第十章 有機(jī)高分子

1、HPLC是現(xiàn)在生物分離分析的重要手段，具有分離效率高、選擇性好、適應(yīng)面廣（對(duì)被分離物質(zhì)大小、含量、性質(zhì)和操作方法）、產(chǎn)品純度高和重復(fù)性好等特點(diǎn)。HPLC的核心是在于分離柱填料。HPLC的分類(lèi)按分離機(jī)理：基于吸附分配的反/正相及疏水色譜，基于電荷作用的離子交換、基于空間排阻的凝膠層析/凝膠滲透，基于生物特異作用的親和色譜等。按填料性質(zhì)分：有機(jī)和無(wú)機(jī)填料色譜。有機(jī)填料的優(yōu)越性： 以多糖和有機(jī)基質(zhì)骨架，易于改性。 理化穩(wěn)定性好，耐酸、堿和溶劑，反復(fù)使用。 生物相容性好，非特異吸附少。 高負(fù)載，高容量。非常適合生物活性分子，有機(jī)高分子的剛性普遍不如無(wú)機(jī)填料，淋洗過(guò)程會(huì)膨脹或皺縮。一、填料的物理結(jié)構(gòu)填料

2、的色譜動(dòng)力學(xué)受粒度及粒度分布、孔徑與孔徑分布、粒度強(qiáng)度和表官形態(tài)等影響。色譜對(duì)填料在物理性質(zhì)上的要求： 合適的粒度大小和狹窄的粒度分布范圍，能單分散最好。 剛性好，一定的顆粒強(qiáng)度，滿(mǎn)足高速高壓操作要求。若為多孔結(jié)構(gòu)填料，除達(dá)到孔徑大小和分布外，盡量避免形態(tài)復(fù)雜的微孔結(jié)構(gòu)。使用時(shí)填料融脹/收縮不能超出規(guī)定用允許范圍。常用HPLC填料按物理形態(tài)可分為：1、多孔型 又分小孔30nm; 超大孔100nm。2、非多孔型 整體顆粒無(wú)孔。3、薄殼型 內(nèi)部無(wú)孔，表面層為多孔結(jié)構(gòu)。實(shí)踐上以高負(fù)載量的多孔型最常用，特別是大孔和超大孔gel。顆粒大小也各不一樣，工業(yè)化生產(chǎn)中使用大粒度填料便于操作。上世紀(jì)80年代以來(lái)

3、，填料研究在一些方面取得了可喜的進(jìn)步：顆粒單分散填料具貫穿性超大孔結(jié)構(gòu)填料 如貫流色譜填料顆粒含600-800nm貫穿孔，貫穿孔內(nèi)連接80-150nm的擴(kuò)散孔。小顆粒非多孔填料 避免了非特異性吸附，效率高時(shí)間短。二、填料的化學(xué)結(jié)構(gòu)色譜的化學(xué)熱力學(xué)行為決定于其填料化學(xué)結(jié)構(gòu)（特別是顆粒外表面和內(nèi)孔表面化學(xué)結(jié)構(gòu)）。既要有選擇性分離的化學(xué)結(jié)構(gòu)，又要良好的化學(xué)和熱穩(wěn)定性以及極低的非特異性吸附。HPLC填料按結(jié)構(gòu)分為：1、離子交換色譜填料 顆粒表面帶某種電荷的可交換基團(tuán)。2、反相色譜填料 顆粒表面含C8、C18烷基/苯基強(qiáng)疏水基團(tuán)/鏈段。3、正相色譜填料 顆粒表面含羥基、氨基、羧基醚鏈等極性基團(tuán)/鏈段。4

4、、疏水相互作用色譜填料 顆粒表面含C1、C4烷基、笨基、PEG等弱疏水基團(tuán)/鏈段。5、空間排除色譜填料 有親水和親油2類(lèi)，用于水相體系的含羥基的親水基團(tuán)；非水相的含疏水基團(tuán)。6、親和色譜填料 顆粒表面帶特異性配基。對(duì)基質(zhì)材料經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾，才能制備成合適的色譜填料，滿(mǎn)足不同色譜技術(shù)的需要?；|(zhì)材料/載體 是色譜填料的支撐骨架，決定填料的顆粒大小與分布、顆粒強(qiáng)度、孔徑大小與分布、孔的結(jié)構(gòu)形態(tài)、顆粒內(nèi)部的化學(xué)結(jié)構(gòu)和其穩(wěn)定性等，也影響對(duì)顆粒表面的化學(xué)修飾的實(shí)施。常見(jiàn)有機(jī)高分子類(lèi)型填料的基質(zhì)樹(shù)脂可分為：多糖型 天然多糖原料用物理方法加工成微珠并交聯(lián)成凝膠。聚合物型 將合成單體/交聯(lián)劑用化學(xué)聚合成交聯(lián)高聚

5、物微球。一、多糖型基質(zhì)材料親水性樹(shù)脂無(wú)須改性可直接用于凝膠過(guò)濾色譜1、葡聚糖系凝膠 由葡聚糖和環(huán)氧氯丙烷偶聯(lián)制成。早期的軟凝膠系列Sephadex G-x，強(qiáng)度低，粒度分布寬，改進(jìn)型有高交聯(lián)羥丙基化葡聚糖 Sephasorb HP Uitrafine 以及烯丙基葡聚糖和甲叉雙丙烯酰氨交聯(lián)共聚凝膠 Sephacryl系列，剛性好，柱壓低適合高流速色譜。2、瓊脂糖系凝膠 傳統(tǒng)的Sepharose，Bio-gel A，Ultragel A軟膠系列。改進(jìn)型Sepharose CL系列， Sepharose Fast Flow， Sepharose High Performance等。二、聚合物型基質(zhì)材

6、料 比多糖型凝膠的機(jī)械強(qiáng)度大，化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定，更適合于高速高壓的HPLC操作。按結(jié)構(gòu)形態(tài)分為多空型和非多空型；按性能分有親水及疏水凝膠。1、交聯(lián)聚苯乙烯樹(shù)脂 苯乙烯與二乙烯基苯的交聯(lián)共聚物微球，Rohmhaas 的AmberliterXAD系列、Hamilton Co. 的PRP-1、 Hitachi gel 3010、3011系列等。具顆粒小而均勻，單分散，貫穿性超大孔的特性。 不改性的這類(lèi)樹(shù)脂也可用于色譜操作。2、交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯類(lèi)樹(shù)脂以甲基丙烯酸的甲酯、丁酯、羥基乙酯、環(huán)氧丙酯等為原料為單體制備的多型高聯(lián)高聚物微球。Spheron、 Shodex OH pak、Hitachi Gel

7、3020等系列凝膠，具有 良好的親水性和剛性。3、其他類(lèi)型樹(shù)脂TSK gel PW from Toyosoda co.Toyopearl 系列Asahipad GS系列顆粒剛性好，粒度分布范圍窄。一、填料物化性質(zhì)的表征顆粒大小dp（m）與分布 用顯微鏡觀察或粒度分布儀測(cè)定。填料比表面積S（m2/g） BET方法測(cè)定。BET是三位科學(xué)家（Brunauer、Emmett和Teller）的首字母縮寫(xiě)，三位科學(xué)家從經(jīng)典統(tǒng)計(jì)理論推導(dǎo)出的多分子層吸附公式基礎(chǔ)上，即著名的BET方程，成為了顆粒表面吸附科學(xué)的理論基礎(chǔ)，簡(jiǎn)單說(shuō)就是從BET公式可以計(jì)算樣品的單層吸附量Vm，再由相關(guān)公式算出樣品的比表面積。 填料骨

8、架密度g(g/ml)、溶劑吸收量Sr(ml/g)、溶脹因子 f 等參數(shù)，可用中科院施良和的方法測(cè)定。填料的比孔體積Vp(ml/g)，可據(jù)Sr、f、g值按公式計(jì)算。 Sr=fVp+ （f-1）/ g填料孔度的計(jì)算 Vp = Vp +1/g填料孔徑大小與分布測(cè)定：毛細(xì)管聚凝聚法、壓汞法及電經(jīng)法?？椎慕Y(jié)構(gòu)形態(tài)可以?huà)呙桦婄R直接觀察，也可行色譜分析或其他性質(zhì)測(cè)量。填料化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)、pH適應(yīng)交換容量等用其他常規(guī)方法測(cè)定。二、填料色譜性能的表征不同色譜方法各有其特定的性能指標(biāo)，但又包括一些共同的基本參數(shù)。1、保留值 tR指樣品在填充柱中的滯留時(shí)間；若以體積表示即為保留體積。 VR= tRFc 為Fc流動(dòng)相

9、流速。 扣除不保留物質(zhì)的流出時(shí)間（死時(shí)間 t0），得到調(diào)整保留值： tR = tR t0 ； VR= VR t0Fc tR tR k = - 1 = t0 t0k即容量因子 ，與固定相流動(dòng)相性質(zhì)和柱溫有關(guān)。2、選擇性a表示相鄰二物質(zhì)保留時(shí)間的比值 tR2 1+ k2 a = = tR1 1+ k1a與固相種類(lèi)、 流動(dòng)相組成及溫度有關(guān)。3、柱效率以理論踏板數(shù)（N）表示 N=5.54（Tr/2t1/2） t1/2 為色譜峰的半高寬。用理論踏板高度表示的柱效為 H = L / N4、填充柱的總孔隙度和穿透性5、分離度R是相鄰2色譜峰的保留值之差與各自底峰寬（tW1和tW2）一半之和的比值。是色譜柱分

10、離效能的綜合指標(biāo)。 反相色譜（RPC）是HPLC的分支，目前仍然使用硅膠基質(zhì)的鍵合相填料為主的填充材料的色譜柱。其特點(diǎn)是顆粒剛性好利于傳質(zhì)柱效高選擇性好pH適應(yīng)范圍2-8之間，不如其他有機(jī)填料基質(zhì)表面的硅羥基可能使蛋白樣品失活。保留機(jī)理還不清楚，有的認(rèn)為是分配作用，有的說(shuō)是吸附作用。 微球形交聯(lián)聚苯乙烯樹(shù)脂，是高分子基質(zhì)的RPC填料，可在廣泛的pH1-212-14范圍使用，樹(shù)脂表面有較強(qiáng)的疏水作用。多孔填料應(yīng)根據(jù)被分離物質(zhì)大小選擇合適孔徑的填料，除多孔型填料外，非多孔型填料也在RPC中 得到推廣使用。 非多孔型填料的特點(diǎn)：粒度小、剛性好、柱效高、分辨率高，特別適合少量和微量樣品的分析與分離。教

11、材P194列出了部分RPC填料的參數(shù)與特性。利用樣品與固相表面基團(tuán)之間電荷的相互作用達(dá)到分離目的。表現(xiàn)為離子離子、偶極與離子間或著其他動(dòng)態(tài)平衡的作用力，有4種交換方式。已非常廣泛地應(yīng)用于分析檢測(cè)和分離純化的操作手段。特點(diǎn)：pH適應(yīng)廣、使用壽命長(zhǎng)、大容量、低非特異性吸附一、多糖基質(zhì)的IEC層析介質(zhì)基質(zhì)骨架為葡聚糖、瓊脂糖或釬維素構(gòu)成，有良好的親水性和生物相容性，容量大，價(jià)格低。隨著制備技術(shù)發(fā)展，一些顆粒強(qiáng)度和均勻性更好的高度聯(lián)多糖類(lèi)凝膠不斷涌現(xiàn)，在保持原有類(lèi)型介質(zhì)優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，也能在適當(dāng)壓力和較高流速下操作。教材P197表10-2列出了部分多糖基質(zhì)IEC介質(zhì)的特性。二、聚合物基質(zhì)的高效IEC填料常

12、見(jiàn)的有以交聯(lián)共聚的苯乙烯-二乙烯為基質(zhì)或其他交聯(lián)高聚物基質(zhì)填料。按所帶基團(tuán)分為：強(qiáng)堿性陰離子型（含季胺鹽）弱堿性陰離子型（伯、仲氨基）、強(qiáng)酸性陽(yáng)離子型（磺酸基）、 弱酸性陽(yáng)離子型（羧基），具體參見(jiàn)教材P198表10-3的內(nèi)容。1、多孔樹(shù)脂的IEC填料以多孔交聯(lián)聚苯乙烯微球?yàn)榛|(zhì)，代表了今年來(lái)高效IEC填料新的發(fā)展水平。在柱效、分離度、負(fù)載量和回收率等方面性能卓越。Mono Beads、SOURCE、POROS三類(lèi)系列產(chǎn)品。大孔親水性高聚物羥基化聚醚凝膠為基質(zhì)的IEC填料，目前應(yīng)用也很廣，是在原有親水凝膠過(guò)濾色譜填料的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的。如TSK gel DEAE-5pw、SP-5PW、CM-5P

13、W等。粒度小、大孔徑、中等交換容量。以親水性大孔交聯(lián)聚甲基丙烯酸羥基乙酯微球?yàn)榛|(zhì)的IEC填料，也占有重要地位。2、非多孔樹(shù)脂的IEC填料主要包括親水性 高聚物即羥基化聚醚、交聯(lián)聚苯乙烯、交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯及交聯(lián)瓊脂糖等。表面結(jié)構(gòu)與多孔性型產(chǎn)品類(lèi)似。粒度?。◣孜⒚祝?，顆粒均勻、剛性好、穿透力強(qiáng)、流速適應(yīng)范圍廣、低負(fù)載量、避免溶質(zhì)在固相內(nèi)部的吸附與擴(kuò)散。如 TSK gel DEAE-NPR、SP-NPR等。對(duì)改善柱效、提高分離回收率、保持大分子生物活性非常有利。但對(duì)分子量小于1000的小肽混合物，效果不令人滿(mǎn)意。用于分離寡核苷酸效果很好，常用于核酸合成的的處理。IEC在快速分離分析和微量樣品分離

14、檢測(cè)與制備中有廣闊的前景。3、薄殼型樹(shù)脂的PEC填料在HPLC發(fā)展初期時(shí)比價(jià)盛行，一定程度上堅(jiān)固了多孔和非多孔填料的部分優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在逐漸被多孔和非多孔填料代替了。三、高聚物型離子色譜填料離子色譜產(chǎn)生于上世紀(jì)70年代中期，依賴(lài)高靈敏的電導(dǎo)檢測(cè)器、高柱效低交換容量分離柱填料及消除淋洗背景離子干擾技術(shù)的進(jìn)步。能夠快速靈敏低測(cè)定各種痕量的陰陽(yáng)離子型物質(zhì)。常見(jiàn)的IC有單柱系統(tǒng)和雙柱系統(tǒng)2類(lèi)。單柱系統(tǒng)將分離柱直接與檢測(cè)器連接；雙柱系統(tǒng)在分離柱與檢測(cè)器之間連接有消除本底電導(dǎo)信號(hào)的抑制系統(tǒng)。雙柱系統(tǒng)填料如Dionex的AS系列（陰離子分析柱）和CS系列（陽(yáng)離子分析柱），均是以交聯(lián)聚苯乙烯為基質(zhì)的具有薄殼結(jié)構(gòu)的離

15、子 交換劑。單柱系統(tǒng)填料為低交換容量的多孔性離子交換劑，如 TSKgel IC-Anion-PW ，TSK gel-IC-Cation-PW。IC成功解決了痕量陰/陽(yáng)離子型物質(zhì)的分析檢測(cè)難題。疏水性相互作用色譜（hydrophobic interaction chromatography, HIC）指采用適度疏水性的固定相指采用適度疏水性的固定相, , 以含鹽的水溶液作為流動(dòng)相分離生物大分子（如蛋白質(zhì)）以含鹽的水溶液作為流動(dòng)相分離生物大分子（如蛋白質(zhì)）鍵合相色譜方法。鍵合相色譜方法。為適應(yīng)生物活性大分子提取，特別是蛋白質(zhì)提取純化而發(fā)展起來(lái)的。原理原理：HIC依賴(lài)溶質(zhì)與填料表面間的弱疏水相互作用

16、實(shí)現(xiàn)物質(zhì)分離純化。在高鹽離子活度溶液中，蛋白質(zhì)分子疏水部分與填料表面產(chǎn)生疏水性相互作用而被吸附，當(dāng)淋洗液離子強(qiáng)度下降后，蛋白質(zhì)按疏水性特征被依次洗脫下來(lái)，疏水性越強(qiáng)，洗脫時(shí)間越長(zhǎng)。特點(diǎn)：采用高鹽進(jìn)樣，中性或接近中性的鹽水溶液洗脫, 樣品的生物活性高，蛋白質(zhì)純度高，高回收率，成本低等。疏水色譜中無(wú)機(jī)鹽的作用與鹽析沉淀蛋白質(zhì)的作用十分相似?；蚪?jīng)親水性處理的有機(jī)高聚物有機(jī)高分子 類(lèi)型HIC填料組成：通常以親水性凝膠微球?yàn)榛|(zhì)，表面再經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾引入疏水性基團(tuán)/鏈段的的樹(shù)脂。填料材料的選擇：基質(zhì)可以是多糖，也可以是高聚物微球。擬選擇的基質(zhì)可以是多孔結(jié)構(gòu)（大孔/超大孔）或非多孔結(jié)構(gòu)，有機(jī)高聚物微球應(yīng)在連

17、接官能團(tuán)之前做疏水性處理。教材P206-7之表10-4列出了部分有機(jī)高分子HIC填料的特性。常見(jiàn)HIC填料的疏水基團(tuán)的疏水性強(qiáng)弱，依官能團(tuán)的不同而不同，一般地苯基辛基丁基異丙基醚鏈。同時(shí)，疏水基團(tuán)的結(jié)構(gòu)和密度是影響生物樣品保留值和色譜柱負(fù)載量的主要因素。多孔型和非多孔型結(jié)構(gòu)的HIC填料，幾十mg/ml樹(shù)脂，如Toyopearl 10-50mg/ml, Macrosphere gel 13-110mg/ml。洗脫方式：高鹽吸附，低鹽洗脫。常用硫酸胺 （與IEC比較？）產(chǎn)品檢測(cè)：光度檢測(cè)；電導(dǎo)檢測(cè)；生化檢測(cè)光度檢測(cè)；電導(dǎo)檢測(cè)；生化檢測(cè)圖 蛋白質(zhì)在疏水柱和反相柱上的分離比較蛋白質(zhì)在疏水柱和反相柱上的

18、分離比較1 細(xì)胞色素細(xì)胞色素 C 2 肌紅蛋白肌紅蛋白 3 溶菌酶溶菌酶TSK 5PW硫酸銨從硫酸銨從1.7減少到減少到0.1mol/LRP-304乙腈從乙腈從0增增加到加到100%空間排阻色譜（size exclusion chromato- graphy,SEC）根據(jù)溶質(zhì)分子尺寸根據(jù)溶質(zhì)分子尺寸(分子量、有效分子量、有效體積、流體力學(xué)體積體積、流體力學(xué)體積)的差別進(jìn)行分離的。主要的差別進(jìn)行分離的。主要應(yīng)用于高分子化合物和聚合物的分子量分布測(cè)定，應(yīng)用于高分子化合物和聚合物的分子量分布測(cè)定，在生物化學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。在生物化學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。與液相色譜液相色譜根

19、據(jù)樣品組分在固定相和流動(dòng)相之間根據(jù)樣品組分在固定相和流動(dòng)相之間的平衡分配系數(shù)差別，的平衡分配系數(shù)差別， 造成不同的移動(dòng)速度而造成不同的移動(dòng)速度而達(dá)到分離的機(jī)制不同。達(dá)到分離的機(jī)制不同。 SEC方法包括包括:1、凝膠過(guò)濾色譜、凝膠過(guò)濾色譜(GFC):,以水為流動(dòng)相以水為流動(dòng)相2、凝膠滲透色譜、凝膠滲透色譜(GPC): 以有機(jī)溶劑為流動(dòng)以有機(jī)溶劑為流動(dòng)該方法能簡(jiǎn)便迅速分離分離大小差異較大的組分。該方法能簡(jiǎn)便迅速分離分離大小差異較大的組分。非常適合分析樣品組分分布情況，以及純化的最非常適合分析樣品組分分布情況，以及純化的最后脫鹽等操作。后脫鹽等操作。一、一、SEC填料的一般特性與色譜指標(biāo)填料的一般特

20、性與色譜指標(biāo)填料的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)必須與淋洗體系相匹配，不能填料的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)必須與淋洗體系相匹配，不能與試劑和溶質(zhì)分子發(fā)生任何基團(tuán)間的的相互作用，與試劑和溶質(zhì)分子發(fā)生任何基團(tuán)間的的相互作用，將盡可能避免非空間排阻效應(yīng)（吸附、離子交換、將盡可能避免非空間排阻效應(yīng)（吸附、離子交換、分配層析）。物理結(jié)構(gòu)上粒度均勻，孔徑均勻而分配層析）。物理結(jié)構(gòu)上粒度均勻，孔徑均勻而分布窄，還需要光潔的表面，規(guī)整而通暢的孔結(jié)分布窄，還需要光潔的表面，規(guī)整而通暢的孔結(jié)構(gòu)形態(tài)，較大的孔度及適當(dāng)?shù)目讖酱笮∨c分布。構(gòu)形態(tài)，較大的孔度及適當(dāng)?shù)目讖酱笮∨c分布。SEC填料的色譜表征，除了柱效、選擇性、分離度、穿透性外，還需滿(mǎn)足下面的要求

21、：1、排除極限表示填料可用來(lái)分離物質(zhì)大小的最大極限，超過(guò)該極限物質(zhì)就從填料顆粒間隙穿過(guò)而沒(méi)有分離效果。排除極限取決于填料的最大有效孔徑。2、分離范圍表示填料能物質(zhì)分子量的范圍，分子量高于或低于此范圍的物質(zhì)分別被排除或滲透而不能分離，它取決于有效孔徑的分布范圍。3、固流相比指填料有效孔內(nèi)體積與填料顆粒間隙體積的比值，比值越大越好。反應(yīng)柱子的分離容量，緊密填充時(shí)，比值與填料孔度有關(guān)。二、凝膠滲透色譜填料凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography, GPC) 分離對(duì)象一般是酯溶性的物質(zhì)，相應(yīng)的填料是疏水性的，常用有機(jī)溶劑淋洗體系。影響色譜行為的主要因素是填料顆粒內(nèi)部高聚

22、物超微結(jié)構(gòu)離子堆積的不均一性而使多孔骨架彎曲，產(chǎn)生阻礙的作用，所以致孔技術(shù)非常重要。高分子類(lèi)型的GPC填料主要是交聯(lián)共聚苯乙烯-二乙烯苯多孔微球。按孔徑大小和致孔方式不同分結(jié)構(gòu)均勻填料 單純由交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)所決定的，孔徑均勻，透明狀。結(jié)構(gòu)半均勻的填料 用良溶劑致孔而聚合的，半透明狀。結(jié)構(gòu)非均勻的填料用非良溶劑致孔而聚合的，聚合反應(yīng)一開(kāi)始就產(chǎn)生相分離，形成由交聯(lián)聚合體小顆粒堆積而成的大孔，呈乳白色。很多這類(lèi)填料以商業(yè)化，-Spherogel系列;Shodex GPC-A, -H,-KF系列;TSK gel-H,HXLX系列等三、凝膠過(guò)濾色譜填料凝膠過(guò)濾色譜(gel filtration chromat

23、ography,GFC)用水相淋洗體系，將物質(zhì)按分子大小分離。傳統(tǒng)GFC填料通常是軟膠，主要有葡聚糖凝膠；瓊脂糖凝膠；聚丙烯酰氨凝膠。其特點(diǎn)是粒度分布范圍寬；強(qiáng)度低；分離速度慢，不能承受較大壓力；親水性好；生物相容性好。1、多糖型GFC填料在傳統(tǒng)sephadex、Sepharose基礎(chǔ)上發(fā)展出高交聯(lián)的多糖型填料。理化性能和指標(biāo)有明顯改進(jìn)與提高。具有良好的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性，粒度分范圍窄，可在適當(dāng)壓力和較高流速下操作，能經(jīng)受酸堿清洗和廣泛pH的溶液。部分用于高效GFC填料，在FPLC，HPLC系統(tǒng)用于分析分離和半制備分離。部分多糖型填料及其特性見(jiàn)書(shū)P211-2，表10-5、6。 應(yīng)用應(yīng)用Sep

24、hadex G-75Sephadex G-75純化的包涵體蛋白純化的包涵體蛋白2、高聚物型GFC填料以多孔高聚物微球?yàn)榛|(zhì)。機(jī)械強(qiáng)度比多糖型更好，粒度分布更窄，甚至達(dá)到單分散水平；但親水性和生物相容性不及多糖型填料，通過(guò)改性能改善之。按類(lèi)型分有帶親水基團(tuán)的多孔交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯類(lèi)樹(shù)脂交聯(lián)聚乙烯醇樹(shù)脂被親水化處理的交聯(lián)聚苯乙烯樹(shù)脂羥基化聚醚類(lèi)親水性樹(shù)脂等。特點(diǎn)：粒度小而均勻；機(jī)械強(qiáng)度高；適宜的孔徑大小與分布；良好的親水性和化學(xué)穩(wěn)定性；交好的生物相容性等。部分高聚物型GFC填料特性見(jiàn)書(shū)P213表10-7親和色譜(affinity chromatography, AFC)利用生物分子間特異性相互作用

25、的分離方法。專(zhuān)一性強(qiáng)。原則上講只要在固相載體上連接一種具有生物特異性的配基，就可以建立一種親和色譜方法，用于分離與之配對(duì)的物質(zhì)。AFC的特點(diǎn)是高度專(zhuān)一性和選擇性，活性回收率高。有機(jī)高分子類(lèi)型的AFC填料，按基質(zhì)材料分有：多糖型高聚物2類(lèi)。按配體性能（填料所帶配體對(duì)被分離物質(zhì)的選擇性）分有專(zhuān)用性通用性2類(lèi)。專(zhuān)用性填料基于配體和被分離物質(zhì)（Ag-Ab,激素-受體）間的特異性作用，所以有很高的特異選擇性和親和力。通用性填料配體可與多種物質(zhì)結(jié)合，故選擇性不強(qiáng)，專(zhuān)一性不高。但配體比較廉價(jià)且容易獲取，在AFC色譜中仍居主導(dǎo)地位。常見(jiàn)的通用性親和配體有金屬螯合物配體小分子類(lèi)配體：AA、肽、肝素等顏料類(lèi)配體：Cibacron蘭、Procion紅等外源性凝聚素類(lèi)配體：conA、扁豆外源凝集素和麥芽外源凝集素等核酸與核苷酸累配體：AMP、PolyA、PolyU等。從親和配體連接方式看有兩種從親和配體連接方式看有兩種配體與基質(zhì)直接偶聯(lián)配體與基質(zhì)直接偶聯(lián)間間接偶聯(lián)接偶聯(lián)在配體與基質(zhì)間插入一適當(dāng)長(zhǎng)度的；鏈狀間在配體與基質(zhì)間插入一適當(dāng)長(zhǎng)度的；鏈