發(fā)酵產(chǎn)物的提取與精制

1、第七章產(chǎn)物的提取與精制概論概論v下游加工過(guò)程在發(fā)酵工程中的地位下游加工過(guò)程在發(fā)酵工程中的地位v下游加工過(guò)程的定義下游加工過(guò)程的定義 發(fā)酵產(chǎn)品系通過(guò)微生物發(fā)酵過(guò)程、酶反應(yīng)過(guò)發(fā)酵產(chǎn)品系通過(guò)微生物發(fā)酵過(guò)程、酶反應(yīng)過(guò)程或動(dòng)植物細(xì)胞大量培養(yǎng)獲得。從上述發(fā)酵液、程或動(dòng)植物細(xì)胞大量培養(yǎng)獲得。從上述發(fā)酵液、反應(yīng)液或培養(yǎng)液中分離、精制有關(guān)產(chǎn)品的過(guò)程反應(yīng)液或培養(yǎng)液中分離、精制有關(guān)產(chǎn)品的過(guò)程稱(chēng)為下游加工過(guò)程稱(chēng)為下游加工過(guò)程(Down stream processing)。它由一些化學(xué)工程的單幾操作。它由一些化學(xué)工程的單幾操作組成，但由于生物物質(zhì)的特性，有其特殊要求，組成，但由于生物物質(zhì)的特性，有其特殊要求，而且其中

2、某些單元操作一般化學(xué)工業(yè)中應(yīng)用較而且其中某些單元操作一般化學(xué)工業(yè)中應(yīng)用較少。少。v地位地位傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)(如抗生素、乙醇、檸如抗生素、乙醇、檸檬酸檬酸)，分離和精制部份占整個(gè)工廠，分離和精制部份占整個(gè)工廠投資費(fèi)用的投資費(fèi)用的60%。對(duì)重組對(duì)重組DNA發(fā)酵、精制蛋白質(zhì)的費(fèi)發(fā)酵、精制蛋白質(zhì)的費(fèi)用可占整個(gè)生產(chǎn)費(fèi)用的用可占整個(gè)生產(chǎn)費(fèi)用的80%90%。v下游加工過(guò)程的特點(diǎn)下游加工過(guò)程的特點(diǎn)v1、成分復(fù)雜：細(xì)胞、代謝產(chǎn)物、殘余培養(yǎng)基、成分復(fù)雜：細(xì)胞、代謝產(chǎn)物、殘余培養(yǎng)基v2、產(chǎn)品濃度低：傳統(tǒng)發(fā)酵一般、產(chǎn)品濃度低：傳統(tǒng)發(fā)酵一般110v3、失活問(wèn)題、失活問(wèn)題v4、不穩(wěn)定性、不穩(wěn)定性v5、純度和生物安

3、全問(wèn)題、純度和生物安全問(wèn)題v6、收率低：、收率低：50左右左右發(fā)酵工業(yè)下游技術(shù)的一般工藝過(guò)程發(fā)酵工業(yè)下游技術(shù)的一般工藝過(guò)程v下游加工過(guò)程由各種化工單元操作組成。下游加工過(guò)程由各種化工單元操作組成。由于生物產(chǎn)品品種多，性質(zhì)各異，故用到由于生物產(chǎn)品品種多，性質(zhì)各異，故用到的單元操作很多，其中如蒸餾、萃取、結(jié)的單元操作很多，其中如蒸餾、萃取、結(jié)晶、吸附、蒸發(fā)和干燥等屬傳統(tǒng)的單元操晶、吸附、蒸發(fā)和干燥等屬傳統(tǒng)的單元操作，理論比較成熟，而另一些則為新近發(fā)作，理論比較成熟，而另一些則為新近發(fā)展起來(lái)的單元操作，如細(xì)胞破碎、膜過(guò)程展起來(lái)的單元操作，如細(xì)胞破碎、膜過(guò)程和色層分離等，缺乏完整的理論，介于兩和色層分

4、離等，缺乏完整的理論，介于兩者之間的有離子交換過(guò)程等。者之間的有離子交換過(guò)程等。一般工藝過(guò)程一般工藝過(guò)程v一般說(shuō)來(lái)，下游加工過(guò)程可分為一般說(shuō)來(lái)，下游加工過(guò)程可分為4個(gè)個(gè)階段：培養(yǎng)液階段：培養(yǎng)液(發(fā)酵液發(fā)酵液)的預(yù)處理和固的預(yù)處理和固液分離；初步純化液分離；初步純化(提取提取)；高度純化；高度純化(精制精制)；成品加工。；成品加工。v工藝過(guò)程的劃分：工藝過(guò)程的劃分：預(yù)處理和固液分離預(yù)處理和固液分離 ：目的是除去發(fā)酵液中的菌體細(xì)胞目的是除去發(fā)酵液中的菌體細(xì)胞和不溶性固體雜質(zhì)。和不溶性固體雜質(zhì)。初步分離初步分離 ：目的是除去與產(chǎn)物性質(zhì)差異較大的雜質(zhì)，為：目的是除去與產(chǎn)物性質(zhì)差異較大的雜質(zhì)，為后道精制

5、工序創(chuàng)造有利條件后道精制工序創(chuàng)造有利條件 高度純化高度純化 ：去除與產(chǎn)物的物理化學(xué)性質(zhì)比較接近的雜質(zhì)。：去除與產(chǎn)物的物理化學(xué)性質(zhì)比較接近的雜質(zhì)。成品制作成品制作 ：成品形式由產(chǎn)品的最終用途決定。：成品形式由產(chǎn)品的最終用途決定。 v選擇下游加工工藝的原則選擇下游加工工藝的原則：是胞內(nèi)產(chǎn)物還是胞外產(chǎn)物是胞內(nèi)產(chǎn)物還是胞外產(chǎn)物 原料中產(chǎn)物和主要雜質(zhì)濃度原料中產(chǎn)物和主要雜質(zhì)濃度 產(chǎn)物和主要雜質(zhì)的物理化學(xué)特性及差異產(chǎn)物和主要雜質(zhì)的物理化學(xué)特性及差異 產(chǎn)品用途和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品用途和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 產(chǎn)品的市場(chǎng)價(jià)格產(chǎn)品的市場(chǎng)價(jià)格 廢液的處理方法等廢液的處理方法等 第一節(jié)第一節(jié) 發(fā)酵醪的預(yù)處理和菌體分離發(fā)酵醪的預(yù)處理和菌

6、體分離目目 的的v（1）改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，促進(jìn)懸浮液中分）改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，促進(jìn)懸浮液中分離固形物的速度，提高固液分離器的效率離固形物的速度，提高固液分離器的效率v（2）盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于后處理的某一相中）盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于后處理的某一相中（多數(shù)是液體）（多數(shù)是液體）v（3）去除發(fā)酵液中部分雜質(zhì)，以利于后續(xù)各步）去除發(fā)酵液中部分雜質(zhì)，以利于后續(xù)各步操作。操作。一、一、 發(fā)酵液的預(yù)處理發(fā)酵液的預(yù)處理v采用理化方法設(shè)法增大虛浮液中固體粒子采用理化方法設(shè)法增大虛浮液中固體粒子的大小、或降低粘度，以利于過(guò)濾。的大小、或降低粘度，以利于過(guò)濾。v去除會(huì)影響后續(xù)提取的高價(jià)無(wú)機(jī)離子。去除會(huì)影響后續(xù)

7、提取的高價(jià)無(wú)機(jī)離子。v發(fā)酵醪預(yù)處理的要求發(fā)酵醪預(yù)處理的要求:v（1）菌體的分離）菌體的分離v（2）固體懸浮物的去除）固體懸浮物的去除v（3）蛋白質(zhì)的去除）蛋白質(zhì)的去除v（4）重金屬離子的去除）重金屬離子的去除v（5）色素、熱原質(zhì)、毒性物質(zhì)等有機(jī)雜質(zhì)的去除）色素、熱原質(zhì)、毒性物質(zhì)等有機(jī)雜質(zhì)的去除v（6）改變發(fā)酵醪的性質(zhì)）改變發(fā)酵醪的性質(zhì)v（7）調(diào)節(jié)適宜）調(diào)節(jié)適宜pH值和溫度值和溫度預(yù)處理的方法預(yù)處理的方法1，凝聚和絮凝技術(shù)凝聚和絮凝技術(shù)2，雜蛋白質(zhì)的去除，雜蛋白質(zhì)的去除3 3，高價(jià)無(wú)機(jī)離子的去除方法高價(jià)無(wú)機(jī)離子的去除方法（一）凝聚和絮凝技術(shù)（一）凝聚和絮凝技術(shù)v凝聚和絮凝能有效改變細(xì)胞、菌體和蛋

8、白質(zhì)凝聚和絮凝能有效改變細(xì)胞、菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，破壞其穩(wěn)定性，使等膠體粒子的分散狀態(tài)，破壞其穩(wěn)定性，使它們聚集成可分離的絮凝體，再進(jìn)行分離。它們聚集成可分離的絮凝體，再進(jìn)行分離。v常用于細(xì)小菌體或細(xì)胞（分泌胞外產(chǎn)物）、常用于細(xì)小菌體或細(xì)胞（分泌胞外產(chǎn)物）、細(xì)胞的（分泌胞內(nèi)產(chǎn)物）碎片以及蛋白質(zhì)等細(xì)胞的（分泌胞內(nèi)產(chǎn)物）碎片以及蛋白質(zhì)等膠體粒子的去除。膠體粒子的去除。v但是應(yīng)當(dāng)注意，凝聚和絮凝是兩種方法，兩但是應(yīng)當(dāng)注意，凝聚和絮凝是兩種方法，兩個(gè)概念，其具體處理過(guò)程也是有差別的。個(gè)概念，其具體處理過(guò)程也是有差別的。v1、凝聚作用、凝聚作用 凝聚是指在某些電解質(zhì)作用下，破壞細(xì)胞、菌體和

9、凝聚是指在某些電解質(zhì)作用下，破壞細(xì)胞、菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，使膠體粒子聚集的蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，使膠體粒子聚集的過(guò)程。過(guò)程。v凝聚劑主要是一些無(wú)機(jī)類(lèi)電解質(zhì)，由于大部分被處凝聚劑主要是一些無(wú)機(jī)類(lèi)電解質(zhì)，由于大部分被處理的物質(zhì)帶負(fù)電荷（如細(xì)胞或菌體一般帶負(fù)電荷），理的物質(zhì)帶負(fù)電荷（如細(xì)胞或菌體一般帶負(fù)電荷），因此工業(yè)上常用的凝聚劑大多為陽(yáng)離子型，分為無(wú)因此工業(yè)上常用的凝聚劑大多為陽(yáng)離子型，分為無(wú)機(jī)鹽類(lèi)、金屬氧化物類(lèi)。機(jī)鹽類(lèi)、金屬氧化物類(lèi)。v常用的無(wú)機(jī)鹽類(lèi)凝聚劑有：常用的無(wú)機(jī)鹽類(lèi)凝聚劑有：Al2（SO4）318H2O（明礬）、（明礬）、AlCl36H2O、FeCl3、ZnSO4、

10、MgCO3：Al(OH)3、FeSO4、Ca(OH)2或石灰等。或石灰等。 v2、絮凝作用、絮凝作用v絮凝是指使用絮凝劑（通常是天然或合成的大分子絮凝是指使用絮凝劑（通常是天然或合成的大分子量聚電解質(zhì)），在懸浮粒子之間產(chǎn)生架橋作用而使量聚電解質(zhì)），在懸浮粒子之間產(chǎn)生架橋作用而使膠粒形成粗大的絮凝團(tuán)的過(guò)程。膠粒形成粗大的絮凝團(tuán)的過(guò)程。v常用的絮凝劑常用的絮凝劑v聚丙烯酰胺、聚乙烯亞胺、聚胺衍生物、氯化鈣、聚丙烯酰胺、聚乙烯亞胺、聚胺衍生物、氯化鈣、磷酸氫二鈉磷酸氫二鈉v絮凝技術(shù)預(yù)處理發(fā)酵液的優(yōu)點(diǎn)不僅在于過(guò)濾絮凝技術(shù)預(yù)處理發(fā)酵液的優(yōu)點(diǎn)不僅在于過(guò)濾速度的提高，還在于能有效地去除雜蛋白質(zhì)速度的提高，還

11、在于能有效地去除雜蛋白質(zhì)和固體雜質(zhì)，如菌體、細(xì)胞和細(xì)胞碎片等，和固體雜質(zhì)，如菌體、細(xì)胞和細(xì)胞碎片等，提高了濾液質(zhì)量提高了濾液質(zhì)量影響絮凝的因素絮凝劑的添加量發(fā)酵液的pH絮凝劑的分子量攪拌轉(zhuǎn)速攪拌時(shí)間絮凝劑加量對(duì)絮凝效果(濾速)的影響料液中，絮凝劑濃度增加有助于架橋充分，但是過(guò)多的加量反而會(huì)引起吸附飽和，在每個(gè)膠粒上形成覆蓋層而使膠粒產(chǎn)生再次穩(wěn)定現(xiàn)象。發(fā)酵液pH對(duì)陰離子聚丙烯酰胺絮凝效果的影響溶液pH的變化常會(huì)影響離子型絮凝劑中功能團(tuán)的電離度，從而影響分子鏈的伸展形態(tài)。電離度增大，由于鏈節(jié)上相鄰離子基團(tuán)間的電排斥作用，而使分子鏈從卷曲狀態(tài)變?yōu)樯煺範(fàn)顟B(tài)，所以架橋能力提高。（二）雜蛋白質(zhì)的去除方法（

12、二）雜蛋白質(zhì)的去除方法v1等電點(diǎn)沉淀等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小，能沉淀而除去。蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小，能沉淀而除去。 v2變性沉淀變性沉淀 使蛋白質(zhì)變性的方法有：加熱、大幅度改變使蛋白質(zhì)變性的方法有：加熱、大幅度改變pH，加有機(jī)溶，加有機(jī)溶劑（丙酮、乙醇等）、加重金屬離子如劑（丙酮、乙醇等）、加重金屬離子如Ag 、Cu2 、Pb2 等、加有機(jī)酸如三氯乙酸、水楊酸、苦味酸、鞣酸、等、加有機(jī)酸如三氯乙酸、水楊酸、苦味酸、鞣酸、過(guò)氯酸等及表面活性劑。過(guò)氯酸等及表面活性劑。 v3. 加各種蛋白質(zhì)沉淀劑加各種蛋白質(zhì)沉淀劑 加入某些化學(xué)試劑使蛋白質(zhì)與之形成復(fù)合物沉淀加入某些化學(xué)試劑使蛋白質(zhì)與

13、之形成復(fù)合物沉淀v4吸附吸附 在發(fā)酵液中，加入一些反應(yīng)劑，它們互相反應(yīng)生成的沉淀在發(fā)酵液中，加入一些反應(yīng)劑，它們互相反應(yīng)生成的沉淀物對(duì)蛋白質(zhì)具吸附作用而使其凝固。物對(duì)蛋白質(zhì)具吸附作用而使其凝固。 預(yù)處理的方法預(yù)處理的方法3，高價(jià)無(wú)機(jī)離子的去除方法，高價(jià)無(wú)機(jī)離子的去除方法v鈣離子，可用草酸。鈣離子，可用草酸。v鎂離子，可用三聚磷酸鈉它和鎂離子形鎂離子，可用三聚磷酸鈉它和鎂離子形成可溶性絡(luò)合物，用磷酸鹽處理，也能成可溶性絡(luò)合物，用磷酸鹽處理，也能大大降低鈣離子和鎂離子的濃度。此法大大降低鈣離子和鎂離子的濃度。此法可用于環(huán)絲氨酸的提取。可用于環(huán)絲氨酸的提取。v鐵離子，可加入黃血鹽，使形成普魯士鐵離子

14、，可加入黃血鹽，使形成普魯士藍(lán)沉淀。藍(lán)沉淀。二、發(fā)酵液的固液分離二、發(fā)酵液的固液分離v微生物發(fā)酵液中含有大量菌體、細(xì)胞或細(xì)胞微生物發(fā)酵液中含有大量菌體、細(xì)胞或細(xì)胞碎片以及殘余的固體培養(yǎng)基成分。碎片以及殘余的固體培養(yǎng)基成分。v固液分離是指將發(fā)酵液（或培養(yǎng)液）中的懸固液分離是指將發(fā)酵液（或培養(yǎng)液）中的懸浮固體，如細(xì)胞、菌體、細(xì)胞碎片以及蛋白浮固體，如細(xì)胞、菌體、細(xì)胞碎片以及蛋白質(zhì)等的沉淀物或它們的絮凝體分離除去質(zhì)等的沉淀物或它們的絮凝體分離除去 （一）影響過(guò)濾速度的因素（一）影響過(guò)濾速度的因素v1、發(fā)酵液中粒子的直徑、發(fā)酵液中粒子的直徑v2、發(fā)酵液黏度、發(fā)酵液黏度培養(yǎng)基的組成未用完培養(yǎng)基的數(shù)量消沫

15、油發(fā)酵周期菌種對(duì)過(guò)濾速度影響菌種對(duì)過(guò)濾速度影響v真菌的菌絲比較粗大，如青霉菌的菌絲直徑可真菌的菌絲比較粗大，如青霉菌的菌絲直徑可達(dá)達(dá)10m，發(fā)酵液容易過(guò)濾，不需特殊處理。，發(fā)酵液容易過(guò)濾，不需特殊處理。其濾渣呈緊密餅狀物，很容易從濾布上刮下來(lái)，其濾渣呈緊密餅狀物，很容易從濾布上刮下來(lái)，故可采用鼓式真空過(guò)濾機(jī)過(guò)濾。故可采用鼓式真空過(guò)濾機(jī)過(guò)濾。v放線菌發(fā)酵液菌絲細(xì)而分枝，交織成網(wǎng)絡(luò)狀。放線菌發(fā)酵液菌絲細(xì)而分枝，交織成網(wǎng)絡(luò)狀。如鏈霉素發(fā)酵液菌絲僅如鏈霉素發(fā)酵液菌絲僅0.51.0m左右，還含左右，還含有很多多糖類(lèi)物質(zhì)，粘性強(qiáng)，過(guò)濾較困難，一有很多多糖類(lèi)物質(zhì)，粘性強(qiáng)，過(guò)濾較困難，一般需經(jīng)預(yù)處理，以凝固蛋

16、白質(zhì)等膠體。般需經(jīng)預(yù)處理，以凝固蛋白質(zhì)等膠體。v細(xì)菌發(fā)酵液的菌體更細(xì)小，因此，過(guò)濾十分因細(xì)菌發(fā)酵液的菌體更細(xì)小，因此，過(guò)濾十分因準(zhǔn)，如不用絮凝等方法預(yù)處理發(fā)酵液，往往難準(zhǔn)，如不用絮凝等方法預(yù)處理發(fā)酵液，往往難以采用常規(guī)過(guò)濾的設(shè)備來(lái)完成過(guò)濾操作。以采用常規(guī)過(guò)濾的設(shè)備來(lái)完成過(guò)濾操作。培養(yǎng)基的組成對(duì)過(guò)濾速度影響培養(yǎng)基的組成對(duì)過(guò)濾速度影響v用黃豆粉、花生粉作氮源、淀粉作碳源會(huì)使用黃豆粉、花生粉作氮源、淀粉作碳源會(huì)使過(guò)濾困難；過(guò)濾困難；v發(fā)酵后期加消泡油或剩余大量末用完的培養(yǎng)發(fā)酵后期加消泡油或剩余大量末用完的培養(yǎng)基也會(huì)使過(guò)濾困難。基也會(huì)使過(guò)濾困難。發(fā)酵周期對(duì)過(guò)濾的影響發(fā)酵周期對(duì)過(guò)濾的影響v正確選擇發(fā)酵終

17、了時(shí)間對(duì)過(guò)濾影響很大。在正確選擇發(fā)酵終了時(shí)間對(duì)過(guò)濾影響很大。在菌體絲自溶前必須放罐，因?yàn)榧?xì)胞自治后的菌體絲自溶前必須放罐，因?yàn)榧?xì)胞自治后的 分解產(chǎn)物一股很難過(guò)濾。有時(shí)延長(zhǎng)發(fā)酵周期分解產(chǎn)物一股很難過(guò)濾。有時(shí)延長(zhǎng)發(fā)酵周期雖能使發(fā)酵單位有所提高，但嚴(yán)重影響發(fā)酵雖能使發(fā)酵單位有所提高，但嚴(yán)重影響發(fā)酵液質(zhì)量，使色素和膠狀雜質(zhì)增多、過(guò)濾困難，液質(zhì)量，使色素和膠狀雜質(zhì)增多、過(guò)濾困難，最終造成成品質(zhì)量降低。最終造成成品質(zhì)量降低。改善過(guò)濾性能的方法改善過(guò)濾性能的方法v等電點(diǎn)等電點(diǎn)v蛋白質(zhì)變性蛋白質(zhì)變性v吸附吸附v凝聚和絮凝凝聚和絮凝v加入助濾劑加入助濾劑v直接在發(fā)酵液中形成填充直接在發(fā)酵液中形成填充-凝固劑凝固

18、劑v酶解作用酶解作用（二）固（二）固液分離設(shè)備液分離設(shè)備v不同性狀約發(fā)酵液應(yīng)選擇不同的固不同性狀約發(fā)酵液應(yīng)選擇不同的固液分離液分離設(shè)備。常用于發(fā)酵液的分離設(shè)備有：設(shè)備。常用于發(fā)酵液的分離設(shè)備有：板框壓濾機(jī)板框壓濾機(jī)真空鼓式過(guò)濾機(jī)真空鼓式過(guò)濾機(jī)離心分離機(jī)離心分離機(jī) v板框壓濾機(jī)板框壓濾機(jī)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：板框壓濾機(jī)的過(guò)濾面積大；過(guò)濾推動(dòng)力(壓力差)能較大幅度地進(jìn)行調(diào)整，并能耐受較高的壓力差；結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，價(jià)格低，動(dòng)力消耗少等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)缺點(diǎn)不能連續(xù)操作，設(shè)備笨重，勞動(dòng)強(qiáng)度大，衛(wèi)生條件差，非生產(chǎn)的輔助時(shí)間長(zhǎng)，阻礙了過(guò)濾效率的提高。 v鼓式真空過(guò)濾機(jī)鼓式真空過(guò)濾機(jī)優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)能連續(xù)操作，能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制v缺點(diǎn)缺點(diǎn)壓

19、差較小，主要適用于霉菌發(fā)酵液的過(guò)濾。 v離心分離離心分離 v優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)分離速度快，效率高， 操作時(shí)衛(wèi)生條件好等優(yōu)點(diǎn)， 適合于大規(guī)模的分離過(guò)程。 v缺點(diǎn)缺點(diǎn)投資費(fèi)用高， 能耗較大。 三、細(xì)胞的破碎與分離三、細(xì)胞的破碎與分離v微生物的代謝產(chǎn)物有的分泌到細(xì)胞或組織之外，例微生物的代謝產(chǎn)物有的分泌到細(xì)胞或組織之外，例如細(xì)菌產(chǎn)生的堿性蛋白酶，霉菌產(chǎn)生的糖化酶等，如細(xì)菌產(chǎn)生的堿性蛋白酶，霉菌產(chǎn)生的糖化酶等，稱(chēng)為胞外產(chǎn)物。稱(chēng)為胞外產(chǎn)物。v還有許多是存在于細(xì)胞內(nèi)，例如青霉素?；福瑝A還有許多是存在于細(xì)胞內(nèi)，例如青霉素?；福瑝A性磷酸酯酶等，稱(chēng)為胞內(nèi)產(chǎn)物。性磷酸酯酶等，稱(chēng)為胞內(nèi)產(chǎn)物。v對(duì)于胞外產(chǎn)物只需直接將發(fā)酵液

20、預(yù)處理及過(guò)濾，獲對(duì)于胞外產(chǎn)物只需直接將發(fā)酵液預(yù)處理及過(guò)濾，獲得澄清的濾液，作為進(jìn)一步純化的出發(fā)原液，得澄清的濾液，作為進(jìn)一步純化的出發(fā)原液，v對(duì)于胞內(nèi)產(chǎn)物，則需首先收集菌體進(jìn)行細(xì)胞破碎，對(duì)于胞內(nèi)產(chǎn)物，則需首先收集菌體進(jìn)行細(xì)胞破碎，使代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)入液相中，然后，再進(jìn)行細(xì)胞碎片的使代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)入液相中，然后，再進(jìn)行細(xì)胞碎片的分離。分離。4，微生物細(xì)胞的破碎技術(shù)，微生物細(xì)胞的破碎技術(shù)v機(jī)械方法機(jī)械方法高壓勻漿器 珠磨法撞擊破碎法 超聲波破碎 v非機(jī)械方法非機(jī)械方法 酶解滲透壓沖擊凍結(jié)和融化干燥法化學(xué)法高壓勻漿器 采用高壓勻漿器是大規(guī)模破碎細(xì)胞的常用方法，利用高壓迫使細(xì)胞懸浮液通過(guò)針形閥，由于突然減壓和高

21、速?zèng)_擊撞擊環(huán)造成細(xì)胞破裂高壓勻降的排出閥v珠磨法珠磨法 研磨是常用的一種方法，它將細(xì)胞懸浮液與研磨是常用的一種方法，它將細(xì)胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁一起快速攪拌或玻璃小珠、石英砂或氧化鋁一起快速攪拌或研磨，使達(dá)到細(xì)胞的某種程度破碎。這些裝研磨，使達(dá)到細(xì)胞的某種程度破碎。這些裝置的主要缺點(diǎn)是在破碎期間樣品溫度迅速升置的主要缺點(diǎn)是在破碎期間樣品溫度迅速升高，通過(guò)用二氧化碳來(lái)冷卻容器可得到部分高，通過(guò)用二氧化碳來(lái)冷卻容器可得到部分解決。解決。超聲波法超聲波法細(xì)胞的破碎是由于超聲波的空穴作用，從而產(chǎn)細(xì)胞的破碎是由于超聲波的空穴作用，從而產(chǎn)生一個(gè)極為強(qiáng)烈的沖擊波壓力，由它引起的粘生一個(gè)極為強(qiáng)烈的

22、沖擊波壓力，由它引起的粘滯性旋渦在介質(zhì)中的懸浮細(xì)胞上造成了剪切應(yīng)滯性旋渦在介質(zhì)中的懸浮細(xì)胞上造成了剪切應(yīng)力，促使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動(dòng)，從而使細(xì)胞破力，促使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動(dòng)，從而使細(xì)胞破碎。碎。對(duì)于不同菌種的發(fā)酵液、超聲波處理的效果不對(duì)于不同菌種的發(fā)酵液、超聲波處理的效果不同，桿菌比球菌易破碎、革蘭氏陰性菌細(xì)胞比同，桿菌比球菌易破碎、革蘭氏陰性菌細(xì)胞比革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞容易破碎，對(duì)酵母菌的效果革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞容易破碎，對(duì)酵母菌的效果級(jí)差。級(jí)差。該法不適于大規(guī)模操作，因?yàn)榉糯蠛?，要輸入該法不適于大規(guī)模操作，因?yàn)榉糯蠛?，要輸入很高的能量?lái)提供必要的冷卻，這是困難的。很高的能量來(lái)提供必要的冷卻，這是困難

23、的。 撞擊破碎法撞擊破碎法一種改進(jìn)的高壓方法是將濃縮的菌體懸一種改進(jìn)的高壓方法是將濃縮的菌體懸浮液冷卻至浮液冷卻至-25C至至-30 C形成冰晶體，形成冰晶體，利用利用500 MPa以上的高壓沖擊，冷凍細(xì)以上的高壓沖擊，冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出。細(xì)胞破碎是由胞從高壓閥小孔中擠出。細(xì)胞破碎是由于冰晶體的磨損，包埋在冰中的微生物于冰晶體的磨損，包埋在冰中的微生物的變形所引起的。的變形所引起的。該法的優(yōu)點(diǎn)是適用的范圍廣，破碎率高，該法的優(yōu)點(diǎn)是適用的范圍廣，破碎率高，細(xì)胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留細(xì)胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高，率高，該法對(duì)冷凍該法對(duì)冷凍融解敏感的生化物質(zhì)不適融解敏感的生

24、化物質(zhì)不適用。用。 滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)中(如一定濃度的甘油或蔗糖溶液)，入達(dá)到平衡后，介質(zhì)被突然稀釋?zhuān)蛘邔⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞壁的破裂。滲透壓沖擊的方法僅對(duì)細(xì)胞壁較脆弱的菌，或者細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理，或合成受抑制而強(qiáng)度減弱時(shí)才是合適的。 v凍結(jié)-融化法v將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍和室溫下融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。v對(duì)于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。但通常破碎率很低即使反復(fù)循環(huán)多次也不能提高收率。另外，還可能引起對(duì)凍融敏感的某些蛋白質(zhì)的變性。干燥法可采用空氣干燥，真空干燥，噴霧干燥和冷凍干燥等?？諝飧稍?/p>

25、主要適用于酵母菌。真空干燥適用于細(xì)菌的干燥。冷凍干燥適用于較不穩(wěn)定的生化物質(zhì)。干燥法條件變化較劇烈，容易引起蛋白質(zhì)或其它組織變性。 化學(xué)法用酸堿及表面活性劑處理，可以使蛋白質(zhì)水解，細(xì)胞溶解或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來(lái)。某些脂溶性溶劑也能作為化學(xué)處理的方法，如丁醇、丙酮、氯仿及尿素等。但是，這些試劑容易引起生化物質(zhì)破壞，還會(huì)帶來(lái)分離和回收化學(xué)物質(zhì)的問(wèn)題。 酶解法利用酶反應(yīng)，分解破壞細(xì)胞壁上特殊的鍵，從而達(dá)到破壁的目的。優(yōu)點(diǎn)：專(zhuān)一性強(qiáng)，發(fā)生酶解的條件溫和。缺點(diǎn)：酶水解費(fèi)用較貴，一般只適用于小規(guī)模的實(shí)驗(yàn)室研究。溶菌酶是應(yīng)用最多的酶，它能專(zhuān)一地分解細(xì)胞壁上糖蛋白分子的-1，4糖苷鍵，使脂多糖解離，經(jīng)溶

26、菌酶處理后的細(xì)胞移至低滲溶液中使細(xì)胞破裂。自溶作用是酶解的另一種方法，所需溶胞的酶是由微生物本身產(chǎn)生的。影響自溶過(guò)程的因素有溫度、時(shí)間、pH緩沖液濃度、細(xì)胞代謝途徑等。自溶法在一定程度上能用于工業(yè)規(guī)模，但是，對(duì)不穩(wěn)定的微生物容易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后的細(xì)胞培養(yǎng)液過(guò)濾速度也會(huì)降低。 破碎方法的選擇破碎方法的選擇v選擇合適的破碎方法需要考慮下列因素：選擇合適的破碎方法需要考慮下列因素：細(xì)胞的數(shù)量；細(xì)胞的數(shù)量；所需要的產(chǎn)物對(duì)破碎條件所需要的產(chǎn)物對(duì)破碎條件(溫度、化學(xué)試溫度、化學(xué)試劑、酶等劑、酶等)的敏感性；的敏感性；要達(dá)到的破碎程度及破碎所必要的速度，要達(dá)到的破碎程度及破碎所必要的速度，盡可能

27、采用最溫和的方法；盡可能采用最溫和的方法；具有大規(guī)模應(yīng)用潛力的生化產(chǎn)品應(yīng)選擇具有大規(guī)模應(yīng)用潛力的生化產(chǎn)品應(yīng)選擇適合于放大的破碎技術(shù)。適合于放大的破碎技術(shù)。 第二節(jié)第二節(jié) 發(fā)酵產(chǎn)物的提取發(fā)酵產(chǎn)物的提取v提取的目的是除去與目標(biāo)產(chǎn)物理化性能有很提取的目的是除去與目標(biāo)產(chǎn)物理化性能有很大差異的物質(zhì)，使產(chǎn)物濃縮，并明顯提高產(chǎn)大差異的物質(zhì)，使產(chǎn)物濃縮，并明顯提高產(chǎn)品的純度，常用的方法有沉淀法、樹(shù)脂法、品的純度，常用的方法有沉淀法、樹(shù)脂法、吸附法、蒸餾法、萃取法、膜分離技術(shù)和凝吸附法、蒸餾法、萃取法、膜分離技術(shù)和凝膠層析法等等。膠層析法等等。一、沉淀法一、沉淀法v沉淀法是最古老的分離和純化生物物質(zhì)的方法。由沉

28、淀法是最古老的分離和純化生物物質(zhì)的方法。由于其濃縮作用常大于純化作用，因而沉淀法通常作于其濃縮作用常大于純化作用，因而沉淀法通常作為初步分離的一種方法，用于從去除了菌體或細(xì)胞為初步分離的一種方法，用于從去除了菌體或細(xì)胞碎片的發(fā)酵液中沉淀出生物物質(zhì)，然后再利用色層碎片的發(fā)酵液中沉淀出生物物質(zhì)，然后再利用色層分離等方法進(jìn)一步提高其純度。分離等方法進(jìn)一步提高其純度。v沉淀法由于成本低、收率高沉淀法由于成本低、收率高(不會(huì)使蛋白質(zhì)等大分子不會(huì)使蛋白質(zhì)等大分子失活失活)、濃縮倍數(shù)高和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是下游加工、濃縮倍數(shù)高和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是下游加工過(guò)程中應(yīng)用廣泛的值得注意的方法。過(guò)程中應(yīng)用廣泛的值得注意

29、的方法。v根據(jù)所加入的沉淀劑的不同，沉淀法可以分為：根據(jù)所加入的沉淀劑的不同，沉淀法可以分為：鹽析法；鹽析法；等電點(diǎn)沉淀法；等電點(diǎn)沉淀法；有機(jī)溶劑沉淀法；有機(jī)溶劑沉淀法；非離子型聚合物沉淀法；非離子型聚合物沉淀法；聚電解質(zhì)沉淀法；聚電解質(zhì)沉淀法；高價(jià)金屬離子沉淀法。高價(jià)金屬離子沉淀法。（一）鹽析法（一）鹽析法v在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性而使其析出，這種方法稱(chēng)白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性而使其析出，這種方法稱(chēng)為鹽析。為鹽析。 v鹽析法成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備；操鹽析法成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備；操作簡(jiǎn)單、安全；不會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，經(jīng)透作

30、簡(jiǎn)單、安全；不會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，經(jīng)透析去鹽后，能得到保持生物活性的純化蛋白析去鹽后，能得到保持生物活性的純化蛋白質(zhì)。質(zhì)。v但是效果不理想，通常只是作為初步的分離但是效果不理想，通常只是作為初步的分離純化，還需要結(jié)合其它的純化。純化，還需要結(jié)合其它的純化。v鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭(zhēng)奪水分子，降低了用于溶鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭(zhēng)奪水分子，降低了用于溶解蛋白質(zhì)的有效水量，減弱了蛋白質(zhì)的水合程度，解蛋白質(zhì)的有效水量，減弱了蛋白質(zhì)的水合程度，破壞了蛋白表面的水化膜，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度下降；破壞了蛋白表面的水化膜，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度下降；v鹽離子電荷的中和作用，使蛋白質(zhì)溶解度下降；鹽離子電荷的中和作用，使蛋白質(zhì)溶解度

31、下降；v鹽離子引起原本在蛋白質(zhì)分子周?chē)行蚺帕械乃}離子引起原本在蛋白質(zhì)分子周?chē)行蚺帕械乃肿拥臉O化，使水活度降低。分子的極化，使水活度降低。鹽析的機(jī)理鹽析的機(jī)理鹽析機(jī)理示意圖鹽析機(jī)理示意圖 2、影響蛋白質(zhì)鹽析效果的主要因素、影響蛋白質(zhì)鹽析效果的主要因素v1）鹽析劑的選擇）鹽析劑的選擇v2）鹽析劑的加入量）鹽析劑的加入量v3）溫度和）溫度和pHv4）操作方式）操作方式（二）等電點(diǎn)沉淀法（二）等電點(diǎn)沉淀法v兩性電解質(zhì)分子上的凈電荷為零時(shí)溶解度最低，不兩性電解質(zhì)分子上的凈電荷為零時(shí)溶解度最低，不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，以此為基礎(chǔ)進(jìn)同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行分離的方法既

32、等電點(diǎn)沉淀法。行分離的方法既等電點(diǎn)沉淀法。v利用等電點(diǎn)法沉淀蛋白時(shí)必須了解制備物對(duì)酸堿的利用等電點(diǎn)法沉淀蛋白時(shí)必須了解制備物對(duì)酸堿的穩(wěn)定性，不然盲目使用十分危險(xiǎn)。不少蛋白質(zhì)與金穩(wěn)定性，不然盲目使用十分危險(xiǎn)。不少蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合后，等電點(diǎn)會(huì)發(fā)生偏移，故溶液中含有屬離子結(jié)合后，等電點(diǎn)會(huì)發(fā)生偏移，故溶液中含有金屬離子時(shí)，必須注意調(diào)整金屬離子時(shí)，必須注意調(diào)整pH值。等電點(diǎn)法常與鹽值。等電點(diǎn)法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀方法聯(lián)合使用，析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀方法聯(lián)合使用，以提高其沉淀能力。以提高其沉淀能力。（三）有機(jī)溶劑沉淀法（三）有機(jī)溶劑沉淀法v利用蛋白質(zhì)在一定濃度的有機(jī)溶劑中的溶解

33、利用蛋白質(zhì)在一定濃度的有機(jī)溶劑中的溶解度差異而分離的方法，稱(chēng)有機(jī)溶劑沉淀法。度差異而分離的方法，稱(chēng)有機(jī)溶劑沉淀法。有機(jī)溶劑能降低溶液的電解常數(shù)，從而增加有機(jī)溶劑能降低溶液的電解常數(shù)，從而增加蛋白蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，導(dǎo)致溶解度質(zhì)分子上不同電荷的引力，導(dǎo)致溶解度的降低；另外，有機(jī)溶劑與水的作用，能破的降低；另外，有機(jī)溶劑與水的作用，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，導(dǎo)致蛋白質(zhì)相互聚集沉壞蛋白質(zhì)的水化膜，導(dǎo)致蛋白質(zhì)相互聚集沉淀析出。淀析出。 v有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)缺點(diǎn)有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)缺點(diǎn)v該法優(yōu)點(diǎn)在于：該法優(yōu)點(diǎn)在于：分辨能力比鹽析法高，即分辨能力比鹽析法高，即蛋白質(zhì)或其它溶劑只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶蛋白質(zhì)

34、或其它溶劑只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度下沉淀；劑濃度下沉淀；沉淀不用脫鹽，過(guò)濾較為沉淀不用脫鹽，過(guò)濾較為容易；容易；在生化制備中應(yīng)用比鹽析法廣泛。在生化制備中應(yīng)用比鹽析法廣泛。其缺點(diǎn)是對(duì)具有生物活性的大分子容易引起其缺點(diǎn)是對(duì)具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作要求在低溫下進(jìn)行?？傮w來(lái)變性失活，操作要求在低溫下進(jìn)行?？傮w來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)和酶的有機(jī)溶劑沉淀法不如鹽析說(shuō)，蛋白質(zhì)和酶的有機(jī)溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。法普遍。v有機(jī)溶劑沉淀法的影響因素有機(jī)溶劑沉淀法的影響因素v有機(jī)溶劑的選擇首要條件是能和水混溶，使有機(jī)溶劑的選擇首要條件是能和水混溶，使用較多的有機(jī)溶劑是乙醇、甲醇、丙酮，還用較多的有機(jī)溶

35、劑是乙醇、甲醇、丙酮，還有二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙腈和有二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙腈和2-甲甲基基-2,4戊二醇等。使用的有機(jī)溶劑多為乙醇戊二醇等。使用的有機(jī)溶劑多為乙醇和丙酮。蛋白質(zhì)和酶的沉淀大多采用乙醇和丙酮。蛋白質(zhì)和酶的沉淀大多采用乙醇,由由于甲醇、丙酮均有一定毒性于甲醇、丙酮均有一定毒性,故使用時(shí)必須謹(jǐn)故使用時(shí)必須謹(jǐn)慎慎v溫度溫度 低溫可保持生物大分子活性，同時(shí)降低低溫可保持生物大分子活性，同時(shí)降低其溶解度，提高提取效率；其溶解度，提高提取效率；v樣品濃度和樣品濃度和pH 與鹽析法中的作用基本相同；與鹽析法中的作用基本相同；二、樹(shù)脂法和吸附法二、樹(shù)脂法和吸附法v樹(shù)脂法和吸附法在生

36、化物質(zhì)的提取、濃縮、樹(shù)脂法和吸附法在生化物質(zhì)的提取、濃縮、純化、分離、脫鹽、轉(zhuǎn)化、中和及脫色等操純化、分離、脫鹽、轉(zhuǎn)化、中和及脫色等操作單元上有著廣泛的應(yīng)用作單元上有著廣泛的應(yīng)用v（一）樹(shù)脂法（一）樹(shù)脂法v原理：利用樹(shù)脂與產(chǎn)物結(jié)合，讓產(chǎn)物保留在原理：利用樹(shù)脂與產(chǎn)物結(jié)合，讓產(chǎn)物保留在樹(shù)脂上與雜質(zhì)分開(kāi)，再?gòu)臉?shù)脂上洗脫產(chǎn)物樹(shù)脂上與雜質(zhì)分開(kāi)，再?gòu)臉?shù)脂上洗脫產(chǎn)物離子交換樹(shù)脂法離子交換樹(shù)脂法v離子交換作用：是指一離子交換作用：是指一個(gè)溶液中的某一種離子個(gè)溶液中的某一種離子與一個(gè)固體中的另一種與一個(gè)固體中的另一種具有相同電荷的離子互具有相同電荷的離子互相調(diào)換位置，即溶液中相調(diào)換位置，即溶液中的離子跑到固體上

37、去，的離子跑到固體上去，把固體上的離子替換下把固體上的離子替換下來(lái)。這里溶液稱(chēng)流動(dòng)相，來(lái)。這里溶液稱(chēng)流動(dòng)相，而固體稱(chēng)固定相。而固體稱(chēng)固定相。v蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、酶、抗生素酶、抗生素。v該法可以同時(shí)分析多種離子化合物，具有靈該法可以同時(shí)分析多種離子化合物，具有靈敏度高，重復(fù)性、選擇性好，分析速度快等敏度高，重復(fù)性、選擇性好，分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，優(yōu)點(diǎn)， 離子交換樹(shù)脂的基本概念離子交換樹(shù)脂的基本概念v離子交換劑通常是一種不溶性高分子離子交換劑通常是一種不溶性高分子化合物，它的分子中含有可解離的基化合物，它的分子中含有可解離的基團(tuán)，這些基因在水溶液中能與溶液中團(tuán)，這些基因在水溶

38、液中能與溶液中的其它陽(yáng)離子或陰離子起交換作用。的其它陽(yáng)離子或陰離子起交換作用。v陽(yáng)離子型陽(yáng)離子型 v陰離子型陰離子型v2、樹(shù)脂的選擇及其操作方法、樹(shù)脂的選擇及其操作方法v要恰當(dāng)?shù)剡x擇離子交換劑，必須對(duì)被分離物的性質(zhì)和所處溶液組分及酸堿度等因素進(jìn)行全面分析 。v取決于被分離的物質(zhì)在其穩(wěn)定的取決于被分離的物質(zhì)在其穩(wěn)定的pH下所帶的電荷，下所帶的電荷，如果帶正電，則選擇陽(yáng)離子交換劑；如帶負(fù)電，則如果帶正電，則選擇陽(yáng)離子交換劑；如帶負(fù)電，則選擇陰離子交換劑。選擇陰離子交換劑。 v一般分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)一般分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)常用弱酸型或弱堿型離子交換劑。基本操作 緩沖液的選擇 層析柱的選擇 洗脫

39、流速加樣 洗脫洗脫液的監(jiān)測(cè)收集及組分鑒定 離子交換劑的清洗、再生和保存 離子交換劑的處理 離子交換劑的選擇v （二）吸附法（二）吸附法v在發(fā)酵工業(yè)的下游加工過(guò)程中，吸附法應(yīng)用在發(fā)酵工業(yè)的下游加工過(guò)程中，吸附法應(yīng)用于發(fā)酵產(chǎn)品的除雜、脫色、有毒物質(zhì)和抗生于發(fā)酵產(chǎn)品的除雜、脫色、有毒物質(zhì)和抗生素的提純精制。素的提純精制。吸附法的原理吸附法的原理v吸附法是利用吸附劑與雜質(zhì)、色素物質(zhì)、有吸附法是利用吸附劑與雜質(zhì)、色素物質(zhì)、有毒物質(zhì)、產(chǎn)品之間分子引力的差異，從而起毒物質(zhì)、產(chǎn)品之間分子引力的差異，從而起到分離的作用。到分離的作用。吸附的目的吸附的目的v將產(chǎn)品吸附濃縮于吸附劑上；將產(chǎn)品吸附濃縮于吸附劑上；v將

40、雜質(zhì)、色素等需要從發(fā)酵液中去除的物質(zhì)將雜質(zhì)、色素等需要從發(fā)酵液中去除的物質(zhì)吸附于吸附劑上。吸附于吸附劑上。吸附法的優(yōu)缺點(diǎn)吸附法的優(yōu)缺點(diǎn)v優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：可不用或少用有機(jī)溶劑；操作簡(jiǎn)便、安全、設(shè)備簡(jiǎn)單；生產(chǎn)過(guò)程中pH變化小，適用于穩(wěn)定性較差的生化物質(zhì)。v缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：吸附法選擇性差、收率不高。無(wú)機(jī)吸附劑性能不穩(wěn)定，不能連續(xù)操作，勞動(dòng)強(qiáng)度大。炭粉等吸附劑影響環(huán)境衛(wèi)生。v凝膠類(lèi)吸附劑、大網(wǎng)格聚合物吸附劑凝膠類(lèi)吸附劑、大網(wǎng)格聚合物吸附劑吸附的類(lèi)型吸附的類(lèi)型v物理吸附：吸附劑和吸附物通過(guò)分子力物理吸附：吸附劑和吸附物通過(guò)分子力(范德華力范德華力)產(chǎn)生的吸附。產(chǎn)生的吸附。v化學(xué)吸附：化學(xué)吸附： 化學(xué)吸附是由于吸

41、附劑在吸附物之間的化學(xué)吸附是由于吸附劑在吸附物之間的電子轉(zhuǎn)移，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生的，屬于庫(kù)侖力電子轉(zhuǎn)移，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生的，屬于庫(kù)侖力 范范圍。圍。v交換吸附：交換吸附： 吸附劑表面如為極性分子或離子所組成吸附劑表面如為極性分子或離子所組成則它會(huì)吸引溶液中帶相反電荷的離子而形成雙電層。則它會(huì)吸引溶液中帶相反電荷的離子而形成雙電層。這種吸附又稱(chēng)為極性吸附。這種吸附又稱(chēng)為極性吸附。吸附劑的基本要求吸附劑的基本要求v吸附劑要求顆粒密度小，表面積大，但孔隙吸附劑要求顆粒密度小，表面積大，但孔隙也不能太多，否則被吸附物質(zhì)不易被洗脫。也不能太多，否則被吸附物質(zhì)不易被洗脫。v吸附劑的顆粒大小要均勻。吸附劑

42、的顆粒大小要均勻。v吸附劑的吸附能力要大，但不能影響洗脫。吸附劑的吸附能力要大，但不能影響洗脫。吸附劑的種類(lèi)吸附劑的種類(lèi)v有機(jī)吸附劑（活性炭）有機(jī)吸附劑（活性炭）v無(wú)機(jī)吸附劑（硅膠、氧化鋁）無(wú)機(jī)吸附劑（硅膠、氧化鋁）v活性炭活性炭 是使用較多的一種非極性吸附劑。層析用的是使用較多的一種非極性吸附劑。層析用的活性炭，最好選用顆?；钭⑻?，若為活性炭細(xì)粉，活性炭，最好選用顆?；钭⑻?，若為活性炭細(xì)粉，則需加入適量硅藻土作為助濾劑一并裝柱，以免流則需加入適量硅藻土作為助濾劑一并裝柱，以免流速太慢。速太慢。v活性炭的吸附作用，在水溶液中最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑活性炭的吸附作用，在水溶液中最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中則較低弱

43、。故水的洗脫能力最弱，而有機(jī)溶劑則中則較低弱。故水的洗脫能力最弱，而有機(jī)溶劑則較強(qiáng)。例如以醇較強(qiáng)。例如以醇-水進(jìn)行洗脫時(shí)，則隨乙醇濃度的遞水進(jìn)行洗脫時(shí)，則隨乙醇濃度的遞增而洗脫力增加。增而洗脫力增加。v活性炭對(duì)芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，活性炭對(duì)芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，對(duì)大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用對(duì)大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用這些吸附性的差別，可將水溶性芳香族物質(zhì)與脂肪這些吸附性的差別，可將水溶性芳香族物質(zhì)與脂肪族物質(zhì)分開(kāi)，單糖與多糖分開(kāi)，氨基酸與多肽分開(kāi)。族物質(zhì)分開(kāi)，單糖與多糖分開(kāi)，氨基酸與多肽分開(kāi)。v目前，多用于在純化過(guò)程中進(jìn)行脫色和脫

44、臭等操作目前，多用于在純化過(guò)程中進(jìn)行脫色和脫臭等操作中的簡(jiǎn)單吸附過(guò)程中的簡(jiǎn)單吸附過(guò)程 2. 硅膠 是最常用的吸附劑，通常用SiO2.xH2O表示，是具有硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu)，表面有許多硅醇基的多孔性微粒。硅醇基可與極性化合物或不飽和化合物形成氫鍵而使硅膠具較強(qiáng)的吸附力。 水能與硅膠表面羥基結(jié)合而使其失去活性，經(jīng)加熱可被除去的水稱(chēng)自由水，若自由水含量達(dá)17%以上，則吸附力極低，此時(shí)，硅膠只能用于分配層析。若將硅膠在105-110加熱30min ，吸附能力顯著增強(qiáng)，這一過(guò)程稱(chēng)為活化。如果將硅膠加熱到500，硅醇基結(jié)構(gòu)會(huì)變成硅氧烷結(jié)構(gòu)，吸附能力顯著下降。 硅膠具有微酸性，適用于分離酸性和中性物質(zhì)，如有機(jī)酸、

45、氨基酸、甾體等。 3.氧化鋁 分酸性、堿性和中性三種，酸性氧化鋁(pH4-5)適合于分離酸性化合物，堿性氧化鋁(pH9-10)適合于分離堿性化合物，中性氧化鋁(pH7)適合于分生物堿、揮發(fā)油、萜類(lèi)、甾體及在酸、堿中不穩(wěn)定的甙類(lèi)、酯類(lèi)等化合物。 氧化鋁用前也需脫水活化，通常于400高溫下加熱6h，使氧化鋁的含水量在0%-3%之間， 可得到級(jí)或級(jí)氧化鋁，但溫度過(guò)高也會(huì)破壞氧化鋁的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。4.大孔吸附樹(shù)脂和聚酰胺近年用于中藥活性成分的分離。 三、萃取三、萃取v溶劑萃取法是溶劑萃取法是20世紀(jì)世紀(jì)40年代興起的一項(xiàng)化工年代興起的一項(xiàng)化工分離技術(shù)，它是用一種溶劑將產(chǎn)物自另一種分離技術(shù)，它是用一種溶劑將

46、產(chǎn)物自另一種溶劑溶劑(如水如水)中提取出來(lái)，達(dá)到濃縮和提純的中提取出來(lái)，達(dá)到濃縮和提純的目的。目的。v溶劑萃取法比化學(xué)沉淀法分離程度高，比離溶劑萃取法比化學(xué)沉淀法分離程度高，比離子交換法選擇性好，傳質(zhì)快，比蒸餾法能耗子交換法選擇性好，傳質(zhì)快，比蒸餾法能耗低且生產(chǎn)能力大，周期短，便于連續(xù)操作、低且生產(chǎn)能力大，周期短，便于連續(xù)操作、容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等。容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等。（一）萃取的基本概念（一）萃取的基本概念v1、萃取：利用物質(zhì)在兩種成相的溶劑中溶解、萃?。豪梦镔|(zhì)在兩種成相的溶劑中溶解度的不同，使所需的目的物質(zhì)從一種溶劑中度的不同，使所需的目的物質(zhì)從一種溶劑中轉(zhuǎn)移到另一種溶劑中，從而達(dá)到分離純化的

47、轉(zhuǎn)移到另一種溶劑中，從而達(dá)到分離純化的目的。目的。v溶劑萃取法是以分配定律為基礎(chǔ)的。溶劑萃取法是以分配定律為基礎(chǔ)的。v在萃取中，被提取的溶液稱(chēng)為料液，其中欲在萃取中，被提取的溶液稱(chēng)為料液，其中欲提取的物質(zhì)稱(chēng)為溶質(zhì)。提取的物質(zhì)稱(chēng)為溶質(zhì)。v2、反萃取、反萃取 v蛋白質(zhì)進(jìn)入反膠團(tuán)溶液是一協(xié)同過(guò)程。在蛋白質(zhì)進(jìn)入反膠團(tuán)溶液是一協(xié)同過(guò)程。在有機(jī)溶劑相和水相兩宏觀相界面間的表面有機(jī)溶劑相和水相兩宏觀相界面間的表面活性劑層活性劑層 ,同鄰近的蛋白質(zhì)分子發(fā)生靜電吸同鄰近的蛋白質(zhì)分子發(fā)生靜電吸引而變形引而變形 ,接著兩界面形成含有蛋白質(zhì)的反接著兩界面形成含有蛋白質(zhì)的反膠團(tuán)膠團(tuán) ,然后擴(kuò)散到有機(jī)相中然后擴(kuò)散到有機(jī)相

48、中 ,從而實(shí)現(xiàn)了蛋從而實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的萃取。改變水相條件白質(zhì)的萃取。改變水相條件 (如如pH值、離子值、離子種類(lèi)或離子強(qiáng)度種類(lèi)或離子強(qiáng)度 ) ,又可使蛋白質(zhì)從有機(jī)相又可使蛋白質(zhì)從有機(jī)相中返回到水相中中返回到水相中 ,實(shí)現(xiàn)反萃取過(guò)程。實(shí)現(xiàn)反萃取過(guò)程。 v3、物理萃取和化學(xué)萃取、物理萃取和化學(xué)萃?。ǘ┤榛推迫榛ǘ┤榛推迫榛痸乳化：乳化：液體分散在另一不相溶的液體中的分散液體分散在另一不相溶的液體中的分散體系體系v乳濁液的形式：乳濁液的形式：水包油、油包水水包油、油包水v常用的去乳化的方法：常用的去乳化的方法：過(guò)濾和離心、加熱、稀過(guò)濾和離心、加熱、稀釋法、加電解質(zhì)、吸附法、頂替法、轉(zhuǎn)型法釋法

49、、加電解質(zhì)、吸附法、頂替法、轉(zhuǎn)型法（三）常用去乳劑（三）常用去乳劑v陽(yáng)離子表面活性劑（溴代十五烷基吡啶）陽(yáng)離子表面活性劑（溴代十五烷基吡啶） 陰離子表面活性劑（十二烷基硫酸鈉）陰離子表面活性劑（十二烷基硫酸鈉）v（四）萃取方式（四）萃取方式混合器溶劑發(fā)酵液分離器提取液殘余液v多次提煉法多次提煉法混合器溶劑發(fā)酵液分離器提取液混合器溶劑分離器提取液混合器分離器提取液殘余液溶劑殘余液殘余液v多級(jí)對(duì)流萃取多級(jí)對(duì)流萃取第一混合器分離器第二混合器分離器第三混合器分離器最后提取液提取液殘余液殘余液最后殘余液提取液溶劑發(fā)酵液一級(jí)二級(jí)三級(jí)A 90%A 70%A 50%四、蒸餾分離提取法四、蒸餾分離提取法v蒸餾是

50、分離液體混合物的一種有效方法蒸餾是分離液體混合物的一種有效方法v常用的蒸餾方法：簡(jiǎn)單蒸餾、精餾和特殊精常用的蒸餾方法：簡(jiǎn)單蒸餾、精餾和特殊精餾餾v操作方式：間歇式、連續(xù)式操作方式：間歇式、連續(xù)式v壓力：常壓蒸餾、加壓蒸餾、真空蒸餾壓力：常壓蒸餾、加壓蒸餾、真空蒸餾酒精蒸餾酒精蒸餾v選擇蒸餾流程依據(jù)：選擇蒸餾流程依據(jù)：v1）生產(chǎn)原料和成熟醪特性、）生產(chǎn)原料和成熟醪特性、v2）產(chǎn)品質(zhì)量的實(shí)際要求）產(chǎn)品質(zhì)量的實(shí)際要求v3）節(jié)約蒸汽）節(jié)約蒸汽v4）節(jié)約用水）節(jié)約用水五、凝膠層析五、凝膠層析常出現(xiàn)多種名稱(chēng) ：如凝膠過(guò)濾、分子篩層析、排阻層析、凝膠滲透層析等。凝膠層析的定義：凝膠層析的定義： 凝膠是一種具

51、有多孔、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的分子篩。利用這種凝膠分子篩對(duì)大小、形狀不同的分子進(jìn)行層析分離，稱(chēng)凝膠層析 。凝膠層析的應(yīng)用范圍：凝膠層析的應(yīng)用范圍： 凝膠層析法適用于分離和提純蛋白質(zhì)、酶、多肽、激素、多糖、核酸類(lèi)等物質(zhì)。分子大小彼此相差25%的樣品，只要通過(guò)單一凝膠床就可以完全將它們分開(kāi)。利用凝膠的分子篩特性，可對(duì)這些物質(zhì)的溶液進(jìn)行脫鹽、濃縮、去熱源和脫色。凝膠層析的優(yōu)點(diǎn)凝膠層析的優(yōu)點(diǎn) 凝膠層析具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、分離迅速及不影響分子生物學(xué)活性等優(yōu)點(diǎn)。目前已被廣泛應(yīng)用于各種生化產(chǎn)品的分離和純化。凝膠層析的基本原理凝膠層析的基本原理 凝膠層析的原理 l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脫開(kāi)始，小分子擴(kuò)散進(jìn)

52、人凝膠顆粒內(nèi)，大分子被排阻于顆粒之外；3 大小分子分開(kāi)： 4大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在進(jìn)行中 凝膠是一類(lèi)多孔性高分子聚合物，每個(gè)顆粒猶如一個(gè)篩子。當(dāng)樣品溶液通過(guò)凝膠柱時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量較大的物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔而只能沿著凝膠顆粒間的孔隙，隨著溶劑流動(dòng)，因此流程較短，向前移動(dòng)速度快而首先流出層析柱；反之，相對(duì)分子質(zhì)量較小的物質(zhì)由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔，可自由地進(jìn)出凝膠顆粒的網(wǎng)孔，在向下移動(dòng)過(guò)程中，它們從凝膠內(nèi)擴(kuò)散到膠?？紫逗笤龠M(jìn)入另 一凝膠顆粒，如此不斷地進(jìn)入與逸出，使流量增長(zhǎng)，移動(dòng)速率慢而最后流出層析柱。而中等大小的分子，它們也能在凝膠顆粒內(nèi)外分布，部分進(jìn)入顆粒，從而在大分子物質(zhì)

53、與小分子物質(zhì)之間被洗脫。這樣，經(jīng)過(guò)層析柱，使混合物中的各物質(zhì)按其分子大小不同而被分離。 Vt=Vo+Vi+Vg Vt=R2h V。簡(jiǎn)稱(chēng)為外水體積，Vo等于被完全排阻的大分子的洗脫體積。可以用一個(gè)已知相對(duì)分子質(zhì)量遠(yuǎn)超過(guò)凝膠排阻極限的有色分子，如常用的藍(lán)色葡聚糖-2000溶液通過(guò)柱床，即可測(cè)出柱床的外水體積Vo。 Vi簡(jiǎn)稱(chēng)內(nèi)水體積，可由gWr求得（g為干凝膠質(zhì)量，單位為g，Wr為凝膠吸水量，以mLg表示）。Vi也可以從洗脫一種完全不受凝膠微孔排阻的小分子溶質(zhì)（如重鉻酸鉀）的洗脫體積Ve計(jì)算，即 VeVoVi 層析柱層析柱 （a）自制簡(jiǎn)易層祈柱（1玻璃管；2.橡皮塞；3尼龍網(wǎng)）；（b）普通商品柱；（

54、c）雙底板層析柱（1.洗脫液進(jìn)出口；2.多孔底板；3柱床；4恒溫水進(jìn)口；5恒溫水出口；6可調(diào)節(jié)的塞子） 層析系統(tǒng)連接示意圖 1密封橡皮塞；2恒壓管，3，恒壓瓶；4，層析流出液，5可調(diào)蜾旋夾；6.自動(dòng)收集器； 7.核酸一蛋白質(zhì)檢測(cè)儀 BSBS100100自動(dòng)部分收集器安裝圈自動(dòng)部分收集器安裝圈1反全閥；2換管臂；3滴管；4，5換管臂固定螺絲；6.豎桿；7.豎桿囤定螓絲；8報(bào)警板；9.試管；10收集盤(pán)；11.時(shí)間選揮旋鈕；12.時(shí)間選擇固定螺釘；13自動(dòng)開(kāi)關(guān)；14、指示燈；15.電源開(kāi)關(guān)；16換向開(kāi)關(guān)（逆、順）；17手動(dòng)開(kāi)關(guān)六、六、 膜分離過(guò)程膜分離過(guò)程v1748年法國(guó)學(xué)者年法國(guó)學(xué)者Abbe No

55、llet首次提出了膜分離現(xiàn)首次提出了膜分離現(xiàn)象，經(jīng)過(guò)近二個(gè)世紀(jì)的摸索、研究，象，經(jīng)過(guò)近二個(gè)世紀(jì)的摸索、研究，20世紀(jì)世紀(jì)50年代年代膜分離技術(shù)才逐漸發(fā)展成為一門(mén)新興高技術(shù)邊緣學(xué)膜分離技術(shù)才逐漸發(fā)展成為一門(mén)新興高技術(shù)邊緣學(xué)科科。 v1963年第一個(gè)膜滲析器的誕生開(kāi)創(chuàng)了膜分離技術(shù)的年第一個(gè)膜滲析器的誕生開(kāi)創(chuàng)了膜分離技術(shù)的新紀(jì)元，二、三十年來(lái)得到了迅猛的發(fā)展，在各個(gè)新紀(jì)元，二、三十年來(lái)得到了迅猛的發(fā)展，在各個(gè)工業(yè)領(lǐng)域及科研中得到大規(guī)模應(yīng)用，出現(xiàn)了各種有工業(yè)領(lǐng)域及科研中得到大規(guī)模應(yīng)用，出現(xiàn)了各種有價(jià)值的微濾、超濾、納濾和反滲透等分離膜價(jià)值的微濾、超濾、納濾和反滲透等分離膜 。膜分離技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)膜分離技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)v適用適用范圍廣；范圍廣； v膜分離過(guò)程為物理過(guò)程，不需加入化學(xué)藥劑膜分離過(guò)程為物理過(guò)程，不需加入化學(xué)藥劑； v膜分離技術(shù)分離裝置簡(jiǎn)單，占地面積小，系膜分離技術(shù)分離裝置簡(jiǎn)單，占地面積小，系統(tǒng)集成容易統(tǒng)集成容易 ；v膜分離過(guò)程系統(tǒng)簡(jiǎn)單、操作容易，且易控制，膜分離過(guò)程系統(tǒng)簡(jiǎn)單、操作容易，且易控制，便于維修，有利于生產(chǎn)自動(dòng)化的推廣與普及。便于維修，有利于生產(chǎn)自動(dòng)化的推廣與普及。一、膜分離方法的分類(lèi)一、膜分離方法的分類(lèi)v透析透析v超濾超濾v反滲透反滲透v微濾微濾v電滲析電滲