03 20110碩士分生實(shí)驗(yàn)——回收連接 2011.11 (袁野)

1、基因工程的基本過程基因工程的基本過程2DNA片段片段的的分離純化分離純化3v制膠制膠v點(diǎn)樣點(diǎn)樣v電泳分離電泳分離v回收片段回收片段v沉淀沉淀DNA。操作步驟操作步驟: :4載體載體 DNA目的目的基因基因5實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理526取上清，用氯仿抽取上清，用氯仿抽提后，用乙醇沉淀，提后，用乙醇沉淀，70乙醇洗滌乙醇洗滌實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟加中性酚加中性酚547酚抽提法酚抽提法 切下含目的切下含目的DNA的膠塊。的膠塊。 加入酚，將膠塊沒過即可。加入酚，將膠塊沒過即可。 振蕩后低溫凍結(jié)，視溫度而定時(shí)間。振蕩后低溫凍結(jié)，視溫度而定時(shí)間。 30水浴融化，若體積小，可補(bǔ)加水浴融化，若體積小，可補(bǔ)加TE。 振蕩

2、器上振蕩。振蕩器上振蕩。 12,000 rpm離心離心5 min。 取上清取上清200 l l。8 用用200 200 l l的氯仿：異戊醇抽提（振蕩，離心的氯仿：異戊醇抽提（振蕩，離心12000 rpm12000 rpm，5 min5 min，取上清，取上清150ul150ul）。）。 加加15 15 l NaAc NaAc，300 300 l l無水乙醇沉淀無水乙醇沉淀DNADNA，冰凍，冰凍約約30 min30 min甚至過夜。甚至過夜。 12,000 rpm12,000 rpm離心離心10 min10 min，棄上清。，棄上清。 將將DNADNA溶于約溶于約30 30 l l TE T

3、E中。中。9注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)5510三、三、DNA片段回收及純化片段回收及純化vDEAE纖維素膜的電泳回收方法：纖維素膜的電泳回收方法：緊靠目的緊靠目的DNA片段前方切一裂隙，將一條片段前方切一裂隙，將一條DEAE纖維素膜插入纖維素膜插入裂隙中，繼續(xù)電泳直至條帶中所有的裂隙中，繼續(xù)電泳直至條帶中所有的DNA均收集均收集到膜上，然后從裂隙取出膜，用低離子強(qiáng)度的緩到膜上，然后從裂隙取出膜，用低離子強(qiáng)度的緩沖液洗掉污染物，最后在高離子強(qiáng)度的緩沖液中沖液洗掉污染物，最后在高離子強(qiáng)度的緩沖液中將將DNA洗脫下來。此方法簡單，可同時(shí)用于許多洗脫下來。此方法簡單，可同時(shí)用于許多片段，且獲得的片段，且獲得的D

4、NA極純，但僅適用于小片段極純，但僅適用于小片段DNA（15Kb的的DNA片段和單鏈片段和單鏈DNA不不適合，因難以洗脫下來。適合，因難以洗脫下來。11三、DNA片段回收及純化v透析袋電洗脫法：透析袋電洗脫法：將含有將含有DNADNA片段的凝膠切下置于充片段的凝膠切下置于充滿滿1xTAE1xTAE的透析袋中，使凝膠塊沉下，去掉大部分緩的透析袋中，使凝膠塊沉下，去掉大部分緩沖液，在凝膠上方夾緊透析袋，不留氣泡，將透析袋沖液，在凝膠上方夾緊透析袋，不留氣泡，將透析袋浸泡在浸泡在1xTAE1xTAE電泳槽中，電泳電泳槽中，電泳2-32-3小時(shí)，使小時(shí)，使DNADNA從凝膠從凝膠中電洗脫下來。此法可以

5、回收大小范圍較寬的中電洗脫下來。此法可以回收大小范圍較寬的DNADNA，但很不方便。但很不方便。v從低溶點(diǎn)瓊脂糖凝膠中回收從低溶點(diǎn)瓊脂糖凝膠中回收DNADNA：瓊脂糖的糖鏈上引瓊脂糖的糖鏈上引入了羥乙基，在入了羥乙基，在30300 0C C左右成膠，大約在左右成膠，大約在65650 0C C熔化，在熔化，在大多數(shù)雙鏈大多數(shù)雙鏈DNADNA熔點(diǎn)溫度以下。熔點(diǎn)溫度以下。v采用挖槽法采用挖槽法v酚凍法酚凍法v試劑盒過柱法試劑盒過柱法12DNA片段的連接反應(yīng)片段的連接反應(yīng)13 DNA 連接酶連接酶 ligase 催化催化DNA 5 DNA 5 磷酸基與磷酸基與 3 3 羥基之間形羥基之間形成磷酸二酯鍵

6、成磷酸二酯鍵(ATP)(ATP)5533OH POHPDNA連接酶連接酶DNA連接酶連接酶14v單位：單位：在在10 l的連接反應(yīng)體系中，的連接反應(yīng)體系中，3 g的的DNA-Hind III的分解物在的分解物在16下反應(yīng)下反應(yīng)30分鐘分鐘時(shí)，有時(shí)，有90%以上的以上的DNA片段被連接所需要的片段被連接所需要的酶量定義為酶量定義為1個(gè)活性單位（個(gè)活性單位（U）。而它的濃度）。而它的濃度為為350 U/l ，所以完全夠用。連接酶容易失，所以完全夠用。連接酶容易失活，注意低溫操作，最好在冰上?；睿⒁獾蜏夭僮?，最好在冰上。 15總體積總體積10 l 載體載體 0.10.2g目的基因：載體目的基因：載

7、體mol數(shù)數(shù)= 13：1H2O10buffer載體載體(3kb)目的基因目的基因(500bp)ligase總體積總體積10l .l 1l 0.1g .l 1l 16連接溫度連接溫度6217連接應(yīng)注意的事項(xiàng)：連接應(yīng)注意的事項(xiàng)： 目的基因與載體的目的基因與載體的mol數(shù)之比數(shù)之比 13 :1 連接酶的連接酶的buffer：溶解充分，分裝，防止：溶解充分，分裝，防止ATP降解降解 溫度：溫度：16最好？最好？ DNA的純度的純度18（三）外源基因與載體的連接（三）外源基因與載體的連接1. 1. 粘性末端連接粘性末端連接 方式：方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接同一限制酶切位點(diǎn)連接 (2)不同限制酶切位

8、點(diǎn)連接不同限制酶切位點(diǎn)連接 配伍末端連接配伍末端連接 非配伍末端連接非配伍末端連接19Bam H切割反應(yīng)切割反應(yīng) GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶連接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG載體載體DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重組體重組體GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG載體自連載體自連目的基因自連

9、目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接同一限制酶切位點(diǎn)連接20不同限制酶切位點(diǎn)（配伍末端）的連接不同限制酶切位點(diǎn)（配伍末端）的連接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l雙酶切雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切雙酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體 配伍末端的配伍末端的連接情況和同一連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連限制酶切位點(diǎn)連接相似。接相似。212.

10、 平端連接平端連接 適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端 粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端22目的基因目的基因載體載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體載體自連載體自連目的基因目的基因 自連自連233. 同聚物加尾連接同聚物加尾連接 在末端轉(zhuǎn)移酶在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase)的作的作用下，在用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。245 3 3 5 載體載體DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶或機(jī)械剪切限制酶限制酶5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dATP末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體254. 4. 人工接頭人工接頭(linker)連接：連接： 由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除