微生物學(xué)設(shè)計性實驗--細(xì)菌耐受噬菌體突變率測定

1、12 細(xì)菌耐受噬菌體的突變是一種自發(fā)突細(xì)菌耐受噬菌體的突變是一種自發(fā)突變，它的發(fā)生與環(huán)境因子無關(guān)，是隨機(jī)的變，它的發(fā)生與環(huán)境因子無關(guān)，是隨機(jī)的非定向突變。非定向突變。本組設(shè)計性實驗題目： 測定銅綠假單胞菌耐受噬菌體的突變頻率測定銅綠假單胞菌耐受噬菌體的突變頻率3實驗選材依據(jù)和背景實驗選材依據(jù)和背景 銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌（P.Aeruginosa） 原稱綠膿桿菌。在自然界分布廣泛，為土壤中存在的最常見的細(xì)菌之一。各種水、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道等都有本菌存在。本菌存在的重要條件是潮濕的環(huán)境。4革蘭染色革蘭染色培養(yǎng)培養(yǎng)綠膿桿菌綠膿桿菌研究背景研究背景 本菌為條件致病菌，是醫(yī)院內(nèi)感染的主

2、要病原菌之一?；即x性疾病、血液病和惡性腫瘤的患者，及術(shù)后或某些治療后的患者易感本菌。 篩選出優(yōu)良菌種，以便更好地利用其資源進(jìn)行研究并造福人類。同時又對其外界環(huán)境有更大的適應(yīng)性，更好應(yīng)用于發(fā)展、生產(chǎn)的需要。為獲得其菌群，我們采用利用噬菌體將其敏感細(xì)菌殺死，從而選擇耐受細(xì)菌。 56研究方案：研究方案：為獲得其菌群，我們采用噬菌體將敏為獲得其菌群，我們采用噬菌體將敏感細(xì)菌殺死，將發(fā)生了耐受突變的細(xì)菌選擇出來，感細(xì)菌殺死，將發(fā)生了耐受突變的細(xì)菌選擇出來，并繁殖成為優(yōu)勢菌群。并繁殖成為優(yōu)勢菌群。研究意義：研究意義：培養(yǎng)出優(yōu)勢菌群，為以后臨床治療培養(yǎng)出優(yōu)勢菌群，為以后臨床治療及臨床用藥起輔助性作用。及臨

3、床用藥起輔助性作用。研究目的：研究目的：測定細(xì)菌自然情況下耐受噬菌體的測定細(xì)菌自然情況下耐受噬菌體的自發(fā)突變頻率。自發(fā)突變頻率。研究問題：研究問題：突變率測定突變率測定實驗材料實驗材料 1.毒性噬菌體及其相應(yīng)的敏感宿主菌。毒性噬菌體及其相應(yīng)的敏感宿主菌。 （建議使用人體正常菌群中的細(xì)菌及其噬菌體，如大腸埃希菌或銅綠假單胞菌及其相應(yīng)噬菌體。） 2.LB液體培養(yǎng)基及液體培養(yǎng)基及LB固體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基。 3.試管、培養(yǎng)皿、刻度定量吸管。試管、培養(yǎng)皿、刻度定量吸管。 4.酒精燈、接種環(huán)、顯微鏡、普通培養(yǎng)箱等酒精燈、接種環(huán)、顯微鏡、普通培養(yǎng)箱等。7LB是什么？ LB：Luria-Bertani培養(yǎng)基

4、，即溶菌肉湯。8實驗步驟實驗步驟9 1.準(zhǔn)備好銅綠假單胞菌的過夜培養(yǎng)物和相應(yīng)的噬菌體原液（噬菌體效價1010）銅綠假單胞菌的銅綠假單胞菌的倒置倒置過夜過夜培養(yǎng)物培養(yǎng)物噬噬菌菌體體原原液液實驗步驟 2.將菌液10倍連續(xù)稀釋，至少稀釋7管，取0.1ml涂布接種LB瓊脂平板，37度培養(yǎng)過夜。次日取菌落適宜于菌落計數(shù)的平板進(jìn)行CFU計數(shù)，計算出每毫升菌液中的CHU數(shù)： CFU數(shù)數(shù)=每個平皿中的每個平皿中的CFU數(shù)數(shù)10血清稀釋倍數(shù)血清稀釋倍數(shù)10 2.1110倍連續(xù)稀釋，至少倍連續(xù)稀釋，至少7管管CFU是什么？是什么？ CFU (Colony-Forming Units)：菌落形成單位,菌落形成單位。

5、 將稀釋后的一定量的菌液通過澆注或涂布的方法，讓其內(nèi)的微生物單細(xì)胞一一分散在瓊脂平板上，待培養(yǎng)后，每一活細(xì)胞就形成一個菌落。與常規(guī)利用顯微鏡對微生物數(shù)量進(jìn)行測量不同，主要是對可見（即多數(shù)情況下形成菌落）的細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行測量的單位。 單位：CFU/mL。指的是每毫升樣品中含有的細(xì)菌群落總數(shù)，也有用CFU/g即對應(yīng)固體培養(yǎng)基。12通俗的解釋 是指每毫升菌液中含有多少單細(xì)胞 。傳統(tǒng)上就叫“個”。但是，我們知道，一個菌落不一定是一個細(xì)菌所生成，也可能是由一簇細(xì)菌（一個細(xì)菌團(tuán)）所生成，這時候再叫“個”就不太準(zhǔn)確啦，準(zhǔn)確的叫法就是“菌落形成單位”，英文縮寫“CFU”。就像“公斤”和“千克”，只是叫法不同，數(shù)

6、量上沒有變化。 13實驗步驟實驗步驟3.進(jìn)入對數(shù)生長后期的大腸埃希菌或銅綠假單胞菌，菌數(shù)約為109CFU/ml左右。 23h后，可見菌液逐步變清，待完全變清（月4h之內(nèi)），將全部菌液均勻涂布到一個LB瓊脂平板上，置37下培養(yǎng)過夜。次日計數(shù)CFU。144.耐受噬菌體突變頻率的計算 第3步中獲得的CFU數(shù)為1ml菌液中的耐受菌數(shù)量，第2步中獲得的CFU數(shù)為1ml菌液中的總菌數(shù)。故： 耐受噬菌體突變頻率耐受噬菌體突變頻率 =15第第3步中獲得的步中獲得的CFU數(shù)數(shù)第第2步中獲得的步中獲得的CFU數(shù)數(shù)實驗可行性分析實驗可行性分析1. 標(biāo)本采集方便標(biāo)本采集方便 本菌在自然界分布廣泛，為土壤中存在的最常見

7、的細(xì)菌之一。各種水、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道等都有本菌存在。本菌存在的重要條件是潮濕的環(huán)境。 采自不同感染部位的標(biāo)本，包括血液、尿液、痰標(biāo)本、膿汁、穿刺液等。還包括來自醫(yī)院環(huán)境中的各種標(biāo)本如水、空氣、物體表面采樣等。162.分離培養(yǎng)容易本菌生長對營養(yǎng)要求不高。3. 生長特點明顯該菌在4不生長而在42可以生長。（可用以鑒別）4.采用CFU計數(shù)的科學(xué)性。5.實驗現(xiàn)象明顯，便于觀察。17預(yù)期結(jié)果預(yù)期結(jié)果18稀釋度稀釋度10-110-110-210-210-710-71 1 2 2 3 3平平均均1 12 2 3 3平平均均1 1 2 2 3 3平平均均CFUCFU數(shù)數(shù)/ /平板平板 每毫升每毫升的的CFUCFU數(shù)數(shù)預(yù)期結(jié)果 經(jīng)相關(guān)文獻(xiàn)預(yù)測： 銅綠假單胞菌耐噬菌體的突變機(jī)率在1.410-77.910-7之間。19討論討論 上述操作3，通常在4h內(nèi)菌液會完全變清。 此時細(xì)菌尚處于生長曲線的“遲緩期”（即適應(yīng)期），亦即尚未進(jìn)入分裂狀態(tài)。如果少數(shù)事先存在的耐受菌已進(jìn)入分裂期，這是測定結(jié)果會被放大，因而失其準(zhǔn)確性。20思考題(1)為什么溶化后的培養(yǎng)基要冷卻至45左右才能倒平板？(2)要使平板菌落計數(shù)準(zhǔn)確，需要掌握哪幾個關(guān)鍵？為什么？(3)試比較平板菌落計數(shù)法和顯微鏡下直接計數(shù)法的優(yōu)缺點。21參考文獻(xiàn) 微生物學(xué)通報 MICROBIOLOGY 國際標(biāo)準(zhǔn)刊號：ISSN 0253-265