聚合酶鏈式反應Polymerase Chain Reaction

1、聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應Polymerase Chain Reaction上海第二醫(yī)科大學 檢驗系 樊綺詩PCR技術技術由美國Cetus公司K.Mullis 于1983年建立能在體外復制已知序列的DNA片段具有擴增效率高和特異性強的特點為生命科學領域的研究開創(chuàng)了嶄新時代PCR原理原理5533d.NTPs耐熱DNA聚合酶引物5353535353535353添加反應混合液添加反應混合液及樣本及樣本變性變性535353535353退火退火加入試管中加入試管中延伸延伸53535353繼續(xù)延伸繼續(xù)延伸535355TaqTaq353TaqTaq55循環(huán)循環(huán)PCR原理原理5353535355335353

2、第二個循環(huán)第二個循環(huán)4個拷貝個拷貝第三個循環(huán)第三個循環(huán)8個拷貝個拷貝53535353535353535353533553535353第第n個循環(huán)個循環(huán)2n個拷貝個拷貝PCR原理原理PCR的反應體系參與PCR反應的主要成份:模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和緩沖液等。PCR的反應條件 反應溫度（變性、退火、延伸）反應時間（變性、退火、延伸）循環(huán)次數(shù)（PCR效率及產(chǎn)物量）變性溫度和時間 模板DNA充分變性是PCR順利進行的前 提。在PCR擴增開始的第一次變性時， 應給 予足夠的時間和溫度，使基因組DNA充分變 性。一般在940C變性510 min。進入循環(huán)反 應后以94變性3040s,

3、足以使模板DNA雙 鏈變性。 退火溫度和時間 PCR反應的特異性取決于退火時引物 模板的特異結合。退火溫度一般低于引物 Tm50C左右，退火溫度越高，產(chǎn)物的特異 性也越高；被擴增片段越大，退火所需時 間也相應延長。 延伸溫度與時間 延伸溫度設為72， 因為Taq DNA聚合酶在72時具較高的酶促活性，有利于DNA的復制。延伸時間視產(chǎn)物長度而異，時間過長易導致非特異性擴增。模 板 (template) 模板就是將要被復制的核酸片段（包括基 因組DNA和RNA、質(zhì)粒DNA和線粒體DNA 等）模板DNA須有較高的純度模板加入量影響PCR效率和產(chǎn)物的特異性引 物（Primers) 化學合成的寡核苷酸能

4、與模板特異地結合引物決定產(chǎn)物的特異性和長度引物設計時必須遵循一些原則 引物設計基本原則PCR反應的引物需要二條，分別設在被 擴增目的片段的二端，并分別與模板正 負鏈序列互補引物的長度一般以1825個核苷酸為宜二條引物之間（尤其在3端）的序列不 可有互補，以免形成引物二聚體 引物的堿基組成應平衡，避免出現(xiàn)嘌呤、 嘧啶堿基堆積 引物設計基本原則引物的3端尤其要避免重復的CG堿基序列 二條引物的Tm值不能差別太大 Tm=2（A+T）+4（C+G） 合成引物時在其5端可以加修飾成份設計引物最好用電腦軟件進行分析 脫氧核苷三磷酸（dNTP） 是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4種脫氧 核苷三磷酸的

5、混合物 反應體系中各種核苷酸的濃度必須一致 濃度過高雖能加快反應速度，但非特異 性擴增也隨之增加 DNA聚合酶從一種生活在熱泉（8090）中的水棲 噬熱菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取， 有很高的耐熱穩(wěn)定性 Taq 酶的作用: 催化DNA合成。即在模板指導下，以dNTP 為原料，在引物3-OH末端加上脫氧單核苷 酸，形成3, 5 -磷酸二酯鍵，使DNA鏈沿 53方向延伸 鎂離子濃度鎂離子濃度是一個至為關鍵的因素，對于反應 系統(tǒng)本身、穩(wěn)定核苷酸和提高Taq 酶的活性十分重要雖然Taq 酶的活性只與游離的Mg2+濃度有關， 但PCR反應體系中dNTP、引物、模板DNA及 鰲

6、合劑的存在均可與Mg2+結合而降低游離 Mg2+的濃度從而影響酶的活性。配制PCR反應體系（例）PCRPCR反應體系反應體系(25(25m ml l) ) 試劑濃度試劑濃度體積體積( (m ml)l)終濃度終濃度去離子水去離子水 15.815.8 正向引物正向引物10 10 m mmolmol/L/L1.0 1.0 0.40.4m mmolmol/L/L反向引物反向引物10 10 m mmolmol/L/L1.0 1.0 0.40.4m mmolmol/L/L1010PCRPCR反應緩沖液反應緩沖液10102.5 2.5 1 1鎂離子鎂離子25 25 mmolmmol/L/L2.5 2.5 2

7、.52.5mmolmmol/L/LdNTP dNTP 25 25 mmolmmol/L/L0.2 0.2 200200m mmolmol/L/LTaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶1 1U/U/m ml l1.0 1.0 0.040.04U/U/m ml l模板模板DNADNA100100ngng/ /m ml l1.0 1.0 4.04.0ngng/ /m ml l 其它反應因素 pH應保持在酶反應所需的最適pH鹽濃度（引物與模板雜交率、雜交體穩(wěn)定性 及聚合酶的活性）二甲亞砜（DMSO）能破壞模板的二級結構牛血清白蛋白或明膠等基質(zhì)可以保護Taq 酶 的活性循環(huán)次數(shù) 重復次數(shù)一般設為253

8、5個循環(huán)35個循環(huán)以后由于反應體系中各種反應組分的消耗和反應副產(chǎn)物的產(chǎn)生，此時擴增產(chǎn)物量不再隨 循環(huán)次數(shù)的增加而呈指數(shù)增長，即反應已處于平 臺期n指數(shù)增長期n線形增長期n平臺期循環(huán)數(shù) # 理論值 實際值Log 產(chǎn)物DNAPCR過程的實時監(jiān)測 相對定量PCR設計相對定量PCR實驗方案時須注意：預先確定最佳模板量和PCR循環(huán)數(shù)，使所 采用的各反應參數(shù)在擴增指數(shù)范圍內(nèi)，避 免平臺效應。“管家基因”與靶基因同管擴增，擴增產(chǎn)物 的長度應有所不同，以保證電泳能將兩者 分離開。 理論值實際值Log 產(chǎn)物DNA絕對定量絕對定量 PCR1.外參照系統(tǒng)的設置2.內(nèi)參照系統(tǒng)的設置 實時定量 PCR 對核酸擴增反應進

9、行直接和動態(tài)的監(jiān)測， 實現(xiàn)對靶基因的實時定量分析TaqManTM5533d.NTPsThermal Stable DNA PolymerasePrimers5353535353535353Add Master Mix and SampleDenaturation535353535353AnnealingReaction TubeTaql53RQProbe53RQ5353TaqManTMExtension Step531. Strand DisplacementTaq3QR5533QTaqR52. Cleavage3. PolymerizationComplete53QTaqR354. Dete

10、ction533QTaqR5l lR53RQPCR產(chǎn)物的檢測凝膠電泳分析： 瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳酶切分析分子雜交 Southern印跡雜交、斑點雜交核酸序列分析DNA突變的PCR檢測技術PCR-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP） 等位基因特異性寡核苷酸 （allele specific oligonucleotide, ASO）單鏈構象多態(tài)性（single strand conformation polymorphism, SSCP） 變性梯度凝膠電泳（DGGE） 融點曲線分析（melting curve analysis）PCR產(chǎn)物的序列分析 PCR-SSCP單鏈DNA分

11、子具有特定的二級空間構象，取決于該分子本身的堿基組成。突變DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后產(chǎn)生與正常DNA空間構象不同的兩條單鏈在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中時，不同構象的單鏈片段具有不同的電泳遷移率，從而能區(qū)別正常與突變的DNA 不同順序 不同構象 不同電泳行為 SSCP技術檢測技術檢測DNA突變突變sSouthern印跡雜交印跡雜交 DGGE是一種篩選單堿基突變及多態(tài)性的方法。DGGE檢測突變的原理是基于給定DNA雙鏈的解鏈溫度因存在突變而發(fā)生改變加以測定。DGGE的突變檢出率可達90%100%。 變性梯度凝膠電泳變性梯度凝膠電泳 (DGGE)DGGE檢測檢測DNA突變突變PCR產(chǎn)物的序列分析 主

12、要見于分子克隆時對于目的基因擴 增片段的序列鑒定以及對致病基因檢測時 分析擴增片段中點突變的位置和性質(zhì)。 可將產(chǎn)物純化后作為模板直接測序， 也可將PCR產(chǎn)物克隆入載體后再測序，后 者測序的效果更好 ，常用T-A克隆。PCR反應的特點特異性強 引物與模板結合的特異性及聚合酶的忠實性 靈敏度高 指數(shù)增長，從pg (10-12)可擴增至 mg (10-6)水平 簡便、快速 24 小時完成擴增對標本的純度要求低 DNA 粗制品及總RNA均可作為擴增模板 PCR技術的質(zhì)量控制實驗室的規(guī)范化設置： 試劑貯存和準備區(qū) 標本制備區(qū) 擴增反應區(qū) 產(chǎn)物分析區(qū) PCR技術的質(zhì)量保證： 基因擴增檢驗的全過程的質(zhì)量保證

13、 室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量評價 PCR實驗系統(tǒng)中的污染源及防污染措施 以PCR為基礎的相關技術逆轉(zhuǎn)錄PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)定量PCR (quantitative PCR )多重PCR (multiplex PCR) 免疫PCR差異顯示PCR (differential display PCR, DD-PCR)PCR誘導定點突變原位PCR (in situ PCR) 圖例圖例 差異顯示差異顯示RT-PCR(Differential display RT-PCR)RT-PCR(Differential display RT-PCR)PCR技術在

14、分子診斷中的應用感染性疾病中病原微生物核酸的檢測單基因遺傳性疾病的基因診斷多基因病相關基因的檢測腫瘤相關基因的檢測移植配型和法醫(yī)學上的應用遺傳性疾病的基因診斷遺傳性疾病的基因診斷 （例：血紅蛋白病中的地中海貧血） 1 2 3 41.正常內(nèi)對照2.Barts水腫標本3.反應體系故障擴增失敗4.分子量標準PCR用于-地貧Barts水腫產(chǎn)前診斷血友病的分子診斷X染色體連鎖隱性遺傳 F基因和F基因發(fā)生突變 血漿凝 血因子和的合成量和（或）質(zhì)的異常 患者反復自發(fā)性出血SSCP、DGGE等檢測技術 DMD的分子診斷X染色體連鎖隱性遺傳性肌肉疾病，發(fā)病率 為1/3 500個男孩DMD基因位于Xp21.2-21.3，全長2500Kb DMD基因的突變導致dystrophin缺陷檢測DMD基因的技術： Southern印跡、多重PCRPCR在移植配型上的應用 二十世紀80年代后期，分子生物學技術被引入HLA領域，人們在PCR基礎上發(fā)展了各