分子生物學(xué)基礎(chǔ)及基因檢測技術(shù)2016

1、分子生物學(xué)基礎(chǔ)及基因檢測技術(shù) 基因的基本概念 人體-組織-器官-細胞-細胞核-染色體-DNA-基因 基因檢測的基本原理和檢測技術(shù)簡介 基因芯片技術(shù)的優(yōu)缺點分析和未來發(fā)展主要內(nèi)容。206塊骨頭、650條肌肉、100多個關(guān)節(jié)3億個肺泡，體積為米的十分之一每晝夜跳動十萬次，每天排出9000升血液，血管長約9000多公里平均重1.2公斤，體積1.5立方分米，150億個單元，耗能功率10w，信息容量1015比特大數(shù)據(jù)神奇的人體人體九大系統(tǒng)（Nine human body system）器官（Organ）由幾種不同類型的組織聯(lián)合形成的，具有一定的形態(tài)特征和一定生理機能的結(jié)構(gòu)。組織（Tissue）由形態(tài)相似

2、，結(jié)構(gòu)、功能相同的細胞和細胞間質(zhì)聯(lián)合在一起形成的細胞群叫做組織（tissue）上皮組織結(jié)締組織肌肉組織神經(jīng)組織細胞-人體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位遺傳深度壓縮的聚合體-染色體 等位基因，在同一基因座上、但來源不同的同一基因 單倍型，是指同一染色體區(qū)域中相互連鎖的兩個不同的基因位點等位基因和單倍型生物主要的遺傳物質(zhì)-DNA基因是有遺傳效應(yīng)的DNA片段Gene遺傳中心法則（genetic central dogma）單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNPs）：單核苷酸多態(tài)性指在基因組中不同個體的DNA序列上的單個堿基差異。同一位置上的每個堿基類型叫做一個等

3、位位點。單核苷酸多態(tài)性（SNP）甲基化（ methylation）胚胎發(fā)育早期多處于高甲基化狀態(tài)甲基化（ methylation）人體四種組織：上皮組織、結(jié)締組織、肌肉組織和神經(jīng)組織細胞是人體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位染色體：由DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成基因是有遺傳效應(yīng)的DNA片段甲基化是調(diào)控基因表達的一種方式小結(jié)基因檢測的基本原理和檢測技術(shù)簡介 基于構(gòu)象的檢測方法 測序 實時熒光PCR 以雜交為基礎(chǔ)（基因芯片） 內(nèi)切酶技術(shù) 光譜和電子信號 其他方法，如磁性納米技術(shù)、飛行質(zhì)譜等m雙脫氧末端終止法 (Sanger 測序法) 1970s 同位素標(biāo)記，手工 1980s 熒光標(biāo)記，自動 1990s 毛細管電泳m合成

4、測序法（第二代測序） 焦磷酸測序（Pyrosequencing, Roche/454） 合成測序（Sequencing-By-Synthesis, Illumina/Solexa） 連接測序（Sequencing-By-Ligation, ABI/SOLiD）m單分子測序技術(shù)（第三代測序） Helicos Pacific Biosciences Oxford Nanopore 測序技術(shù)的發(fā)展歷史測序費用不斷降低Sanger法DNA測序的原理m雙氧核苷三磷酸（ddTBP）作為鏈終止劑m在DNA合成反應(yīng)混合物的4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP后， 鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止展

5、開競爭，反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈，其長度取決于從用以起始DNA合成的引物末端到出現(xiàn)過早鏈終止的位置之間的距離。m在4組獨立的酶反應(yīng)中分別采用4種不同的ddNTP，結(jié)果將產(chǎn)生4組寡核苷酸，它們將分別終止于模板鏈的每一個A、T、C和G的位置上。動畫演示1.測序的原理是DNA鏈終止法，這注定了一個反應(yīng)所測序列不可能太長，目前為1000個核苷酸左右。2.測序反應(yīng)費時費力3.測序準(zhǔn)確度不高4.結(jié)構(gòu)復(fù)雜的難于進行PCR反應(yīng)的片段不能測序。一代測序技術(shù)的缺點第二代測序技術(shù)m第二代測序技術(shù)循環(huán)陣列合成測序法 新一代測序技術(shù)（Next Generation Gequencing，NGS）m代表技術(shù)為 羅氏公司

6、(Roche)的454測序儀(Roche GS FLX sequencer) （2005） Illumina公司的Solexa基因組分析儀(Illumina Genome Analyzer) ABI的SOLiD測序儀(ABI SOLiD sequencer)（2007）動畫演示實時熒光定量PCRp 實時熒光定量實時熒光定量 PCR ( real-time fluorogenetic quantitative PCR , RQ-PCR) 是在 PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)p 它是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團 , 利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個 PCR進程 , 最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對

7、未知模板進行定量分析的方法實時熒光 PCR的分類：p 標(biāo)記方法：熒光標(biāo)記探針（Taqman）；雙鏈 DNA ( dsDNA) 結(jié)合染料SYBRgreenp 檢測基因表達：絕對定量；相對定量p 檢測SNP：ARMS-PCR；HARM擴增阻滯突變系統(tǒng)多聚鏈酶式擴增(ARMS-PCR)HRM進行SNP檢測原理DNA withheterocygoteSNPPCR+ . . .TCTTTTTCCCCCGAAAAAAGGGGGDenaturationreannealing+IntercalatingfluorescentdyeIncreasingtemperature高分辨率融解曲線高分辨率融解曲線(HR

8、M) 是一種分析是一種分析DNA融解曲線的新方法融解曲線的新方法.生物芯片將大量探針分子固定于支持物上后與帶熒光標(biāo)記的DNA或其他樣品分子（例如蛋白，因子或小分子）進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。生物芯片生物芯片被動式芯片被動式芯片主動式芯片主動式芯片基因（基因（DNA）芯片）芯片蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片微流控芯片：微流控芯片：樣品制備芯片、聚合酶鏈反應(yīng)樣品制備芯片、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）芯片、毛細管電泳芯片和色譜芯片）芯片、毛細管電泳芯片和色譜芯片 cDNA芯片芯片寡核苷酸芯片寡核苷酸芯片組織芯片組織芯片細胞芯片細胞芯片芯片實驗室：芯片實驗室：樣品制

9、備、試劑輸送、生化反應(yīng)、樣品制備、試劑輸送、生化反應(yīng)、結(jié)果檢測、信息處理和傳遞等一系列復(fù)雜工作結(jié)果檢測、信息處理和傳遞等一系列復(fù)雜工作 生物芯片分類將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段有規(guī)律地排列固定于支持物（如膜、硅片、陶瓷片及玻片）上，然后通過類似于Northern，Southern的方法與待測的標(biāo)記樣品按堿基配對原理進行雜交，再通過檢測系統(tǒng)對其進行掃描，并用相應(yīng)軟件對信號進行比較和檢測，得到所需的大量信息，進行基因的高通量、大規(guī)模、平行化、集約化的信息處理和功能研究?；蛐酒蛐酒瑑?yōu)勢 比較疾病狀態(tài)下不同時間點基因表達的差異 對復(fù)雜疾病的鑒定 藥物發(fā)現(xiàn)和藥物毒性測試 病原微生物分析 多位

10、點SNP分析 人類的疾病與遺傳基因密切相關(guān)，基因芯片可以對遺傳信息進行快速準(zhǔn)確的分析，用于分子診斷是臨床研究中一種新的、強有力的分子工具。 遺傳病相關(guān)基因的定位 腫瘤診斷 感染性疾病的診斷 耐藥菌株和藥敏檢測 疾病的診斷和治療DNA芯片微流控芯片（microfluidic device）微流控是指在一個微小系統(tǒng)中對微量液體進行控制操作。最為人們熟知的微流控技術(shù)的應(yīng)用是噴墨打印。 微流控芯片（第二代生物芯片）是微陣列芯片（第一代生物芯片）的延伸 微陣列芯片具有快速，高信息量的優(yōu)點，但至今廣泛使用上仍受限制，除價格因素外（只有建立在大樣本量的基礎(chǔ)上才能夠適當(dāng)降低成本），樣品制備的復(fù)雜繁瑣是妨礙其廣

11、泛使用的主要原因。 微流控芯片，把前置處理過程微縮在芯片上，目的是把實驗微型化，最終制成芯片實驗室（lab-on-a-chip）有了它，就可以告別步驟繁復(fù)，儀器雜亂的實驗室。微流控芯片（microfluidic device） 進一步提高探針陣列的集成度 。 提高檢測的靈敏度和特異性。 高自動化、方法趨于標(biāo)準(zhǔn)化、簡單化，成本降低。 高穩(wěn)定性。 研制新的應(yīng)用芯片。 研制芯片新檢測系統(tǒng)和分析軟件，以充分利用生物信息。 芯片技術(shù)將與其它技術(shù)結(jié)合使用，如基因芯片PCR、納米芯片 。 不同生物芯片間綜合應(yīng)用，如蛋白質(zhì)芯片與基因芯片間相互作用等，可用于了解蛋白質(zhì)與基因間相互作用的關(guān)系。 基因芯片技術(shù)未來方向 變性高效液相色譜分析熒光原位雜交一代測序等位基因特異性PCR二代測序熒光PCR轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增法單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR多重PCR巢式PCR限制性片段長度多態(tài)性基因芯片重組酶介導(dǎo)擴增法重組酶介導(dǎo)擴增法方法選擇的影響因素費用費用 目的用途目的用途 特異性特異性 標(biāo)本類型標(biāo)本類型方法選擇方法選擇 靈敏度靈敏度方法 PCR 測序 芯片背景針對科研需求:低拷貝基因的擴增滿足科研需求:全基因組未知序列測定滿足檢測需求:已知序列的再驗證特點高靈敏度廣泛用于臨檢標(biāo)準(zhǔn)化成熟靈敏度適中臨檢叫停需規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)化靈敏度適中