基因工程-第三章 基因工程的載體

1、Chapter 3 Gene Cloning Vector載體載體 （Vector） 基因克隆載體基因克隆載體(gene cloning vector): 能承載外源基因，能承載外源基因，將其帶入受體細胞得以穩(wěn)定維持的將其帶入受體細胞得以穩(wěn)定維持的DNA 分子。分子。載體的功能（載體的功能（Function of Vector）運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞。運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞。為外源基因提供復制能力或整合能力。為外源基因提供復制能力或整合能力。為外源基因的擴增或表達提供必要的條件。為外源基因的擴增或表達提供必要的條件。克隆載體的結(jié)構(gòu)特征克隆載體的結(jié)構(gòu)特征(Character of V

2、ector)(1) 針對受體細胞的針對受體細胞的可轉(zhuǎn)移性可轉(zhuǎn)移性；(2) 自主復制自主復制功能；功能；(3)顯著的顯著的篩選標記篩選標記；(4)特定的特定的多克隆位點多克隆位點；(5)安全性；安全性； 載體分類：載體分類：1 1）根據(jù)構(gòu)建克隆載體所用的）根據(jù)構(gòu)建克隆載體所用的DNA 來源分為：來源分為：質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體病毒或噬菌體載體病毒或噬菌體載體質(zhì)粒質(zhì)粒DNA與病毒或噬菌體與病毒或噬菌體DNA 組成的載體組成的載體質(zhì)粒質(zhì)粒DNA與染色體與染色體DNA 片段組成的載體等。片段組成的載體等。2）根據(jù)應用對象分：）根據(jù)應用對象分：原核生物克隆載體原核生物克隆載體植物克隆載體植物克隆載體動物克隆載

3、體動物克隆載體3）按照功能分：）按照功能分：克隆載體克隆載體: 克隆一個基因或克隆一個基因或DNA片斷片斷表達載體表達載體: 用于一個基因的蛋白表達用于一個基因的蛋白表達整合載體整合載體: 把一個基因插入到染色體組中把一個基因插入到染色體組中1 質(zhì)?？寺≥d體質(zhì)?？寺≥d體2 病毒（噬菌體）克隆載體病毒（噬菌體）克隆載體3 染色體定位整合克隆載體染色體定位整合克隆載體4 人工染色體克隆載體人工染色體克隆載體5 特殊用途克隆載體特殊用途克隆載體1 質(zhì)粒克隆載體質(zhì)?？寺≥d體1.1 與構(gòu)建克隆載體相關(guān)的質(zhì)粒性質(zhì)與構(gòu)建克隆載體相關(guān)的質(zhì)粒性質(zhì)1.2 質(zhì)粒載體必須具備的基本條件質(zhì)粒載體必須具備的基本條件1.3

4、 質(zhì)粒克隆載體的構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建質(zhì)粒載體以質(zhì)粒質(zhì)粒載體以質(zhì)粒DNA 分子為基礎構(gòu)建的克隆載體，含有質(zhì)分子為基礎構(gòu)建的克隆載體，含有質(zhì)粒的復制起始位點，能夠按質(zhì)粒復制的形式進行復制。粒的復制起始位點，能夠按質(zhì)粒復制的形式進行復制。 1.1.1 質(zhì)粒組成與構(gòu)型質(zhì)粒組成與構(gòu)型1.1.2 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA大小大小1.1.3 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的復制的復制1.1.4 質(zhì)粒的不親和型質(zhì)粒的不親和型1.1.5 質(zhì)粒遷移質(zhì)粒遷移1.1.6 顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)粒顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)粒1.1 與構(gòu)建克隆載體相關(guān)的質(zhì)粒性質(zhì)與構(gòu)建克隆載體相關(guān)的質(zhì)粒性質(zhì)1.1.1 質(zhì)粒組成與構(gòu)型質(zhì)粒組成與構(gòu)型p質(zhì)粒質(zhì)粒(plasmid)是一

5、種寓于宿主細胞中染色體外的裸露是一種寓于宿主細胞中染色體外的裸露DNA 分子，一個質(zhì)粒就是一個分子，一個質(zhì)粒就是一個DNA分子。分子。p數(shù)量：數(shù)量：每種質(zhì)粒在相應的宿主細胞內(nèi)保持相對穩(wěn)定的拷貝每種質(zhì)粒在相應的宿主細胞內(nèi)保持相對穩(wěn)定的拷貝數(shù)，少者幾個，多者上百個。數(shù)，少者幾個，多者上百個。p存在廣泛：存在廣泛：許多細菌、乳酸桿菌、藍藻、酵母等生物中均許多細菌、乳酸桿菌、藍藻、酵母等生物中均發(fā)現(xiàn)含有質(zhì)粒。發(fā)現(xiàn)含有質(zhì)粒。DNA構(gòu)型：構(gòu)型：p在宿主細胞內(nèi)，質(zhì)粒一般以在宿主細胞內(nèi)，質(zhì)粒一般以ccc-DNA 的形式存在。的形式存在。p體外在理化因子作用下，質(zhì)粒可能成為開環(huán)體外在理化因子作用下，質(zhì)?？赡艹蔀?/p>

6、開環(huán) DNA和線形和線形DNA 分子。分子。1.1.2 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA大小大小p質(zhì)粒質(zhì)粒DNA 分子小的不足分子小的不足2kb，大的可達，大的可達100 kb以上，多數(shù)以上，多數(shù)在在10kb 左右。左右。1.1.3 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的復制的復制p質(zhì)粒含有復制起始位點，能在宿主細胞內(nèi)進行自我復制。質(zhì)粒含有復制起始位點，能在宿主細胞內(nèi)進行自我復制。COP因子：因子：決定質(zhì)粒的拷貝數(shù)，指揮細胞合成阻遏物，決定質(zhì)粒的拷貝數(shù)，指揮細胞合成阻遏物，當質(zhì)粒復制到一定的拷貝時，阻遏物的量也積累到足以當質(zhì)粒復制到一定的拷貝時，阻遏物的量也積累到足以阻止質(zhì)粒的復制。阻止質(zhì)粒的復制。Rep基因：基因：指揮宿主細胞合成

7、一種調(diào)節(jié)蛋白，促進質(zhì)粒指揮宿主細胞合成一種調(diào)節(jié)蛋白，促進質(zhì)粒的復制。的復制。Par基因：基因：保證細胞分裂時質(zhì)粒正確分配到子細胞。保證細胞分裂時質(zhì)粒正確分配到子細胞?！皣谰o型嚴緊型” 質(zhì)粒（質(zhì)粒（Stringent Plasmid）：）：低拷貝數(shù)，低拷貝數(shù)，每個宿主細胞僅含每個宿主細胞僅含1-3份的拷貝。份的拷貝?！八沙谛退沙谛汀?質(zhì)粒（質(zhì)粒（Relaxed Plasmid） ：高拷貝數(shù)的高拷貝數(shù)的，每個宿主細胞可達到，每個宿主細胞可達到10-60份拷貝。份拷貝。1.1.4 質(zhì)粒的不親和性（質(zhì)粒的不親和性（plasmid incompatibility）p質(zhì)粒的不親和性，也稱不相容性質(zhì)粒的不親

8、和性，也稱不相容性: 在沒有選擇壓在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能在同一宿主細胞中穩(wěn)定地共存。能在同一宿主細胞中穩(wěn)定地共存。大腸桿菌質(zhì)?，F(xiàn)已鑒別出大腸桿菌質(zhì)?，F(xiàn)已鑒別出25個以上的不親和群。個以上的不親和群。它們之間是相容的，而同一個不親和群內(nèi)的質(zhì)粒它們之間是相容的，而同一個不親和群內(nèi)的質(zhì)粒是不相容的。是不相容的。1.1.5 質(zhì)粒遷移質(zhì)粒遷移(Plasmid Mobilization)v通過接合作用通過接合作用,質(zhì)粒可以轉(zhuǎn)移到新的宿主細胞中。質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)移到新的宿主細胞中。Tra基因：基因：指令宿主細胞合成菌毛和細胞表面物，促使宿

9、指令宿主細胞合成菌毛和細胞表面物，促使宿主細胞與受體細胞表面結(jié)合，實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移。主細胞與受體細胞表面結(jié)合，實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移。分為兩種：分為兩種： 接合型質(zhì)粒接合型質(zhì)粒(Conjugative Plasmid)：含有自我復制基因、：含有自我復制基因、接合轉(zhuǎn)移接合轉(zhuǎn)移Tra基因基因，拷貝數(shù)少，分子大。，拷貝數(shù)少，分子大。非接合型質(zhì)粒非接合型質(zhì)粒(non-Conjugative Plasmid)：能夠自我復制，：能夠自我復制，但不含但不含Tra基因，這類質(zhì)粒不能從一個細胞自我轉(zhuǎn)移到另基因，這類質(zhì)粒不能從一個細胞自我轉(zhuǎn)移到另一個細胞；較安全，且拷貝數(shù)多，分子小，適于構(gòu)建克隆一個細胞；較安全，且

10、拷貝數(shù)多，分子小，適于構(gòu)建克隆載體。載體。1.1.6 顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)粒顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)粒v顯性質(zhì)粒：顯性質(zhì)粒：也稱表達型質(zhì)粒，質(zhì)粒攜帶一些除與自身復制也稱表達型質(zhì)粒，質(zhì)粒攜帶一些除與自身復制和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因外，還有別的基因使得宿主細胞出現(xiàn)新和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因外，還有別的基因使得宿主細胞出現(xiàn)新性狀。性狀。v隱蔽質(zhì)粒：隱蔽質(zhì)粒：宿主細胞含有某種質(zhì)粒，但無異樣性狀表現(xiàn)。宿主細胞含有某種質(zhì)粒，但無異樣性狀表現(xiàn)。顯性質(zhì)粒的相關(guān)基因：顯性質(zhì)粒的相關(guān)基因：抗性基因：抗性基因：抗菌素抗性基因，抗菌素抗性基因，Apr，Tcr，產(chǎn)毒素基因：產(chǎn)毒素基因：大腸桿菌素基因（大腸桿菌素基因（Col-質(zhì)粒）。質(zhì)粒）。降解基

11、因：降解基因：降解重金屬、有機物和農(nóng)藥等。降解重金屬、有機物和農(nóng)藥等。致瘤基因：致瘤基因：誘導某些組織形成腫瘤，如誘導某些組織形成腫瘤，如Ti質(zhì)粒，質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒。質(zhì)粒。1 質(zhì)粒克隆載體質(zhì)?？寺≥d體1.1 與構(gòu)建克隆載體相關(guān)的質(zhì)粒性質(zhì)與構(gòu)建克隆載體相關(guān)的質(zhì)粒性質(zhì)1.2 質(zhì)粒載體必須具備的基本條件質(zhì)粒載體必須具備的基本條件1.3 質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建(1) 能自主復制，即本身是復制子能自主復制，即本身是復制子(2) 具有多種限制酶的單一切割位點，即多克隆位點具有多種限制酶的單一切割位點，即多克隆位點，并在此位點中插入外源基因片段，不影響本身，并在此位點中插入外源基因片段，不影響本

12、身的復制功能；的復制功能； (3) 在基因組中有在基因組中有1-2個篩選標記，為寄主細胞提供易個篩選標記，為寄主細胞提供易于檢測的表型特征。于檢測的表型特征。 (4) 分子量要小，多拷貝，易于操作。；分子量要小，多拷貝，易于操作。；(5)構(gòu)建不同用途的質(zhì)粒載體時，可以根據(jù)特殊需要構(gòu)建不同用途的質(zhì)粒載體時，可以根據(jù)特殊需要組裝各種元件（小組裝各種元件（小DNA片段）。片段）。1.2 質(zhì)粒載體必須具備的基本條件質(zhì)粒載體必須具備的基本條件天然質(zhì)粒：天然質(zhì)粒：沒有經(jīng)過以基因克隆為目標的體外修飾沒有經(jīng)過以基因克隆為目標的體外修飾改造的質(zhì)粒。改造的質(zhì)粒。 天然質(zhì)天然質(zhì) 粒粒相對分子質(zhì)量相對分子質(zhì)量拷貝數(shù)拷

13、貝數(shù)單一酶切位點單一酶切位點選擇性標記選擇性標記復制類型復制類型pSC1015.81069.09 kb13EcoR Itetr嚴緊嚴緊ColE14.210620EcoR I大腸桿菌素大腸桿菌素松弛松弛RSF21247.410610EcoR I (BamH I)ampr松弛松弛局限性：局限性：分子量高、拷貝數(shù)低、合適的單一酶切位分子量高、拷貝數(shù)低、合適的單一酶切位點少、選擇標記不合適點少、選擇標記不合適如何識別載體上的各種元件及其功能：如何識別載體上的各種元件及其功能：1.3.1 大腸桿菌質(zhì)粒載體大腸桿菌質(zhì)粒載體pBR322及其衍生載體的構(gòu)及其衍生載體的構(gòu)1.3.3 農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體的構(gòu)

14、建質(zhì)粒載體的構(gòu)建1.3.5 酵母酵母2um質(zhì)?？寺≥d體質(zhì)?？寺≥d體1.3 質(zhì)粒克隆載體的構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建 （1）pBR322： p-plsmid，,B R分別為該質(zhì)粒的兩位主要構(gòu)建者分別為該質(zhì)粒的兩位主要構(gòu)建者F.Bolivar和和R.L.Rodriguez姓氏的頭一個字母，姓氏的頭一個字母，“322”為實驗編號。為實驗編號。,含有含有雙抗基因（雙抗基因（Apr，Tcr）和）和Col E1復制起始子。復制起始子。 優(yōu)點：優(yōu)點： 具有較小的分子量，具有較小的分子量，4363bp。 具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。含有含有24種單一

15、的限制性內(nèi)切酶識別位點，且種單一的限制性內(nèi)切酶識別位點，且BamHI、SalI和和PstI等幾個酶切位點分別處于四環(huán)素和氨芐青霉素等幾個酶切位點分別處于四環(huán)素和氨芐青霉素抗性基因上，當將外源抗性基因上，當將外源DNA片段插入到這些位點時，可片段插入到這些位點時，可用抗生素基因的失活來篩選重組體。用抗生素基因的失活來篩選重組體。 具較高的拷貝數(shù)，具較高的拷貝數(shù)，經(jīng)過擴增之后，每個細胞中可累積經(jīng)過擴增之后，每個細胞中可累積1000-3000個拷貝。個拷貝。pBR322質(zhì)粒載體的篩選質(zhì)粒載體的篩選插入失活篩選法插入失活篩選法(2) 衍生衍生pUC質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體由美國加利福尼亞大學（由美國加利福尼亞

16、大學（University of California）J.Messing和和J.Vieria于于1987年構(gòu)建。年構(gòu)建。包括如下四個組成部分：包括如下四個組成部分：i) 來自來自pBR322質(zhì)粒的質(zhì)粒的復制起點復制起點(ori)；ii) 氨芐青霉素抗性基因氨芐青霉素抗性基因(ampr) ； iii) 大腸桿菌大腸桿菌-半乳糖酶基因半乳糖酶基因(lacZ)的啟動子及其編碼的啟動子及其編碼-肽鏈的肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)特稱為序列，此結(jié)構(gòu)特稱為lacZ基因基因；iiii) 位于位于lacZ基因中的靠近基因中的靠近5-端的一段端的一段多克隆位點（多克隆位點（multiple cloning sit

17、es, MCS）區(qū)段。區(qū)段。pUC 18-19多克隆位點表達性載體（Expression Vector）： 根據(jù)宿主細胞的不同，表達蛋白質(zhì)的載體大致可分為：原根據(jù)宿主細胞的不同，表達蛋白質(zhì)的載體大致可分為：原核生物表達載體和真核生物表達載體。由于真核生物種核生物表達載體和真核生物表達載體。由于真核生物種類繁多，又分為酵母表達載體，植物表達載體，昆蟲類類繁多，又分為酵母表達載體，植物表達載體，昆蟲類表達載體和哺乳類表達載體等等。表達載體和哺乳類表達載體等等。原核生物表達性載體（Prokaryotic Expression Vector）：pGEX Vector (GST tag Expresso

18、in Vector):pGEX Vector MCS region：pET Vector (S tag Expressoin Vector):pET Vector MCS region：真核核生物表達性載體（Eukaryotic Expression Vector）：pcDNA3.1 mammalian Expression Vector:pcDNA3.1 Vector MCS region：pEGFP-C1 mammalian Expression Vector:GFP and REP Expression Vector:pMSC puro Retroviral Vector Map:Ret

19、roviral Vector:1.3.1 大腸桿菌質(zhì)粒載體大腸桿菌質(zhì)粒載體pBR322及其衍生載體的構(gòu)建及其衍生載體的構(gòu)建1.3.3 農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體的構(gòu)建質(zhì)粒載體的構(gòu)建1.3.5 酵母酵母2um質(zhì)?？寺≥d體質(zhì)粒克隆載體1.3 質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建質(zhì)粒克隆載體的構(gòu)建（Construction of Plasmid Vector）:p致癌農(nóng)桿菌致癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)含一種內(nèi)含一種內(nèi)源質(zhì)粒，當農(nóng)桿菌同植物接觸時，這種質(zhì)粒會引源質(zhì)粒，當農(nóng)桿菌同植物接觸時，這種質(zhì)粒會引發(fā)植物發(fā)植物在創(chuàng)傷部位組織增生而形成植物腫瘤在創(chuàng)傷部位組織增生而形成植物腫瘤 (冠癭冠

20、癭瘤瘤)，稱此質(zhì)粒為，稱此質(zhì)粒為Ti 質(zhì)粒質(zhì)粒(tumor inducing plasmid)。1.3.3 農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體的構(gòu)建質(zhì)粒載體的構(gòu)建上： 電鏡下的根癌農(nóng)桿菌下： 冠癭瘤Ti質(zhì)粒是雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒是雙鏈環(huán)狀DNA 分子分子，約，約200kb，分四個區(qū)：，分四個區(qū)：1） T-DNA(transfer DNA)： 25kb，進入植物細胞區(qū)域，進入植物細胞區(qū)域含有多種基因，其表達產(chǎn)物含有多種基因，其表達產(chǎn)物破壞植物細胞內(nèi)源激素的平破壞植物細胞內(nèi)源激素的平衡，干擾細胞分裂從而引發(fā)衡，干擾細胞分裂從而引發(fā)植物腫瘤。植物腫瘤。p T-DNA 左右兩邊界左右兩邊界(LB，RB)各有一個各有一個

21、25bp長的正長的正向重復序列向重復序列(LTS 和和RTS)，對，對T-DNA 的轉(zhuǎn)移和整的轉(zhuǎn)移和整合是不可缺少的。合是不可缺少的。2） Vir區(qū)：區(qū)：位于位于T-DNA 上游的一組基因，表達產(chǎn)物能上游的一組基因，表達產(chǎn)物能激活激活T-DNA 向植物細胞轉(zhuǎn)移，引發(fā)植物腫瘤，顯示細向植物細胞轉(zhuǎn)移，引發(fā)植物腫瘤，顯示細菌的致病性。菌的致病性。3) Con區(qū)：區(qū)：含有含有tra基因，農(nóng)桿菌之間轉(zhuǎn)移接合基因，農(nóng)桿菌之間轉(zhuǎn)移接合4) Oir區(qū)：區(qū)：調(diào)控質(zhì)粒的自主復制調(diào)控質(zhì)粒的自主復制 與大腸桿菌的質(zhì)粒載體不同，構(gòu)建的與大腸桿菌的質(zhì)粒載體不同，構(gòu)建的Ti質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體不真正用于細菌，而是用于植物細胞，

22、農(nóng)桿菌只不真正用于細菌，而是用于植物細胞，農(nóng)桿菌只起著中間介導的作用起著中間介導的作用。構(gòu)建共整合質(zhì)粒載體和構(gòu)建共整合質(zhì)粒載體和雙元載體雙元載體LBRBT-DNA外源基因植物細胞篩選標記 Kmr大腸桿菌-農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒大腸桿菌篩選標記農(nóng)桿菌篩選標記農(nóng)桿菌ori大腸桿菌ori將外源基因克隆將外源基因克隆在大腸桿菌在大腸桿菌-農(nóng)桿農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒的菌穿梭質(zhì)粒的T-DNA區(qū)內(nèi)；區(qū)內(nèi)；雙元整合載體雙元整合載體1.3.1 大腸桿菌質(zhì)粒載體大腸桿菌質(zhì)粒載體pBR322及其衍生載體的構(gòu)建及其衍生載體的構(gòu)建1.3.3 農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體的構(gòu)建質(zhì)粒載體的構(gòu)建1.3.5 酵母酵母2um質(zhì)粒克隆載體質(zhì)?？寺≥d體

23、1.3 質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建質(zhì)粒克隆載體的構(gòu)建（Construction of Plasmid Vector）1.3.5 酵母酵母2m 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體酵母是一種最簡單的單細胞異養(yǎng)真核生物，可以像細菌一酵母是一種最簡單的單細胞異養(yǎng)真核生物，可以像細菌一樣進行基因操作，能夠在廉價的培養(yǎng)基上生長，可高密度樣進行基因操作，能夠在廉價的培養(yǎng)基上生長，可高密度發(fā)酵。發(fā)酵。酵母又具有真核生物的特性，具有對外源基因翻譯后進行酵母又具有真核生物的特性，具有對外源基因翻譯后進行蛋白質(zhì)加工和修飾的功能。蛋白質(zhì)加工和修飾的功能。幾乎所有的釀酒酵母菌中都存在幾乎所有的釀酒酵母菌中都存在2m質(zhì)粒。質(zhì)粒。利用利用2m質(zhì)粒和

24、其染色體組分質(zhì)粒和其染色體組分與細菌質(zhì)粒與細菌質(zhì)粒pBR322構(gòu)建構(gòu)建酵母質(zhì)粒酵母質(zhì)粒載體載體，能分別在細菌和酵母菌中，能分別在細菌和酵母菌中進行復制，又稱為進行復制，又稱為穿梭載體穿梭載體。 2m復制起點復制起點YEP載體（游離型）載體（游離型） 質(zhì)?？寺≥d體的用途質(zhì)?？寺≥d體的用途 用于保存和擴增片段小于用于保存和擴增片段小于2kb2kb的目的基因。的目的基因。構(gòu)建基因組文庫和構(gòu)建基因組文庫和cDNAcDNA文庫。文庫?？捎糜谀康幕虻臏y序。可用于目的基因的測序。作為核酸雜交時探針的來源。作為核酸雜交時探針的來源?；仡櫥仡檖lasmid質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體必須必須具備的基本條件具備的基本條件p

25、UC18/19pUC18/19質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體pBR322pBR322質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體TiTi質(zhì)粒質(zhì)粒pUC18/19質(zhì)粒載體的組成特點、結(jié)構(gòu)圖。質(zhì)粒載體的組成特點、結(jié)構(gòu)圖。 插入失活插入失活 -互補互補T-DNA1 質(zhì)?？寺≥d體質(zhì)粒克隆載體2 病毒（噬菌體）克隆載體病毒（噬菌體）克隆載體3 染色體定位整合克隆載體染色體定位整合克隆載體4 人工染色體克隆載體人工染色體克隆載體5 特殊用途克隆載體特殊用途克隆載體病毒由病毒由DNA(或或RNA)和外殼蛋白組成，經(jīng)包裝后成為和外殼蛋白組成，經(jīng)包裝后成為病毒顆粒。病毒顆粒。通過感染，病毒顆粒進入宿主細胞，利用宿主細胞的通過感染，病毒顆粒進入宿主細胞，

26、利用宿主細胞的合成系統(tǒng)進行合成系統(tǒng)進行DNA(或或RNA)復制和殼蛋白的合成，實復制和殼蛋白的合成，實現(xiàn)病毒顆粒的增殖。現(xiàn)病毒顆粒的增殖。2 病毒（噬菌體）克隆載體病毒（噬菌體）克隆載體噬菌體克隆載體噬菌體克隆載體M13克隆載體克隆載體Cosmid 克隆載體克隆載體CaMV克隆載體克隆載體TMV克隆載體克隆載體SV40克隆載體克隆載體反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體腺病毒克隆載體腺病毒克隆載體痘苗病毒克隆載體痘苗病毒克隆載體桿狀病毒表達克隆載體桿狀病毒表達克隆載體 2.1.1 噬菌體性質(zhì)噬菌體性質(zhì) 噬菌體由噬菌體由DNA和外殼蛋白組成，分為頭部和尾部。和外殼蛋白組成，分為頭部和尾部。2.1

27、 噬菌體克隆載體噬菌體克隆載體（1） DNA ：DNA 在在噬菌體中以線狀雙鏈噬菌體中以線狀雙鏈DNA 分子分子存在，全長存在，全長48 502bp。 COS 位點位點(cohesive end site):左右兩端各有左右兩端各有12 個核苷酸個核苷酸組成的組成的5凸出黏性末端，而且兩者的核苷酸序列互補。凸出黏性末端，而且兩者的核苷酸序列互補。（2）基因組基因組DNA的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)v含含50個以上的基因，各司其職。個以上的基因，各司其職。A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2 cI cro cII O P Q S R att int xis gam red c

28、III N COS COSCOSCOS 頭部基因頭部基因 尾部基因尾部基因 功能不明區(qū)功能不明區(qū)溶源化溶源化 重組重組 早期控制早期控制 阻遏阻遏 DNADNA合成合成 晚期晚期 溶菌溶菌約有約有20kb生長非必須區(qū)段生長非必須區(qū)段cI cI基因：溶源過程控制基因。基因：溶源過程控制基因。噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)（1）噬菌體是一種噬菌體是一種溫和噬菌體溫和噬菌體，對大腸桿菌具有很高的，對大腸桿菌具有很高的感染能力，以溶源狀態(tài)可保存在大腸桿菌中。感染能力，以溶源狀態(tài)可保存在大腸桿菌中。（2）能）能承載比較大外源承載比較大外源DNA：DNA 上約有上約有20kb 的區(qū)域?qū)Φ膮^(qū)域?qū)κ删w

29、的生長不是絕對需噬菌體的生長不是絕對需要的，可以缺失或被外源要的，可以缺失或被外源DNA 片段取代。片段取代。( 3) DNA上有上有56種限制酶識別位點（見附錄種限制酶識別位點（見附錄3-1），），便于便于多種外源多種外源DNA片段的克隆。片段的克隆。2.1.2 選用選用噬菌體作為克隆載體的依據(jù)噬菌體作為克隆載體的依據(jù) 限制性內(nèi)切核酸酶切位點的改造限制性內(nèi)切核酸酶切位點的改造點突變或甲基化酶處理等方法使必需區(qū)內(nèi)的酶的識別序點突變或甲基化酶處理等方法使必需區(qū)內(nèi)的酶的識別序列失效，列失效，避免外源避免外源DNA 片段插入必需區(qū)片段插入必需區(qū)；2.1.3 構(gòu)建構(gòu)建噬菌體克隆載體噬菌體克隆載體 在非

30、必需區(qū)插入選擇標記基因；在非必需區(qū)插入選擇標記基因； 建立重組建立重組DNA分子體外包裝系統(tǒng)。分子體外包裝系統(tǒng)。v重組重組DNA分子經(jīng)過體外包裝稱噬菌體顆粒后才分子經(jīng)過體外包裝稱噬菌體顆粒后才能有效轉(zhuǎn)導受體細胞。能有效轉(zhuǎn)導受體細胞。置換型載體置換型載體可被外源可被外源DNA置換的置換的噬菌體非必需區(qū)兩側(cè)有一噬菌體非必需區(qū)兩側(cè)有一對限制性酶切位點的載體，稱為置換型載體。對限制性酶切位點的載體，稱為置換型載體。 2.1.4 噬菌體載體的類型噬菌體載體的類型p只有只有DNA的長度的長度大于大于野生型野生型噬菌體噬菌體DNA長度的長度的75而不超過其而不超過其105時，才能被包裝成噬菌體顆時，才能被包

31、裝成噬菌體顆粒，當粒，當DNA的長度短于野生型的的長度短于野生型的75%或超過或超過105%時，噬菌體的活性就急劇下降，時，噬菌體的活性就急劇下降，因此要求因此要求載體載體DNA和外源和外源DNA長度之和在長度之和在3953kb之間。之間。 插入型載體：插入型載體：有一類只含一個限制性位點可供插入外源有一類只含一個限制性位點可供插入外源DNA的載體的載體，這類，這類噬菌體載體噬菌體載體稱插入型載體稱插入型載體。僅保留了僅保留了EcoR的單一切點的單一切點可插入長度為可插入長度為10kb的外源的外源DNA.切點又位于報告基因上，故在切開切點又位于報告基因上，故在切開DNA并插入外源基并插入外源基

32、因后，報告基因失活，即可依此進行重組體的篩選因后，報告基因失活，即可依此進行重組體的篩選主要用于建立主要用于建立cDNA文庫。文庫。也用于克隆外源目的基因。也用于克隆外源目的基因。2.1.5 噬菌體克隆載體的應用噬菌體克隆載體的應用2) 組裝組裝 1)連接連接3) 侵染侵染置換載體置換載體2 病毒（噬菌體）克隆載體病毒（噬菌體）克隆載體噬菌體克隆載體噬菌體克隆載體單鏈單鏈DNA噬菌體載體噬菌體載體M13 Cosmid 克隆載體克隆載體噬菌質(zhì)粒載體噬菌質(zhì)粒載體CaMV克隆載體克隆載體TMV克隆載體克隆載體SV40克隆載體克隆載體反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體腺病毒克隆載體腺病毒克隆載體痘苗

33、病毒克隆載體痘苗病毒克隆載體桿狀病毒表達克隆載體桿狀病毒表達克隆載體2.2 單鏈單鏈DNA噬菌體載體噬菌體載體M13、f1、fd。2.2.1 優(yōu)越性：優(yōu)越性：1) 單鏈單鏈DNA噬菌體的復制，是以雙鏈環(huán)形的噬菌體的復制，是以雙鏈環(huán)形的DNA為媒介的為媒介的，這種復制形式，這種復制形式 的的 DNA簡稱簡稱RFDNA；2) 不論是不論是RFDNA還是還是ssDNA都能感染大腸桿菌；都能感染大腸桿菌；3) 單鏈單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受其噬菌體顆粒的大小，是受其DNA制約，不存在制約，不存在包裝限制問題；包裝限制問題；4) 容易測定外源容易測定外源DNA片斷的插入取向；片斷的插入取向；5)

34、可產(chǎn)生含外源片斷的單鏈可產(chǎn)生含外源片斷的單鏈DNA分子。分子。 2.2.2 M13噬菌體的特點噬菌體的特點p外型絲狀，環(huán)狀單鏈外型絲狀，環(huán)狀單鏈DNA (6407bp)，pM13至少至少11個編碼基因，個編碼基因，pM13 DNA不插入到宿主基因組中不插入到宿主基因組中, 不裂解細不裂解細菌，但抑制宿主生長。菌，但抑制宿主生長。+- -+- -+- -+- -+- -+- -單鏈結(jié)合蛋白單鏈結(jié)合蛋白RF型型DNA復制約復制約200copy+以以- -鏈鏈DNA為為模板合成模板合成+鏈鏈DNA滾環(huán)方式復制滾環(huán)方式復制M13的侵染循環(huán)的侵染循環(huán)2.2.3 構(gòu)建構(gòu)建M13噬菌體載體噬菌體載體 插入選

35、擇標記基因插入選擇標記基因在選擇標記基因區(qū)內(nèi)組裝合適的多克隆位點。在選擇標記基因區(qū)內(nèi)組裝合適的多克隆位點。M13M13克隆載體克隆載體分子結(jié)構(gòu)圖分子結(jié)構(gòu)圖v適合用于制備克隆基因的單鏈適合用于制備克隆基因的單鏈DNA。v用于制備測序用單鏈用于制備測序用單鏈DNA模板、特異的單鏈模板、特異的單鏈DNA探針，定位誘變等。探針，定位誘變等。2 病毒（噬菌體）克隆載體病毒（噬菌體）克隆載體噬菌體克隆載體噬菌體克隆載體M13克隆載體克隆載體Cosmid 克隆載體克隆載體噬菌質(zhì)粒載體噬菌質(zhì)粒載體CaMV克隆載體克隆載體TMV克隆載體克隆載體SV40克隆載體克隆載體反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體腺病毒克

36、隆載體腺病毒克隆載體痘苗病毒克隆載體痘苗病毒克隆載體桿狀病毒表達克隆載體桿狀病毒表達克隆載體cosmidcosmid載體：載體：也稱粘粒、柯斯載體。這是一類用于也稱粘粒、柯斯載體。這是一類用于克隆大片段克隆大片段DNADNA的載體，它是由的載體，它是由噬菌體的噬菌體的cos cos 末端末端及質(zhì)粒重組而成的載體。及質(zhì)粒重組而成的載體。該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組進行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNADNA導入受體細胞。導入受體細胞。但它不會產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質(zhì)粒但它不會產(chǎn)生子代噬

37、菌體，而是以質(zhì)粒DNADNA的形式的形式存在于細胞內(nèi)。存在于細胞內(nèi)。2.3 Cosmid(考考/柯斯柯斯)克隆載體克隆載體 Cosmid(考考/柯斯柯斯)克隆載體克隆載體特征特征:1) 具有質(zhì)粒的性質(zhì)具有質(zhì)粒的性質(zhì)，含有大腸桿菌內(nèi)源質(zhì)粒復制起始，含有大腸桿菌內(nèi)源質(zhì)粒復制起始位點、克隆位點和選擇標記基因等基本構(gòu)件，可在細位點、克隆位點和選擇標記基因等基本構(gòu)件，可在細菌中保存和大量復制。菌中保存和大量復制。2)含有含有Cosmid 位點位點，可進行體外包裝；，可進行體外包裝；3) Cosmid載體一般在載體一般在10kb 以下，能以下，能承載比較大的外承載比較大的外源源DNA 片段片段。2.4 噬

38、菌質(zhì)粒載體，簡稱噬菌粒噬菌質(zhì)粒載體，簡稱噬菌粒1）組成：噬菌粒）組成：噬菌粒是由單鏈噬菌體和質(zhì)粒載體是由單鏈噬菌體和質(zhì)粒載體DNA融合融合而成。而成。質(zhì)粒質(zhì)粒ColE1的的ori抗生素抗性標記抗生素抗性標記M13或或f1噬菌體復制起點噬菌體復制起點如如pUC118噬菌粒載體就是將野生型噬菌粒載體就是將野生型M13的基因間隔區(qū)的基因間隔區(qū)插入質(zhì)粒載體插入質(zhì)粒載體pUC18構(gòu)建而成的。構(gòu)建而成的。2）噬菌粒優(yōu)點：）噬菌粒優(yōu)點：載體本身分子小，約為載體本身分子小，約為3000bp，便于分離和操作；，便于分離和操作；克隆外源克隆外源DNA的容量為的容量為10kb，而，而M13噬菌體載體是克噬菌體載體是

39、克隆隆300400bp；兩種復制方式兩種復制方式 噬菌粒在寄主細胞內(nèi)以質(zhì)粒形式存在，復制產(chǎn)生雙鏈噬菌粒在寄主細胞內(nèi)以質(zhì)粒形式存在，復制產(chǎn)生雙鏈DNA。當用輔助噬菌體當用輔助噬菌體M13感染宿主細胞后，噬菌質(zhì)粒的復制感染宿主細胞后，噬菌質(zhì)粒的復制就轉(zhuǎn)變成如同就轉(zhuǎn)變成如同M13噬菌體一樣的滾環(huán)復制，產(chǎn)生單鏈噬菌體一樣的滾環(huán)復制，產(chǎn)生單鏈DNA。用途：用途：可用于制備單鏈或雙鏈可用于制備單鏈或雙鏈DNA，克隆和表達外源基，克隆和表達外源基因。因。2 病毒（噬菌體）克隆載體病毒（噬菌體）克隆載體噬菌體克隆載體噬菌體克隆載體M13克隆載體克隆載體Cosmid 克隆載體克隆載體噬菌粒載體噬菌粒載體CaMV

40、克隆載體克隆載體TMV克隆載體克隆載體SV40克隆載體克隆載體反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體腺病毒克隆載體腺病毒克隆載體痘苗病毒克隆載體痘苗病毒克隆載體桿狀病毒表達克隆載體桿狀病毒表達克隆載體CaMV花椰菜花斑病病毒克隆載體花椰菜花斑病病毒克隆載體含含1個約個約8kb的環(huán)狀雙鏈的環(huán)狀雙鏈DNA分子；分子；用于十字花科和少數(shù)非十字花科的植物基因轉(zhuǎn)移；用于十字花科和少數(shù)非十字花科的植物基因轉(zhuǎn)移；其感染對植物有害，不能直接做載體；其感染對植物有害，不能直接做載體；p構(gòu)建的含強啟動子構(gòu)建的含強啟動子35S RNA啟動子的載體可在植物啟動子的載體可在植物細胞內(nèi)高效表達基因。細胞內(nèi)高效表達基因。 植

41、物根部特異性表達植物根部特異性表達植物地上部特異性表達植物地上部特異性表達用于構(gòu)建植物載體的植物病毒：用于構(gòu)建植物載體的植物病毒：雙鏈雙鏈DNA 病毒：病毒：花椰菜花葉病毒花椰菜花葉病毒(CaMV)，單鏈單鏈DNA 病毒：病毒：蕃茄金黃花葉病毒蕃茄金黃花葉病毒(TGMV)、非洲木薯花葉病毒、非洲木薯花葉病毒(ACMV)、玉米線條病毒玉米線條病毒(MSV)、小麥矮縮病毒、小麥矮縮病毒(WDV)，RNA 病毒：病毒：雀麥草花葉病毒雀麥草花葉病毒(BMV)、大麥條紋花葉病毒大麥條紋花葉病毒(BSMV)、蕃茄叢矮病毒、蕃茄叢矮病毒(TBSV)、馬鈴薯馬鈴薯X 病毒病毒(PVX)、煙草花葉病毒、煙草花葉

42、病毒(TMV)、煙草蝕刻病毒煙草蝕刻病毒(TEV)、李痘病毒、李痘病毒(PPV)等。等。動物病毒識別宿主細胞，某些動物病毒載體能動物病毒識別宿主細胞，某些動物病毒載體能高效整高效整合合到宿主基因組中，以及到宿主基因組中，以及高拷貝高拷貝和和強啟動子強啟動子等，有利等，有利于真核外源基因的克隆與表達。于真核外源基因的克隆與表達。目前利用許多哺乳動物病毒如目前利用許多哺乳動物病毒如SV40、腺病毒、痘病毒、腺病毒、痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等改造后的衍生物作為基因載體。等改造后的衍生物作為基因載體。用于構(gòu)建動物載體的動物病毒：用于構(gòu)建動物載體的動物病毒：猿猴病毒猿猴病毒-40(SV-40)載體

43、載體優(yōu)點：優(yōu)點： 5243 bp共價閉合環(huán)狀分子共價閉合環(huán)狀分子 感染率高，幾乎感染率高，幾乎100寄主細胞能被感染寄主細胞能被感染 能提供完整的真核基因轉(zhuǎn)錄所需的成分能提供完整的真核基因轉(zhuǎn)錄所需的成分 侵染性具有寄主特異性侵染性具有寄主特異性反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體反轉(zhuǎn)錄病毒是一類含反轉(zhuǎn)錄病毒是一類含RNA的病毒，進入受體細胞后，的病毒，進入受體細胞后，RNA反轉(zhuǎn)錄成反轉(zhuǎn)錄成DNA，通過兩端由數(shù)百，通過兩端由數(shù)百bp組成的組成的長末長末端重復序列端重復序列，整合到染色體上，成為原病毒。，整合到染色體上，成為原病毒。反轉(zhuǎn)錄病毒整合入宿反轉(zhuǎn)錄病毒整合入宿主主DNADNA中的分子機制，

44、中的分子機制，其本質(zhì)是轉(zhuǎn)座。其本質(zhì)是轉(zhuǎn)座。昆蟲病毒載體昆蟲病毒載體優(yōu)點：優(yōu)點：高克隆容量，克隆外源高克隆容量，克隆外源DNA片段大小可高達片段大小可高達100kb；高表達效率，外源高表達效率，外源DNA的表達量達到細胞蛋白質(zhì)總量的表達量達到細胞蛋白質(zhì)總量的的25左右，甚至更多；左右，甚至更多；具有安全性，僅感染無脊椎動物，并不引起人和乳動具有安全性，僅感染無脊椎動物，并不引起人和乳動物物 腺病毒克隆載體腺病毒克隆載體 雙鏈雙鏈DNA病毒，基因組病毒，基因組36kb 單鏈取代單鏈取代腺病毒載體的優(yōu)點：腺病毒載體的優(yōu)點：宿主范圍廣宿主范圍廣, 對人致病性低對人致病性低在增殖和非增殖細胞中感染和表達

45、基因在增殖和非增殖細胞中感染和表達基因與人類基因同源與人類基因同源不整合到染色體中，無插入致突變性不整合到染色體中，無插入致突變性能同時表達多個基因能同時表達多個基因1 質(zhì)粒克隆載體質(zhì)?？寺≥d體2 病毒（噬菌體）克隆載體病毒（噬菌體）克隆載體3 染色體定位整合克隆載體染色體定位整合克隆載體4 人工染色體克隆載體人工染色體克隆載體5 特殊用途克隆載體特殊用途克隆載體質(zhì)粒載體或病毒載體攜帶的外源質(zhì)粒載體或病毒載體攜帶的外源DNA 分子在宿主細胞中的分子在宿主細胞中的復制有兩種情況：復制有兩種情況：自主復制：自主復制：外源外源DNA產(chǎn)生多拷貝，但是容易丟失，導致轉(zhuǎn)基因生物的產(chǎn)生多拷貝，但是容易丟失，

46、導致轉(zhuǎn)基因生物的不穩(wěn)定性；不穩(wěn)定性；整合到染色體整合到染色體DNA：能穩(wěn)定維持，但是插入位點不確定，可能對受體細胞基因能穩(wěn)定維持，但是插入位點不確定，可能對受體細胞基因組的自穩(wěn)系統(tǒng)產(chǎn)生干擾，導致出現(xiàn)有害的突變。組的自穩(wěn)系統(tǒng)產(chǎn)生干擾，導致出現(xiàn)有害的突變?；蚨ㄎ徽掀脚_系統(tǒng)基因定位整合平臺系統(tǒng)可克服這兩者的負面效應，已廣泛可克服這兩者的負面效應，已廣泛應用于轉(zhuǎn)基因動植物的研究。應用于轉(zhuǎn)基因動植物的研究。3 染色體定位整合克隆載體染色體定位整合克隆載體3.1 基因整合平臺系統(tǒng)的組成基因整合平臺系統(tǒng)的組成整合平臺整合平臺定位整合載體定位整合載體（1）整合平臺：）整合平臺：指受體細胞基因組上給定的一個

47、指受體細胞基因組上給定的一個DNA 區(qū)區(qū)域，是外源域，是外源DNA 定位整合的位置定位整合的位置(靶位靶位)。整合平臺可以在基因區(qū)或者在基因間隔區(qū)。整合平臺可以在基因區(qū)或者在基因間隔區(qū)。（2）定位整合載體：）定位整合載體：除了一般質(zhì)粒載體必須具備的除了一般質(zhì)粒載體必須具備的元件外，還必須含有一段或兩段元件外，還必須含有一段或兩段與整合平臺與整合平臺DNA 區(qū)區(qū)域核苷酸序列同源的域核苷酸序列同源的DNA 片段片段。p同源同源DNA 片段長度在片段長度在1kb 以上。以上。p通過通過同源重組，同源重組，定位整合載體攜帶的目的定位整合載體攜帶的目的DNA 片片段能夠定位整合到整合平臺段能夠定位整合到

48、整合平臺DNA 區(qū)域，隨受體細胞區(qū)域，隨受體細胞染色體染色體DNA 的復制而復制，穩(wěn)定遺傳。的復制而復制，穩(wěn)定遺傳。p利用基因整合平臺系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因的方法也稱為利用基因整合平臺系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因的方法也稱為基因基因打靶打靶或或基因定位同源重組基因定位同源重組。分為分為4 種類型：種類型：內(nèi)源平臺整合載體內(nèi)源平臺整合載體：整合平臺選定在受體細胞基因組：整合平臺選定在受體細胞基因組的一個的一個DNA 區(qū)；區(qū)；又可分為又可分為雙交換置換載體、單交換插入載體和雙交換雙交換置換載體、單交換插入載體和雙交換插入載體插入載體；外源平臺整合載體：外源平臺整合載體：有兩組同源有兩組同源DNADNA、整合兩次。、整合兩次。多

49、采用雙交換插入載體多采用雙交換插入載體。3.2 定位整合克隆載體的幾種模式定位整合克隆載體的幾種模式與與受體細胞的種屬受體細胞的種屬有關(guān)；有關(guān)；和和同源同源DNA 片段的長短片段的長短有關(guān)，隨著載體同源有關(guān)，隨著載體同源DNA 片段長片段長度增加而提高。度增加而提高。整合平臺整合平臺DNADNA兩側(cè)有重組酶兩側(cè)有重組酶RecBCRecBC的的chichi位點可提高重組率位點可提高重組率。3.3 定位整合克隆載體的定位整合效率定位整合克隆載體的定位整合效率噬菌粒載體噬菌粒載體柯斯質(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒載體特點、結(jié)構(gòu)特征特點、結(jié)構(gòu)特征 染色體定位整合克隆載體染色體定位整合克隆載體回顧回顧噬菌體噬菌體噬菌

50、體噬菌體載體載體cos ends主要類型主要類型包裝長度包裝長度M13M13噬菌體載體噬菌體載體RF DNA整合平臺整合平臺定位整合載體定位整合載體1 質(zhì)?？寺≥d體質(zhì)?？寺≥d體2 病毒（噬菌體）克隆載體病毒（噬菌體）克隆載體3 染色體定位整合克隆載體染色體定位整合克隆載體4 人工染色體克隆載體人工染色體克隆載體5 特殊用途克隆載體特殊用途克隆載體人工染色體載體人工染色體載體（artificial chromosome vector）：利）：利用染色體的復制元件來驅(qū)動外源用染色體的復制元件來驅(qū)動外源DNA片段復制的載體片段復制的載體。穿梭載體：穿梭載體：含有含有第一受體第一受體(大腸桿菌大腸桿菌

51、)內(nèi)源質(zhì)粒復制起始位點內(nèi)源質(zhì)粒復制起始位點 含有含有第二受體第二受體(如酵母菌如酵母菌)染色體染色體DNA 著絲點、端粒和復著絲點、端粒和復制起始位點的序列，以及選擇標記基因。制起始位點的序列，以及選擇標記基因。4.1 人工染色體克隆載體含義和特點人工染色體克隆載體含義和特點酵母的自主復制區(qū)酵母的自主復制區(qū)ARS序列序列 (autonomously replicating sequence) ，在酵母染色體復制和質(zhì)粒復制中均，在酵母染色體復制和質(zhì)粒復制中均發(fā)揮復發(fā)揮復制起點的功能。制起點的功能。人工染色體載體人工染色體載體在在第一受體細胞第一受體細胞內(nèi)按內(nèi)按質(zhì)粒復制質(zhì)粒復制形式進入形式進入高拷

52、貝復制。高拷貝復制。這種克隆載體在體外與目的這種克隆載體在體外與目的DNA片段重組后，轉(zhuǎn)化片段重組后，轉(zhuǎn)化第第二受體細胞二受體細胞，按，按染色體染色體DNA復制復制的形式進行復制和傳的形式進行復制和傳遞。遞。篩選篩選第一受體的克隆子，用抗菌素抗性選擇標記；第一受體的克隆子，用抗菌素抗性選擇標記；篩選篩選第二受體的克隆子，用與受體互補的營養(yǎng)缺陷型。第二受體的克隆子，用與受體互補的營養(yǎng)缺陷型。酵母人工染色體酵母人工染色體(YAC)的構(gòu)建的構(gòu)建：含酵母染色體的含酵母染色體的DNA端粒端粒(TEL)、DNA 復制起點復制起點(ARS)著絲粒著絲粒(CEN) 選擇標記選擇標記(HIS 和和TRP1)基因

53、基因多克隆位點多克隆位點(MCS)的的DNA 片段片段大腸桿菌的復制子大腸桿菌的復制子大腸桿菌的選擇標記大腸桿菌的選擇標記YAC載體的裝載量為載體的裝載量為350-400 kb4.2 人工染色體克隆載體的構(gòu)建人工染色體克隆載體的構(gòu)建YAC的使用的使用細菌人造染色體細菌人造染色體( BAC)是在是在F質(zhì)?；A上構(gòu)建的，其裝載量范圍在質(zhì)?；A上構(gòu)建的，其裝載量范圍在50 - 300 kb，人類人工染色體載體（人類人工染色體載體（HAC）哺乳動物人工染色體載體（哺乳動物人工染色體載體（MAC）構(gòu)建基因組文庫構(gòu)建基因組文庫容納大的外源片段，用于構(gòu)建人類和高等生物的基因組文庫。容納大的外源片段，用于構(gòu)建

54、人類和高等生物的基因組文庫?；蛑委熁蛑委煷蟮耐庠雌文苋菁{完整的基因家族，從而可能校正由多個突大的外源片段能容納完整的基因家族，從而可能校正由多個突變位點引起的致病突變。變位點引起的致病突變?；蚬δ荑b定基因功能鑒定大的外源片段包含編碼區(qū)、內(nèi)含子、調(diào)控區(qū)。大的外源片段包含編碼區(qū)、內(nèi)含子、調(diào)控區(qū)。4.3 人工染色體克隆載體的應用人工染色體克隆載體的應用1 質(zhì)?？寺≥d體質(zhì)?？寺≥d體2 病毒（噬菌體）克隆載體病毒（噬菌體）克隆載體3 染色體定位整合克隆載體染色體定位整合克隆載體4 人工染色體克隆載體人工染色體克隆載體5 特殊用途克隆載體特殊用途克隆載體啟動子探針型克隆載體啟動子探針型克隆載體誘導

55、型表達克隆載體誘導型表達克隆載體反義表達克隆載體反義表達克隆載體組織特異性表達克隆載體組織特異性表達克隆載體分泌型表達克隆載體分泌型表達克隆載體雙啟動子表達克隆載體雙啟動子表達克隆載體串聯(lián)啟動子表達克隆載體串聯(lián)啟動子表達克隆載體含增強子表達克隆載體含增強子表達克隆載體5 特殊用途克隆載體特殊用途克隆載體啟動子是調(diào)控基因有效轉(zhuǎn)錄的必備元件啟動子是調(diào)控基因有效轉(zhuǎn)錄的必備元件。啟動子探針載體含有啟動子探針載體含有質(zhì)粒載體必備的元件和檢測部件質(zhì)粒載體必備的元件和檢測部件。檢測部件有兩部分組成檢測部件有兩部分組成: :遺傳標記基因遺傳標記基因以及以及克隆位點克隆位點。標記基因：標記基因：抗生素抗性基因和

56、綠色熒光蛋白基因抗生素抗性基因和綠色熒光蛋白基因gp 等。等。5.1 啟動子探針載體啟動子探針載體1 1）較安全的基因表達載體：）較安全的基因表達載體：由此獲得的轉(zhuǎn)基因生物進入自然環(huán)境中，由于不存在合由此獲得的轉(zhuǎn)基因生物進入自然環(huán)境中，由于不存在合適的誘導條件，不能表達外源基因產(chǎn)物，也不會導致環(huán)適的誘導條件，不能表達外源基因產(chǎn)物，也不會導致環(huán)境污染和影響生態(tài)系統(tǒng)的平衡；境污染和影響生態(tài)系統(tǒng)的平衡；2 2）能）能人為控制基因時空的表達人為控制基因時空的表達，將為基因治療的臨床，將為基因治療的臨床應用及基礎研究提供良好的手段。應用及基礎研究提供良好的手段。種類：種類：二價金屬離子二價金屬離子誘導啟

57、動子、誘導啟動子、紅光誘導紅光誘導啟動子、啟動子、熱誘導熱誘導啟啟動子和動子和干旱干旱誘導啟動子等。誘導啟動子等。5.2 誘導型表達載體誘導型表達載體反義核酸技術(shù)：反義核酸技術(shù)：利用人工合成或重組的與靶基因互補的一利用人工合成或重組的與靶基因互補的一段段反義反義DNA 或或RNA 片段，特異性地與靶基因結(jié)合片段，特異性地與靶基因結(jié)合，能封，能封閉其表達。閉其表達。用途：用途：此技術(shù)已成為基因治療的重要手段。此技術(shù)已成為基因治療的重要手段。將獲得的致病基因反向插入表達載體，構(gòu)建成反義表達載將獲得的致病基因反向插入表達載體，構(gòu)建成反義表達載體。體。反義表達載體導入靶細胞后，可轉(zhuǎn)錄出與致病基因反義表

58、達載體導入靶細胞后，可轉(zhuǎn)錄出與致病基因mRNA 互補的反義互補的反義RNA，特異性地封閉致病基因的表達。，特異性地封閉致病基因的表達。5.3 反義表達載體反義表達載體高等真核生物中，一些特殊的調(diào)控序列高等真核生物中，一些特殊的調(diào)控序列(啟動子等啟動子等)可以調(diào)可以調(diào)控基因只能在一定的組織中才進行有效的表達?？鼗蛑荒茉谝欢ǖ慕M織中才進行有效的表達。已經(jīng)構(gòu)建已經(jīng)構(gòu)建v乳腺組織特異性表達載體、乳腺組織特異性表達載體、v腫瘤細胞特異性表達載體、腫瘤細胞特異性表達載體、v神經(jīng)組織特異性表達載體、神經(jīng)組織特異性表達載體、v花藥特異性表達載體花藥特異性表達載體v種子特異性表達載體等。種子特異性表達載體等。

59、5.4 組織特異性表達載體組織特異性表達載體葉特異性表達葉特異性表達葉肉特異性表達葉肉特異性表達維管束特異表達維管束特異表達莖特異表達莖特異表達馬鈴薯馬鈴薯分泌型表達克隆載體分泌型表達克隆載體雙啟動子表達克隆載體雙啟動子表達克隆載體串聯(lián)啟動子表達克隆載體串聯(lián)啟動子表達克隆載體含增強子表達克隆載體含增強子表達克隆載體1 質(zhì)?？寺≥d體質(zhì)?？寺≥d體2 病毒（噬菌體）克隆載體病毒（噬菌體）克隆載體3 染色體定位整合克隆載體染色體定位整合克隆載體4 人工染色體克隆載體人工染色體克隆載體5 特殊用途克隆載體特殊用途克隆載體1.列舉質(zhì)粒載體必須具備的基本特性。列舉質(zhì)粒載體必須具備的基本特性。2.舉例說明什么

60、是穿梭載體？舉例說明什么是穿梭載體？3.什么是什么是Ti質(zhì)粒和質(zhì)粒和T-DNA？ 4.為什么野生型的為什么野生型的 噬菌體噬菌體DNA不宜作為基因工程載體不宜作為基因工程載體？5. 噬菌體與噬菌體與cos作載體有何區(qū)別？作載體有何區(qū)別？6.M13載體的主要用途？載體的主要用途？7.何謂何謂YAC? 主要特性是什么主要特性是什么? 8.列舉主要用于植物和動物轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒載體和病毒載列舉主要用于植物和動物轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒載體和病毒載體有哪些？體有哪些？9.什么是定位整合載體？什么是定位整合載體？思考題思考題回顧回顧plasmid質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體必須必須具備的基本條件具備的基本條件pUC質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體pB