實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用注意事項適合菜鳥入門

1、實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用注意事項適合菜鳥入門實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用-注意事項-適合菜鳥入門目錄目錄實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR基本原理基本原理實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR的實驗設(shè)計的實驗設(shè)計實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR兩種相對定量方法比較兩種相對定量方法比較實時實時熒光定量熒光定量PCRPCR誤差分析誤差分析及操作規(guī)范及操作規(guī)范實驗中污染的防實驗中污染的防控控熒光定量熒光定量PCRPCR報告模板報告模板實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR基本原理基本原理常規(guī)常規(guī)PCR：借助電泳對擴增反應(yīng)的終產(chǎn)物進行半定量及：借助電泳對擴增反應(yīng)的終產(chǎn)物進行半定量及定

2、定性分析。性分析。定量定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCRPCR擴增反應(yīng)中擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，最終精確的對起始每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，最終精確的對起始模板模板進行定量分析。進行定量分析。常規(guī)常規(guī)vs vs實時實時優(yōu)缺點優(yōu)缺點比較比較定量定量PCRPCR三個基本概念三個基本概念(1)擴增曲線PCR過程中，以循環(huán)數(shù)為橫坐標，以反應(yīng)過程中熒光強度為縱坐標所做的曲線。定量定量PCRPCR三個基本概念三個基本概念(2)閾值的概念在熒光定量PCR擴增的指數(shù)期，畫一條線，在此直線上，所有樣品的熒光強度與其本底熒光強度的差值全部相同。定量定量P

3、CRPCR三個基本概念三個基本概念(3) CT值PCR過程中，各樣品擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時，所經(jīng)過的擴增循環(huán)數(shù)。C(t)C(t)與初始模板含量與初始模板含量初始模板量越多，C(t)值越小C(t)與初始模板濃度的對數(shù)值成線性關(guān)系熒光強度熒光強度-循環(huán)數(shù)曲線循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對數(shù)初始模板量對數(shù)-C(T)循環(huán)數(shù)標準曲線循環(huán)數(shù)標準曲線10410310610510210熒光定量熒光定量PCRPCR的定量的定量原理原理濃度的對數(shù)值與循環(huán)數(shù)呈濃度的對數(shù)值與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴增線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)（達到域值的循環(huán)數(shù)（Ct值）值）就可分析樣品中起始模就可分析樣品中起始模

4、板板量。量。熒光定量熒光定量PCRPCR的化學原理的化學原理 化學化學方法分類方法分類非特異性非特異性SYBR Green I法法特異性特異性TaqMan探針法探針法SYBR Green ISYBR Green I法法原理：結(jié)合原理：結(jié)合雙鏈雙鏈DNADNA分子小溝分子小溝延伸結(jié)束，形成雙鏈延伸結(jié)束，形成雙鏈DNADNA，SYBR SYBR GreenGreen結(jié)合到雙螺旋小溝中，當受結(jié)合到雙螺旋小溝中，當受到適合光源激發(fā)，發(fā)射出熒光，到適合光源激發(fā)，發(fā)射出熒光，反映產(chǎn)物濃度反映產(chǎn)物濃度優(yōu)點優(yōu)點使用方便，無需復雜的設(shè)計使用方便，無需復雜的設(shè)計成本較低成本較低缺點缺點與非特異性產(chǎn)物結(jié)合，無模板特

5、與非特異性產(chǎn)物結(jié)合，無模板特異性異性試驗方法較難優(yōu)化試驗方法較難優(yōu)化靈敏度低靈敏度低GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAASYBR Green ISYBR Green I法法溶解曲線分析熒光染料的特點及應(yīng)用(1)、能夠與所有的核酸雙鏈結(jié)合，受激后產(chǎn)生熒光，其熒光的強度與雙鏈核酸的含量及長度成正比，因此本底較高；(2)、可做雙鏈核酸的熔解曲線分析；(3)、SYBR Green染料本身價格便宜，但是做熒光定量PCR時對引物設(shè)計的要求很高；對Taq酶要求較高，最好是HotStar Taq酶，或者操作時需要嚴格的冷啟動，冰上操作，否則引物二聚體及非特異性擴增會嚴重干擾

6、結(jié)果的準確性，尤其是模板含量較低時；(4)、適合于基因含量及基因表達變化的粗略分析或初篩；(5)、在分析的基因種類很多，但是樣品量很少時，尤其適用。(6)、對PCR反應(yīng)的毒性，能抑制PCR反應(yīng)，降低PCR反應(yīng)的效率。TaqMan探針法水解型水解型報告基團，淬滅基團報告基團，淬滅基團FRETFRET（熒光諧振能量傳遞）（熒光諧振能量傳遞）識別特異性產(chǎn)物識別特異性產(chǎn)物優(yōu)點優(yōu)點特異性高，可準確定量特異性高，可準確定量靈敏度高靈敏度高設(shè)計不同標記的探針，可進行設(shè)計不同標記的探針，可進行多重檢測多重檢測缺點缺點一個探針只適用于一個目標一個探針只適用于一個目標價格較高價格較高探針設(shè)計較繁瑣探針設(shè)計較繁瑣T

7、aqManTaqMan作用機理兩種化學的比較實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR的實驗設(shè)計的實驗設(shè)計絕對定量與相對定量絕對定量：精確的計算初始反應(yīng)的模板濃度（絕對定量：精確的計算初始反應(yīng)的模板濃度（DNADNA，RNARNA）相對定量：計算初始反應(yīng)模板的相對含量相對定量：計算初始反應(yīng)模板的相對含量定量PCR-絕對定量標準品，標準曲線標準品，標準曲線已知濃度的相應(yīng)已知濃度的相應(yīng)DNADNA模板，按不同濃度稀釋模板，按不同濃度稀釋根據(jù)實時根據(jù)實時PCRPCR反應(yīng)得到相應(yīng)的反應(yīng)得到相應(yīng)的C(t)C(t)，構(gòu)建標準曲線，構(gòu)建標準曲線樣品樣品與標準品同時進行與標準品同時進行PCRPCR反應(yīng)得到未知濃度樣

8、品的反應(yīng)得到未知濃度樣品的C(t)C(t)值值定量PCR-相對定量相對定量的目的相對定量的目的比較基因在不同情況下的表達差異（倍數(shù)關(guān)系）比較基因在不同情況下的表達差異（倍數(shù)關(guān)系）相對定量的問題相對定量的問題樣品材料不均一造成的差別樣品材料不均一造成的差別內(nèi)標基因內(nèi)標基因內(nèi)標通常是內(nèi)標通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因等看家基因（內(nèi)標基因的表達要相對恒定，表達不受處理因素影響）（內(nèi)標基因的表達要相對恒定，表達不受處理因素影響）對目的基因進行均一化：去除樣本間加樣量不同帶來的對目的基因進行均一化：去除樣本間加樣量不同帶來的誤差誤差實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR兩種相對

9、兩種相對定定量量方法比較方法比較相對標準曲線相對標準曲線法和法和2-c(t) 法法相對標準曲線法用目標基因和內(nèi)標基因的標準品分別獲得標用目標基因和內(nèi)標基因的標準品分別獲得標準曲線準曲線處理與未處理樣品同時擴增目標基因和內(nèi)標處理與未處理樣品同時擴增目標基因和內(nèi)標基因，獲得基因，獲得C(t)C(t)值值用內(nèi)標基因?qū)δ繕嘶蚓换脙?nèi)標基因?qū)δ繕嘶蚓换幚順颖九c未處理樣本目標基因處理樣本與未處理樣本目標基因C(t)C(t)值經(jīng)內(nèi)參值經(jīng)內(nèi)參基因均一化后相除，即可得出處理樣本與未處理基因均一化后相除，即可得出處理樣本與未處理樣本的表達差異樣本的表達差異適用范圍目標基因與內(nèi)標基因擴增效率差異較大目標基

10、因與內(nèi)標基因擴增效率差異較大擴增效率較低擴增效率較低2-c(t) 法前提：目標序列和內(nèi)參序列的擴增效率接近100且偏差在 5以內(nèi) 1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標基因的CT值： CT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test) CT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator) 2、用校準樣本的CT值歸一試驗樣本的CT值： CT= CT（test) - CT（calibrator) 3、計算表達水平比率： 2 CT=表達量的比值當有多個樣品時（如時間點），各樣品均一化后都與同一時間點相比

11、一般步驟選定目標基因和內(nèi)標基因選定目標基因和內(nèi)標基因設(shè)計一步法或兩步法設(shè)計一步法或兩步法RT-PCRRT-PCR反應(yīng)反應(yīng)數(shù)據(jù)獲得及處理數(shù)據(jù)獲得及處理目標基因目標基因C(t)值值內(nèi)標基因內(nèi)標基因C(t)值值計算計算2-c(t) 作圖作圖適用范圍當擴增效率較高，且目標基因和內(nèi)標基因擴增效率當擴增效率較高，且目標基因和內(nèi)標基因擴增效率比較比較一致一致不做標準曲線，高通量檢測不做標準曲線，高通量檢測實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR誤差分析誤差分析及及操作規(guī)范操作規(guī)范1、誤差分析（1）、實驗方案本身的誤差 熒光染料法由于染料本身的特性，不可避免的會引起誤差； 2 -CT法由于也是一種近似的算法，所以

12、不可避免的也會引起誤差； Taqman探針法誤差相對較??； 雙標準曲線法誤差相對較小。（2）、儀器設(shè)備引起的誤差 測量標準品核酸濃度時，分光光度計的誤差，從光密度值到質(zhì)量再到摩爾量，誤差本身就很大； 定量PCR儀的誤差，耗材引起的誤差，96空板封口膜透光性的差異等（3）、相對定量時內(nèi)參基因表達不穩(wěn)定引起的誤差（4）、操作引起的誤差 樣品處理、選取、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、加樣，操作過程中引起的誤差。2、操作規(guī)范 熒光定量PCR是一項對操作要求很高的實驗，同時又是花費很高的一項實驗，這就要求必須最大程度的減少誤差或避免錯誤。要想達到這個目標，我們必須從樣品的選取開始到上樣檢測，每一步都要規(guī)范操作。（1

13、）、樣品的處理及選取 處理樣品時，必須確保樣品都得到了充分的處理。如測定一種藥物到小白鼠免疫系統(tǒng)的影響，必須做到每次飼喂時此藥品完全被小白鼠攝食；選取試驗樣品時，要保證選取的組織盡可能的純，不要污染其他組織，如選取脾臟組織時，盡可能的選取脾臟，不能混有結(jié)締組織等，樣品選取好后，即可放入液氮或超低溫冰箱保存。（2）、核酸提取 加入液氮研磨要徹底，蛋白、多糖、多酚類物質(zhì)要去除干凈，確保得到高質(zhì)量的核酸，分光光度計檢測核算質(zhì)量，RNA OD260/280左右，DNA OD260/280左右，最好再做電泳檢測；同一樣品要提取2到3個RNA，所剩余的樣品不要丟棄，繼續(xù)低溫保存。（3）、得到的RNA立即反

14、轉(zhuǎn)錄為cDNA，RNA樣品最好不要存放，反轉(zhuǎn)錄所得cDNA要用看家基因檢測。（4）、對于精度要求較高的定量PCR，最好先在樣品的所有組織類型內(nèi)做內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析，找出表達恒定基因作為內(nèi)參。（5）、做定量PCR時，先把除模板外的所有試劑預混，然后分裝到PCR管中，分裝時盡量采用排槍，加樣時盡量最好采用排槍。（6）、體系中最好摻入ROX參比熒光，消除光程差和加樣的偏差。（7）、重復操作 讓重復操作最大的修正偏差。最有意義的重復是在提取樣品RNA時就重復，同一個樣品，分別提取3份RNA，3份RNA都做反轉(zhuǎn)錄，所得的3份cDNA都做定量PCR檢測，這樣的重復之所以最有意義是因為我們是把RNA提取、

15、反轉(zhuǎn)錄、上機檢測三步做了重復，這樣得出的平均值要比只在上機檢測時對同一cDNA樣品做三個重復要有意義的多。 同一個cDNA樣品做三個重復定量檢測求平均值主要是消除加樣時的誤差，排槍加樣時，誤差很小，加樣時的誤差可以通過設(shè)幾個重復檢測出來。同一cDNA樣品的三個重復模板濃度越低，染料法的誤差越大。如圖一系列梯度稀釋的模板，理論上它們在擴增曲線上的CT值之差，應(yīng)該相等，但是后邊幾個濃度低的樣品CT值明顯提前了，由熔解曲線可知對于濃度低的樣品，引物二聚體引起的誤差非常嚴重。實驗中污染的防控1、熒光定量PCR實驗中污染源的分析（1）、PCR產(chǎn)物引起的污染 在檢測過程中，熒光定量PCR產(chǎn)物都是封閉在PC

16、R管中的，不存在開管檢測，所以有污染的話，最有可能是因為電泳檢測熒光定量PCR產(chǎn)物時引起的污染，只要將電泳室與PCR加樣室隔離開，就能有效的避免PCR產(chǎn)物的污染。（2）、標準品引起的污染 常用的標準品有含有目的基因的質(zhì)粒、純化后的PCR產(chǎn)物等，由于標準品的濃度是一系列從高到低梯度稀釋的，所以在稀釋過程中，有可能引起污染。（3）、高濃度的樣品引起的污染 高濃度的陽性樣品在加樣過程中可能會形成氣溶膠，造成污染。2、熒光定量PCR實驗中污染的防控（1）、對于PCR產(chǎn)物引起的污染 最簡單有效地辦法就是將電泳室與加樣室徹底隔離開，做到每個房間都有專屬的移液器，做到移液器專用；或者采用dU代替dT配合UNG酶，是解決PCR產(chǎn)物污染的有效辦法，但是成本較高。（2）、對于標準品引起的污染 目前只能是以預防，加標準品時最好采用專用移液器，不要和加樣的移液器交叉使用，加標準品時最好在通風廚中進行，和加樣的操作臺隔離開。（3）、對于樣品間的檢查污染 樣品間的交叉污染往往是因為高濃度的樣品在加樣室形成了氣溶膠，因為樣品的cDNA鏈較長，經(jīng)常開紫外燈，把長鏈c