綜述細菌原生質體融合進展

1、綜述細菌原生質體融合進展 馮丹 10級 杏壇生工 202112401007摘要：原生質體融合技術由于可以在種間、屬間及科之間構建出新型菌株，已成為一項公認的快速組裝新物種，尤其是微生物新物種的基因工程技術。在細菌、酵母菌、真菌等遺傳育種方面被廣泛應用。文中綜述并舉例說明原生質體的制備與再生技術與影響因素、原生質體形成率及原生質體融合條件。介紹了細菌原生質體融合技術在遺傳育種中的應用，并展望了細菌原生質體融合技術的開展前景。關鍵詞：原生質體融合；原生質體制備；融合條件；融合子 細菌原生質體融合(bacterial protoplast fusion)是20世紀70年代開展起來的重要基因重組技術。

2、1976年FODORK等【l】采用聚乙二醇(PEG)、磷酸鈣誘導巨大芽孢桿菌(Bacillusmegateriutrb原生質體的融合，SCHAEFFER P等【2】翻報道了用PEG誘導枯草芽孢桿菌(Bsubtillis)的原生質體融合，這2項重要研究成果同時發(fā)表在美國科學院院報上，是細菌原生質體融合技術開展的里程碑。細菌原生質體融合育種技術不但可以改進菌種遺傳性狀、提高有用代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，還可以綜合不同菌株代謝特征，產(chǎn)生新的有用代謝產(chǎn)物，在工業(yè)生產(chǎn)和遺傳育種上展示出美好的應用前景。1細菌原生質體制備和再生11細菌原生質體制備制備細菌原生質體，是進行原生質體融合的前提和根底，不同細菌細胞壁組成各不

3、相同，所以制備原生質體最正確條件也存在著很大差異。在制備細菌原生質體時，曾采用過機械法脫壁，但原生質體制備數(shù)量有限而且容易使原生質體受到損傷，不利于再生。目前主要使用酶法脫壁，絕大多數(shù)細菌使用溶菌酶作為工具酶，但也有例外，YOSHINO S等舊制備糖丁醇乙酸梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)原生質體時，除使用溶菌酶外，還使用了N乙酰胞壁酸L丙氨酸酰胺酶；張莉滟等【3】制備長雙歧桿菌(Bifidobactefium longum)原生質體時，使用5mgL的變溶菌素(Mutanolysil進行菌體脫壁。而且使用的最適溶菌酶濃度為01mgml_2Om

4、gmL。12細菌原生質體再生酶解脫壁后的原生質體應該具有再生能力，這是原生質體融合育種的必要條件。細菌原生質體再生包括壁再生、功能修復、分裂和萌發(fā)這些相互聯(lián)系而又具有一定獨立性的生理過程。盡管原生質體具有生物活性，但它不是正常細胞，在普通培養(yǎng)基平板上不能正常的生長、繁殖。影響原生質體再生的因素主要有菌種本身特性、原生質體制備條件、再生條件和操作方式等，尤其是原生質體制備時酶濃度和酶解時間對原生質體再生的影響較大，酶濃度過大、酶解時間過長那么再生率降低。對數(shù)生長期細菌在原生質體再生過程中能明顯提高再生率。(1) 原生質體形成率P=經(jīng)酶處理后形成的原生質體數(shù)未經(jīng)酶處理的總菌落數(shù)*100%(2) 原

5、生質體再生率Rp =(能再生的原生質體數(shù)經(jīng)酶處理后形成的原生質體數(shù))*100%1.21以蘇云芽孢桿菌為例論述影響原生質體形成率與再生率的因素青霉素對原生質體形成率(P)的影響裹1 青霉素濃度對破璧效果的影響青霉素濃度u*ml-1 1*(%) 2*% 00.40.81.21.62.02.42846504742403630586765575048裹2 青霉素參加時間對破壁效果的影響參加時間h 1*(%) 2*% 12345600434650410056636759注：1、 時間從菌種接人培養(yǎng)基算起2、因青霉素的抑制，菌體未生長。由表1，表2的結果可知，青霉紊對Bt的原生質體形成有明顯的促進作用，且

6、參加時間以5 h時為好。此時剛剛進入對數(shù)期，細胞處于生長繁殖最旺盛的時期，大量細胞壁物質被合成，這時參加青霉素可在對數(shù)期后期獲得大量的細胞壁有缺陷但仍具活力的細胞，增加了苗體對溶菌酶的敏感性，可獲得較高的原生質體形成率。由結果可知，青霉素濃度以08 umL，參加時間以5 h時為最正確?！?】22 菌齡對原生質體形成率P)及再生率(Rp )的影響表3 菌齡對原生質體形成率P )及再生率( Rp)的影響菌齡1*P%1*(Rp)%2*(P)%2*(Rp)%對數(shù)期前期6h64107512對數(shù)期中后期10h60137215穩(wěn)定期13h222248表3顯示1 ，2 的對數(shù)期菌體比穩(wěn)定期的易于破壁，這是因為

7、穩(wěn)定期產(chǎn)生大量芽孢，其胞壁結構要比營養(yǎng)體結實，也較復雜，因此釋放原生質體較困難。我們選擇對數(shù)期中后期的菌體來制備原生質體，是因為這一時期的原生質體再生率高。1.22再生培養(yǎng)基是原生質體進行再生的最重要外界因素之一。細菌再生培養(yǎng)基中常補加2類物質，一類是水解酪蛋白、血清血蛋白、氨基酸和琥珀酸鈉等營養(yǎng)因子；另一類是滲透壓穩(wěn)定劑，包括KC1、NaC1、CaC12、MgCh等無機物質和蔗糖、山梨醇、甘露醇、肌醇和琥珀酸鈉等有機物質。OKAMOTO T等【5】研究乳鏈球菌(Streptococcus lactis)原生質體再生時發(fā)現(xiàn)Ca2+、M 的存在可以顯著提高原生質體的再生率，Ca、M 對維持原生質

8、體穩(wěn)定性具有一定作用。1.23細菌原生質體再生時的培養(yǎng)方式也會對再生率產(chǎn)生影響。固體培養(yǎng)法比液體培養(yǎng)法明顯有利于細菌原生質體再生，并且雙層平板法培養(yǎng)的再生率高于單層平板培養(yǎng)的再生率。再生培養(yǎng)基上的菌體密度也不能過高，否那么先長出的菌落會覆蓋后生長的菌落，一般認為原生質體數(shù)量級在10s時，再生平板上的原生質體才能呈現(xiàn)良好的別離狀態(tài)【6】1.24細菌原生質體制備時，還受其他因素的影響。如酶解pH值一般為75左右；酶解時間從20min-10h都有報道；酶解溫度多采用3537或42；同無機滲透壓穩(wěn)定劑相比，05molL蔗糖或05molL甘露醇作滲透壓穩(wěn)定劑制備率更高；另外，菌體預處理、鰲合劑的使用、培

9、養(yǎng)方式等都會影響細菌原生質體制備率。2.親本菌株的選擇進行細菌原生質體融合的最終目的就是要獲得遺傳穩(wěn)定的融合子，合理的親本菌株的選擇性遺傳標記是篩選融合子的前提，是細菌原生質體融合技術得以應用的關鍵。在細菌原生質體融合過程中，營養(yǎng)缺陷型標記【7】、抗藥性標記【8】、熒光染色標記【9】、滅活標記【10】、形態(tài)標記【11】等被經(jīng)常采用。3. 細菌原生質體融合技術細菌原生質體融合技術是親株細胞被酶解脫壁形成原生質體后，在高滲條件下混合并參加化學或物理助融條件，使雙親株原生質體相互凝集，通過質融合、核融合、基因組間的交換、重組，進而在適宜條件下再生出細菌細胞壁、獲得重組子的過程。31誘導融合的方式原生

10、質體融合研究早期曾用過離心方法，使原生質體緊密接觸或在冷的滲透穩(wěn)定液中凝集融合。目前除經(jīng)常使用的化學融合劑聚乙二醇【12】外，電場誘導與激光誘導方法【13】也被廣泛地應用。32原生質體融合及融合子的檢出參照梁平顏等【14】的方法進行,融合頻率F=融合平板菌落數(shù)-雙親存活菌落數(shù)雙親株原生質體總數(shù)*100%融合子的檢出：在原代融合平板上參加2種抗生素，可以保證生長的菌或者是形成雜合雙倍體或單倍重組體的真正融合，或者是形成異核體的暫時融合，因此，對這些菌在進行連續(xù)傳代10 次后，不回復的可以認為是真正的融合子。參考文獻：1FODOR K，ALFOLDI LFuon of protoplasts of

11、 Bacillus megateriumJProcNaAcad SciUSA，1976，73(6)：214721502SCHAEFFER P，CAMI B，HOTCHKISS R DFusion ofbacterial protoplastsJ】Proc Natl Acad Sci US 1976，73(6)：215 1-21553張莉滟，黃勇，張德純雙歧桿菌原生質體的制備與回復研究【J】微生物學雜志，2004，24(2)：24-26。4 10陳五嶺張芳琳 景建洲 孫連魁等滅活原生質體融合技術選育蘇云金桿菌新菌種5OKAMOTO FUJITA Y，IRIE R Protoplast forma

12、tion and regenerationofStreptococcuslactis cellsJ，AgricBoilChem，1983，47(2)：259-2636 8金玉娟，劉自镕，任建平芽孢桿菌和歐文氏菌的原生質體融合的研究 微生物學雜志，2002，22G)：10117DAI M H，ZIESMAN S，RATCLIFFE T，et a1Visualization ofprotoplastfusion and quantitation ofrecombination in fused protoplasts ofauxotrophic strains ofEscherichia coli

13、JMetab Eng，2005，7(1)：5-529黎永學，張德純，李代昆雙歧桿菌和釀酒酵母原生質體融合子篩選方法的探討J食品科學，2006，27(2)：848611CHEN OHMIYA K SHIMIZU S Intergeneric protoplast fusion bet-weellFusobacteum vanum an dEnterococcusfaecium forenhancingdehydrodivanillin degradationJAppl Environ Mierobiol，1 987，53(3)：54254812KAOKN，MICHAYLUKM RA method for High-frequency intergenericfusion ofplantprotoplastsJ，Planta，1974，