的探針中，混勻后，將探針加到預(yù)雜交液中。242雜交過夜（1424hr）。雜交完后，將雜交液收集起來于20保存。12洗膜： 1低嚴(yán)緊性洗膜：加入Low Stringency Wash Solution#1 (100cm2膜面積加入20ml洗膜溶液)，室溫下，搖動洗膜5min兩次。 2高嚴(yán)緊性洗膜： 加入High Stringency Wash Solution#2 (100cm2膜面積加入20ml洗膜溶液)，42 搖動洗膜20min兩次。 13曝光：1 將膜從洗膜液中取出，用保鮮膜包住，以防止膜干燥。2 檢查膜上放射性強(qiáng)度，估計曝光時間3 將X光底片覆蓋與膜上，曝光4 沖洗X光底片，掃描記錄結(jié)果。14去除膜上的探針：將200ml0.1%SDS（由DEPC水配制）煮沸后，將膜放入，室溫下讓SDS