單分子檢測(cè)與熒光相關(guān)光譜

1、單分子熒光檢測(cè)與熒光相關(guān)光譜分子發(fā)光分析分子發(fā)光分析主要內(nèi)容：主要內(nèi)容：熒光相關(guān)光譜在單分子檢測(cè)中的應(yīng)用單分子熒單分子熒光檢測(cè)光檢測(cè)熒光相關(guān)光譜分子發(fā)光分析概述概 念：?jiǎn)畏肿訜晒鈾z測(cè)是檢測(cè)靈敏度達(dá)到分子水平的一系列高靈敏檢測(cè)技術(shù)的總稱(chēng)。已經(jīng)達(dá)到了分子檢測(cè)靈敏度的極限。它能對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行檢測(cè)和成像，而且可以通過(guò)對(duì)單分子的光譜性質(zhì)進(jìn)行測(cè)量，從而對(duì)化學(xué)反應(yīng)的途徑進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，能對(duì)生物大分子進(jìn)行探測(cè)并提供分子結(jié)構(gòu)與功能之間的信息。其檢測(cè)的空間尺度能達(dá)到納米數(shù)量級(jí)。分子發(fā)光分析概述概述1.單分子檢測(cè)的理論意義: 通常對(duì)大量分子集合體的觀察測(cè)量只能反映分子的平均效應(yīng)，這種平均效應(yīng)掩蓋了許多特殊的信息；而這

2、些特殊的信息在研究具有非均勻特性的凝聚相物質(zhì)和生物大分子結(jié)構(gòu)式顯得尤為重要。 體系中各個(gè)分子的變化過(guò)程與時(shí)間密切相關(guān)，單分子檢測(cè)可以對(duì)體系中的單個(gè)分子進(jìn)行研究；單分子的特征對(duì)局部場(chǎng)的存在非常敏感，可以反映局部微觀環(huán)境的信息?？梢缘玫皆谔厥鈺r(shí)刻，特定分子的特殊位置和行為。 采用單分子效應(yīng)可能觀察到未知領(lǐng)域的新效應(yīng)。如單分子體系的波動(dòng)行為或不確定行為。分子發(fā)光分析概述2.單分子熒光的產(chǎn)生原理：?jiǎn)畏肿訜晒獾漠a(chǎn)生原理：熒光的產(chǎn)生原理可以用右圖來(lái)描述：S0、S1、S2分別表示分子基態(tài)、第一和第二激發(fā)單重態(tài)。T1為激發(fā)三重態(tài)，分子吸收光子后，被激發(fā)到S1、S2較高的能級(jí)之后，迅速弛豫到S1的最低震動(dòng)能級(jí)，

3、然后發(fā)射一個(gè)熒光光子，同時(shí)使分子回到S0的較高激發(fā)態(tài)，并弛豫迅速到S0的最低震動(dòng)能級(jí)。分子便處于新一輪的激發(fā)和發(fā)射循環(huán)。分子發(fā)光分析概述 根據(jù)熒光壽命和分子在激光束中停留時(shí)間,可算出單個(gè)分子發(fā)射的最大光子數(shù)為105106。目前光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)收集、檢測(cè)光子的效率約為1%或0.5%5%,故單個(gè)分子仍可被檢測(cè)到數(shù)千光子信號(hào)。 檢出限約為10-13mol/L分子發(fā)光分析概述3.兩個(gè)基本要求：在被照射的體積中只有一個(gè)分子與光子發(fā)生相互作用，可以通過(guò)調(diào)整體系的濃度或密度來(lái)實(shí)現(xiàn)。單分子的新號(hào)要大于背景的干擾信號(hào)，要減少拉曼散射、瑞利散射及其它雜質(zhì)熒光造成的干擾?？s小探測(cè)體積能有效減少背景干擾。分子發(fā)光分析概述

4、4.單分子熒光的特征： 量子跳躍發(fā)射暗態(tài)交替的量子跳躍過(guò)程是單分子熒光的典型特征，取決于單分子的周?chē)h(huán)境和猝滅途徑，是實(shí)驗(yàn)中單分子熒光光譜和熒光強(qiáng)度漲落現(xiàn)象的原因。 熒光偏振單分子熒光分子具有唯一的固有熒光和吸收躍遷偶極矩，分子只吸收偏正方向與其偶極矩方向一致的光子。因此在偏振激光的激發(fā)下，通過(guò)測(cè)量單個(gè)分子的吸收和熒光的偏振方向，可以確定單個(gè)熒光分子的空間取向。分子發(fā)光分析23.1單分子的可檢測(cè)能力影響分子檢測(cè)能力的因素： 由于樣品中雜質(zhì)產(chǎn)生的背景干擾； 溶劑雜質(zhì)熒光產(chǎn)生的背景干擾； 分子不同,熒光量子產(chǎn)率等光物理性質(zhì)不同,導(dǎo)致發(fā)射的光子數(shù)不同；提高分子檢測(cè)能力的方法： 單分子信號(hào)與探測(cè)體積無(wú)

5、關(guān),而背景正比于探測(cè)體積，采用pL(皮升)、或fL（飛升）級(jí)探測(cè)體積； 結(jié)合光譜濾波和時(shí)間分辨等技術(shù)。23.1單分子的可檢測(cè)能力分子發(fā)光分析羅丹明6G是單分子檢測(cè)常用的一種熒光染料，右圖顯示了羅丹明6G的發(fā)射光譜和溶劑乙二醇的拉曼光譜圖。相對(duì)于單個(gè)羅丹明6G分子的水的拉曼散射強(qiáng)度分子發(fā)光分析23.2全內(nèi)反射和共聚焦光學(xué)系統(tǒng)23.2.1全內(nèi)反射（TIR）分子發(fā)光分析23.2全內(nèi)反射和共聚焦光學(xué)系統(tǒng)23.2.2共聚焦光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng) 通過(guò)物鏡照明的方法叫落射照明； 入射光能激發(fā)照射錐里面所有的熒光團(tuán)； 發(fā)射光通過(guò)物鏡被回收，稱(chēng)為熒光配置； 散射光被雙色向?yàn)V光鏡分離出來(lái)； 雙色向?yàn)V光鏡是一種能透過(guò)一些波

6、長(zhǎng)的光，二反射其他波長(zhǎng)的光的裝置。共聚焦光學(xué)檢測(cè)原理檢測(cè)器激發(fā)光發(fā)射光濾光鏡分子發(fā)光分析23.3SMD光學(xué)裝置幾乎所有的單分子熒光檢測(cè)器都使用光學(xué)裝置限制觀察體積。在寬視場(chǎng)檢測(cè)和逐點(diǎn)檢測(cè)中用到了不同的方法。在寬視場(chǎng)檢測(cè)中最常用的是全內(nèi)反射，右圖是兩種常用的寬視場(chǎng)檢測(cè)方法。兩種方法都是基于倒置顯微鏡。使用第一種方法是要使入射光瞄準(zhǔn)物鏡的焦點(diǎn)。棱鏡物鏡濾光器電感耦合攝像機(jī)更直接更方便綠色熒光蛋白圖像分子發(fā)光分析23.3SMD光學(xué)裝置另一種限制檢測(cè)體積的方法是共焦光學(xué)和逐點(diǎn)檢測(cè)，其所用的是一種光子探測(cè)器（SPAD），其原理如右圖所示。單點(diǎn)檢測(cè)器的存在，使樣品不直接成像。一個(gè)時(shí)間點(diǎn)之觀察一個(gè)點(diǎn)。光纖單

7、分子熒光蛋白共焦熒光圖像分子發(fā)光分析23.4SMD檢測(cè)設(shè)備23.4.1用于單分子檢測(cè)的檢測(cè)器SPAD（光子探測(cè)器）單分子單點(diǎn)測(cè)量?jī)?yōu)選檢測(cè)器，有以下優(yōu)點(diǎn)： SPAD連同單光子計(jì)數(shù)電子設(shè)備，只需一個(gè)5伏的電源即可工作； 量子效率更高，能達(dá)到60%90%； 背景計(jì)數(shù)率低，能見(jiàn)效背景干擾；CCD（電感耦合檢測(cè)器）用于單分子成像 由一個(gè)像素陣列構(gòu)成，每個(gè)像素點(diǎn)都是一個(gè)獨(dú)立的檢測(cè)器； CCD不是光子計(jì)數(shù)探測(cè)器，而是一種集成探測(cè)器，每個(gè)像素點(diǎn)的信號(hào)正比于入射光子的數(shù)量； 像素點(diǎn)的噪音不會(huì)隨時(shí)間二增加，且有較高的量子效率。分子發(fā)光分析23.4SMD檢測(cè)設(shè)備23.4.2SMD濾波器在單分子檢測(cè)中，除去激發(fā)波長(zhǎng)處

8、的散射光的影響是非常必要的。根據(jù)原理的的不同可以分為全息陷波濾波器和梳狀陷波濾波器。全息陷波濾波器吸收光譜圖分子發(fā)光分析23.4SMD檢測(cè)設(shè)備23.4.2SMD濾波器在532nm的激發(fā)光下，選用不同的濾光器檢測(cè)尼羅紅得到的光譜圖。陷波濾波器、長(zhǎng)波通濾波器、雙色向?yàn)V波器。通過(guò)特定的發(fā)射濾波器是尼羅紅的熒光強(qiáng)度明顯減弱。分子發(fā)光分析23.5單分子光物理性質(zhì)的研究 在高光照條件下檢測(cè)室會(huì)發(fā)生熒光閃爍現(xiàn)象，這種單一熒光團(tuán)的閃爍可以簡(jiǎn)單的光物理模型進(jìn)行解釋?zhuān)瑹晒鈭F(tuán)閃爍的主要來(lái)源是系統(tǒng)的交叉三重態(tài)。 如果背景信號(hào)來(lái)自自發(fā)熒光，那么入射強(qiáng)度的增強(qiáng)不會(huì)引起信噪比的增加。 在開(kāi)始時(shí)，隨著如射強(qiáng)度的增加，光子計(jì)數(shù)

9、率呈直線增加，并很快達(dá)到最大值。四甲基羅丹明標(biāo)記的脂質(zhì)分子的光子計(jì)數(shù)率分子發(fā)光分析23.6單分子熒光檢測(cè)的生化應(yīng)用23.6.1單分子酶動(dòng)力學(xué)單分子酶催化反應(yīng)示意圖 用熒光標(biāo)記的酶分子或底物反應(yīng)，在反應(yīng)過(guò)程中會(huì)發(fā)生酶的構(gòu)型變化，使綠色熒光的量子產(chǎn)率增加，引起綠色熒光強(qiáng)度的增加；通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)過(guò)程中熒光強(qiáng)度的變化，對(duì)酶促反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，從而獲得與酶促反應(yīng)有關(guān)的豐富的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。底物分子酶分子分子發(fā)光分析23.6單分子熒光檢測(cè)的生化應(yīng)用23.6.2單分子ATP酶活性研究肌球蛋白的S1亞基通過(guò)白蛋白-生物素-卵蛋白涂層結(jié)合到玻璃表面，在S1片段上有一個(gè)ATP酶活性，能切割Cy3標(biāo)記的ATP。蛋白質(zhì)也有Cy3標(biāo)記，使得單一酶分子位于滑道上，ATP酶標(biāo)簽定位后，綁定在S1片段上的Cy3被光漂白，以消除其散射光的影響。當(dāng)Cy3-ATP / ADP酶固定化之后，會(huì)發(fā)生熒光強(qiáng)度的瞬時(shí)增加。分子發(fā)光分析23.7單分子熒光檢測(cè)的其他應(yīng)用A. 單分子熒光壽命估算B. 單分子取向成像