原代心肌細胞培養(yǎng)

1、1材料1.1動物出生后1-4天SD乳鼠15只。1.2試劑低糖DMEM胰酶（含EDTA）、青鏈霉素、碳酸氫鈉液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank's液。0.1%新潔爾滅、碘酒、75%酉精。培養(yǎng)液：培養(yǎng)液（DMEM新生牛血清，青鏈霉素）。1.3手術器械和儀器鋁盒、眼科直剪、眼科彎剪、眼科直鑷、眼科彎剪、玻璃培養(yǎng)皿（共2套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心臟組織）、100ml廣口瓶兩個（分別裝碘酒和酒精棉球）、500ml燒杯、250ml錐形瓶、15ml和50ml的離心管，磁力攪拌器和攪拌子（或者水浴振蕩器）、150-200目尼龍篩網(wǎng)和針式濾器。2方法2.1將胰酶用D-Hank's

2、液配成0.06%的濃度，并放置于37C水浴中溫育好。2.2解剖取材：將乳鼠放入0.1%新潔爾滅浸泡一下后拿出，用另一把大鑷子取碘酒棉球擦皮膚，再用酒精棉球脫碘。左手捏緊乳鼠頸背部皮膚以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪開皮，充分撕拉開，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科彎剪沿胸骨柄左下緣向上剪開肋骨，然后在切口中間橫剪胸骨。這樣只要左手稍頂，乳鼠的心臟就直接跳出來。然后用眼科彎鑷從心臟中部直接將心室部分剪下，放入冰浴的D-Hank's液中。重復以上過程。取材完畢后，撤掉取材的手術器械。注：為了保證心肌細胞的活力，取心的操作過程盡量快，另外，最好把盛的心臟的培養(yǎng)皿放置在冰臺上或者預冷的平衡鹽

3、液中。2.3用第二套手術器械進行下列操作。用眼科直鑷和眼科彎剪把培養(yǎng)皿中的心臟周邊的血凝塊及纖維組織剔除掉，放在另一個預先裝好D-Hank's液的培養(yǎng)皿中，把心臟組織再洗一遍后，將心臟組織放在另外一個培養(yǎng)皿中（或者其它合適容器中，視個人習慣），加少許0.06%胰酶，用眼科彎剪將心臟組織剪成1mm3大小的碎塊，將剪碎的心臟和胰酶液轉入加了攪拌子的錐形瓶中，另外吸取2-3ml新鮮的胰酶沖洗平皿和剪刀并轉入錐形瓶中，補加胰酶至終體積10ml，加上塞子，放在37C水浴中（可以用一個消毒的500ml燒杯，裝好無菌的蒸餾水，加夠水量，水位線稍低于250ml錐形瓶的刻度線即可，過少則溫度會不均勻，過

4、高容易污染。打開磁力攪拌器電源，預先將水溫調節(jié)到37C），調節(jié)轉速至60rpm左右，消化15min（務必保證水浴溫度恒定在37C，并且消化時間不超過15min）。或者，如果采用的是水浴震蕩器的話，不用加攪拌子，直接放在水浴震蕩器中消化亦可，轉速和消化時間相同。2.4從水浴中取出錐形瓶，小心吸去上清，上清中的主要成分是血紅細胞和成纖維類細胞。2.5加入10ml新的胰酶，用一支新的吸管吹打溶液幾次，機械分散細胞（組織消化后會成為粘稠的膠體狀），注意：不要過分吹打，否則會導致組織過度消化，37C水浴攪拌再消化10-15min;如果乳鼠數(shù)目少（比如5、6只的時候），消化時間可以減少為5-10min,否

5、則很容易消化過度。上述消化處理的同時，往一支50ml的一次性無菌離心管中加入20ml預冷的含10%血清的培養(yǎng)液，并放置冰臺上。消化處理之后，小心移出上清轉至上述加有培養(yǎng)液的離心管中，第一次消化收集的分離出的細胞，第一次消化結束后；繼續(xù)第二次消化，余下的組織塊加入10ml新胰酶繼續(xù)消化。2.6重復2.5消化步驟，直至剩余少許組織塊為止，一般消化4-5次可以消化絕大多數(shù)的組織塊（不含棄去消化液的那次）。2.7 第1、2次含細胞的消化液放在一根離心管中，過180目篩網(wǎng)后，一起離心;第3、4次含細胞的消化液放在一根離心管中，過180目篩網(wǎng)后，一起離心。最后，分別用8ml含20%血清的培養(yǎng)液重懸兩管細胞

6、，接種到一個75cm2的塑料培養(yǎng)瓶中，放置在培養(yǎng)箱中1.5小時后，取出，棄貼壁細胞（主要是成纖維細胞和內(nèi)皮細胞），將未貼壁的細胞懸液取出，臺盼籃拒染法計數(shù)后，加入培養(yǎng)液調整細胞濃度為5-6x105個/ml，接種到目的培養(yǎng)器皿中。2.8 一般不用加BrdU,如果培養(yǎng)時間長（發(fā)現(xiàn)成纖維細胞也極少），可以加入0.1mmol/mlBrdU（Sigma）以阻止成纖維細胞增殖。加了BrdU，心肌細胞搏動的持續(xù)時間會更長。2.9 接種后24小時，用溫的培養(yǎng)基或者平衡鹽液輕輕沖洗培養(yǎng)的心肌細胞一次，以去處未貼壁的細胞（部分細胞會在24小時后貼，結果很多細胞重疊生長），再更換培養(yǎng)液，即可?？梢园凑諏嶒炐枰谂囵B(yǎng)

7、48h或72h后施加處理因素。3 結果心肌細胞剛接種時形狀為圓形或橢圓形，大約在24h左右基本貼壁，此時細胞伸出偽足，偽足在鏡下為纖維狀條索，細胞胞體則呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，如多角形，部分細胞有聚集傾向，細胞搏動效果較好，DMEM培養(yǎng)基在初始培養(yǎng)時為深紅色，兩天后變?yōu)榈S色，應該是營養(yǎng)成分下降的表現(xiàn)，也說明細胞生長狀況良好。我們也參考了一些國外文獻的培養(yǎng)方法加以補充。鑒定的最簡單的辦法就是搏動與否，注意：當搏動比較微弱的時候，在10倍物鏡下可能看不到搏動，換成20或40倍的物鏡可能能觀察到。檢驗操作是否合格的最好的辦法就是看心肌細胞的純度和搏動能力。另外，心肌細胞表達肌動蛋白，可以作為鑒定，但不是唯一的特征性指標，因為平滑肌細胞也表達。4 討論乳鼠心肌細胞屬于原代生長細胞，培養(yǎng)過程較為繁瑣。文獻上有多種濃度胰酶消化方法，0.06%濃度的胰酶對細胞損害較小，但這個濃度消化所需時間較長。采取多次反復低濃度消化的方法，每次消化一些后，用吸管抽取出上清液，離心所得即為心肌細胞。利用心肌細胞和成纖維細胞貼壁時間的不同，采用差速貼壁1.5h，充分去除成纖維類細胞，達到純化的目的。成纖維細胞胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質突起，生長時呈放射狀，并且會增殖，不搏動，很好和心肌細