高等真核生物細(xì)胞中監(jiān)測自噬試驗方法的解釋與使用指南

1、高等真核生物細(xì)胞中監(jiān)測自噬試驗方法的解釋與使用指南摘要目前有關(guān)細(xì)胞自噬的研究持續(xù)性地增加，不斷的吸引許多新的科學(xué)家進(jìn)入這一領(lǐng)域。因此，在不同的生物機體中建立一套標(biāo)準(zhǔn)的監(jiān)測巨自噬的準(zhǔn)則規(guī)定，就具有重要意義。最近的很多文獻(xiàn)已經(jīng)描述了已被使用于這一目的的檢測范圍。有許多有用并且簡便的方法可用于監(jiān)測酵母巨自噬，但在其他模型系統(tǒng)中相對較少；此外，用于測試高等真核生物的巨自噬，存在很多混淆的但看似可接受的方法。需要強調(diào)的一個關(guān)鍵問題在于：在測量監(jiān)測的自噬體數(shù)目與測量那些流過自噬途徑的自噬體數(shù)目之間，存在一定的差異；這樣一來，巨自噬堆積，將導(dǎo)致自噬體的聚集作用，需要從完全功能性自嗜的分化作用，其包括輸送和降

2、解，以及溶酶體（在大多數(shù)高等真核生物中）或液泡（在植物和真菌中）。本文中，我們提出一套指南，用于對這些方法的選擇和解釋，可供那些試圖檢測巨自噬及其相關(guān)進(jìn)程的研究人員使用，此外，那些需要對這些研究過程的文章提供實際與合理的批評意見的審稿者也可以使用。本套指南并不意味著是一種公式化的規(guī)則，因為適當(dāng)?shù)臋z測方法部分地取決于那些所需要解決的問題和正在使用的系統(tǒng)。此外，我們強調(diào)，沒有任何的檢測方法能保證在各種情況下都是最恰當(dāng)?shù)模覀儚娏彝扑]使用多種檢測方式來驗證一種自噬反應(yīng)。關(guān)鍵詞自噬泡 自噬體 通量 溶酶體 吞噬泡 壓力 液泡在第一次自噬與健康和疾病的Keystone研討會上，一位坐在聽眾席的研究員在聽

3、了若干細(xì)節(jié)上不充分的與記錄自噬相關(guān)的報告后，提出了這樣一個問題“證明自噬的最關(guān)鍵的準(zhǔn)則是什么？”這是一個理性的問題，特別是考慮到我們每個人對這一問題都有可能有自己的見解。不幸的是，對于那些認(rèn)為自己可能找到了準(zhǔn)則的研究人員來說，這些準(zhǔn)則似乎是移動著的目標(biāo)，他們悲哀的發(fā)現(xiàn)評論家們有著不同的觀點。相反，作為一個評論家，他們反復(fù)的提出相同的反對理由，疑惑為什么研究人員沒有達(dá)到證實自噬過程存在的基本要求。另外，潛在調(diào)控自噬的藥物越來越多的應(yīng)用到臨床診斷中，而且用于治療目的的可調(diào)控自噬的新藥屏障已經(jīng)建立起來。顯而易見的，基于一套可被接受的準(zhǔn)則要求下，確認(rèn)這些藥物是否能夠真的影響自噬過程十分重要。因此，我們

4、在此提出一套基本的指南，應(yīng)用這套指南，研究人員可以計劃和闡釋他們的實驗，臨床醫(yī)生可以決定采用那種方法是最合適的，作者和評論員可以支持或批判某一研究成果。在為調(diào)控自噬選擇最合適的方法構(gòu)建指南的過程中，有幾個基本的要點需要謹(jǐn)記。十分重要的一點是對于監(jiān)測自噬所處的狀態(tài)沒有絕對的準(zhǔn)則適用于所有的情況。這是因為有些檢驗方式是不適宜的，自身存在缺陷的，或者在特定的細(xì)胞，組織或器官內(nèi)根本不起作用。另外，這些指南也許會作為新的方法論而演變發(fā)展，取代現(xiàn)有的檢測方法。雖然如此，建立一個可被接受的在多種實驗系統(tǒng)下均能可靠調(diào)控自噬的方法指南十分有用。需要注意的是，在這套指南里，“autophagy”通常代表巨自噬；其

5、他自噬相關(guān)過程會在使用時特殊表明。一個基本的要點是自噬是一個動態(tài)的多步驟過程，可以在許多步驟中積極的和消極的調(diào)控。從這點來看，自噬的途徑和其他代謝途徑不存在差別。例如，自噬體的積累（通過電子顯微鏡圖像分析，GFP-LC3熒光亮點分析，或者LC3脂化的western印記分析）可以反映出由于自噬活性的增加引起的自噬體形成的加快或者自噬體消亡的減慢（見圖1）。后者是通過抑制自噬體成熟成為自噬泡實現(xiàn)的，抑制是由于自噬體分別脫離了與胞內(nèi)體或溶酶體的融合，或者是融合后的低效降解而產(chǎn)生的。為了進(jìn)行綜述，自噬過程劃分為隔離吞噬泡，自噬體，amphisome（自噬體和胞內(nèi)體融合的中間囊泡，也可認(rèn)為是酸性晚期自噬

6、體）和自噬泡（自噬體或amphisomes與溶酶體融合產(chǎn)生的，可以認(rèn)為是自噬溶酶體）。在這篇評論文章中“phagophore”（吞噬泡）沒有暗示自噬體膜的來源的意義。吞噬泡之一術(shù)語最初被創(chuàng)造出來是為了指示最初的隔離結(jié)構(gòu)與其他細(xì)胞器在形態(tài)學(xué)上明顯不同。其他研究表明自噬體隔離膜的特殊來源最明顯的是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。實際上，最近的研究工作表明自噬體的形成需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及其他普遍存在的膜結(jié)構(gòu)流經(jīng)分泌途徑。自噬過程中膜的來源的完整理解仍需深入的研究，因此，在本篇文章中提到的吞噬泡僅僅代表一種特殊的結(jié)構(gòu)。對自噬細(xì)胞死亡，或者更確切的說與自噬相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞死亡（因為鮮有例子表明自噬是導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡的機制）的相關(guān)研究表明

7、，在另一個重要的情況下，就有必要區(qū)分是否出現(xiàn)由于抑制與誘導(dǎo)自噬引起的表型缺陷。在某些情況下，這種類型的死亡是由于自噬通量減少，由于抑制自噬體與溶酶體的融合或降解溶酶體功能的缺失。因此，使用自噬的標(biāo)記分子，如LC3-II，需要補充對自噬通量的全面了解，以保證對結(jié)果有一個正確的解釋。在這里，人們需要衡量一般自噬過程中蛋白質(zhì)的分解率，或在一個給定的點阻止自噬通量，在這一被阻塞的時間點記錄細(xì)胞器，細(xì)胞器的標(biāo)記，底物（cargo）標(biāo)志分子，或整個底物的時間依賴性積累。按照同樣的思路，可以按照時間依賴性減少選擇適當(dāng)?shù)臉?biāo)記。從理論上講，這可以通過在途徑中的特殊步驟中阻斷自噬隔離來實現(xiàn)（例如：阻斷新吞噬泡的進(jìn)

8、一步誘導(dǎo)或成核過程），測量在阻斷位點之后的標(biāo)記分子間少量。問題的關(guān)鍵是通過測量“穩(wěn)定狀態(tài)”的水平和自噬細(xì)胞成分的降解率來區(qū)分自噬的形成和積累。兩個過程都曾被用來估計“自體吞噬”，但除非實驗可以把自噬體數(shù)目的變化與直接或間接測量得到的自噬通量（例如，清算底物作為一種直接測量方法，或LC3-II的變化作為一個間接測量測量方法）相關(guān)聯(lián)起來，否則他們可能很難解釋清楚。在這里提醒一下要確保術(shù)語“穩(wěn)態(tài)”的正確使用。不要認(rèn)為一個自噬系統(tǒng)處于穩(wěn)定狀態(tài),就意味著自噬體的水平不隨時間改變，系統(tǒng)中的通量是不變的。相反,在本文中我們使用的術(shù)語穩(wěn)態(tài)是指測量值在本質(zhì)上是靜態(tài)。自噬通量是指自噬的完整過程，包括底物向溶酶體的

9、傳送（通過后者與自噬體或amphisomes的融合）及其后續(xù)分解和回收利用。因此，增加磷脂酰乙醇胺修飾的LC3（即LC3-II）的含量，或者甚至自噬體的外表不是自噬通量本質(zhì)上的測量手段，但是依然可以反映自噬的誘導(dǎo)和/或自噬體的抑制或amphisome的清算。此外，一個細(xì)胞的降解能力可能隨著細(xì)胞類型，年齡，轉(zhuǎn)化和/或疾病而變化，可能會決定誘導(dǎo)自噬的結(jié)果。最后，重要的是要注意，盡管LC3-II的形成與自噬的誘導(dǎo)相關(guān)，但是我們目前不知道，LC3-II的形成和自噬其余過程間的實際機制關(guān)系。因此，有必要區(qū)分自噬或LC3-II積累，自噬通量之間的關(guān)系。 最后，我們強烈建議作者們在表述實驗結(jié)果時避免使用“%

10、自噬”的表達(dá)方式，例如“細(xì)胞顯示同比增長25的自噬”。相反，指出顯示點狀GFP-LC3的細(xì)胞百分比，或者一個長壽命蛋白質(zhì)的降解率特定增加或減少，因為這些是能被量化的實際測量方法?？偟膩碚f，我們提出以下準(zhǔn)則來在高等真核生物中衡量自噬的各個方面。A 通過穩(wěn)態(tài)的方法調(diào)控吞噬泡和自噬體的形成把指南分成穩(wěn)態(tài)和通量兩個方面的關(guān)鍵原因是前者雖然能表征自噬的誘導(dǎo)，但是不能確定自噬的整個過程是否完成。這一點十分重要，因為不完整的自噬過程將導(dǎo)致自噬體的積累，從而引起生理上的機能失調(diào)。相反，完整的自噬過程將產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)。1.電子顯微鏡 自噬現(xiàn)象首先是通過電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)的。細(xì)胞質(zhì)中心區(qū)域的降解通過吞噬泡（一種特殊

11、的光滑，無核糖體的雙層膜）隔離開，吞噬泡成熟后成為前溶酶體自噬體是自噬的標(biāo)志。因此，在分析自噬過程中多種結(jié)構(gòu)的連續(xù)性變化時(吞噬泡、自噬體、amphisome和自噬泡)，使用電子顯微鏡是一種即有效又重要的定性和定量分析方法。從吞噬泡經(jīng)過自噬體的成熟是一個動態(tài)和連續(xù)過程，因而把這些結(jié)構(gòu)分類成為形態(tài)學(xué)上不相關(guān)聯(lián)的類別是存在問題的。幸運的是，在大多數(shù)生理和病理情況下，檢測早期和晚期的自噬結(jié)構(gòu)產(chǎn)生足夠重要的數(shù)據(jù)來反映整個細(xì)胞中的自噬/溶酶體所處的狀態(tài)。注意盡管電子顯微鏡是用于監(jiān)測自噬的最廣泛的方法之一，但是它同時也是最存在疑問的和易于誤解結(jié)果的方法之一。由于人工加工樣品的巨大潛力，謹(jǐn)慎選擇適宜的無偏差

12、的量化方法和形態(tài)特征/體視學(xué)分析十分重要。例如，計數(shù)自噬體的剖面是一種較好的辦法，然后只計數(shù)細(xì)胞的一個區(qū)域內(nèi)是否存在自噬體，但是首選的方法用形態(tài)測量學(xué)/立體測量學(xué)的方法確定自噬體體積占細(xì)胞質(zhì)體積的百分比。在量化過程中，確保取樣的隨機均等性什么重要，這意味著薄層區(qū)域內(nèi)每一個細(xì)胞具有相同的概率被計數(shù)?？煽康淖允审w鑒別方法是有效分析的前提。另外一個難點是，在哺乳動物自噬體的成熟過程中包括一個從雙層膜結(jié)構(gòu)過渡到單層膜結(jié)構(gòu)的過程（如amphisomes和自噬泡）。因此，雙層膜在確定與自噬相關(guān)的結(jié)構(gòu)中不是必要的超微結(jié)構(gòu)證據(jù)，而且聘請專家來分析結(jié)果十分重要，以避免誤解顯微照片。即使是在專家中，對真正的自噬體

13、的特征仍有很大分歧。例如，饑餓誘導(dǎo)產(chǎn)生的自噬體應(yīng)包含細(xì)胞質(zhì)（即細(xì)胞質(zhì)和可能的細(xì)胞器），但自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)涉及特定類型的自噬，如選擇性過氧化物酶，或線粒體的退化（分別為過氧化物酶體自噬或線粒體自噬）或有針對性的病原微生物的降解（xenophagy），可能相對缺乏細(xì)胞質(zhì)。此外，一些致病性微生物在感染過程中表達(dá)破壞膜結(jié)構(gòu)的因子，破壞自噬體正常的雙層膜結(jié)構(gòu)。我們甚至不清楚是該將特定細(xì)胞器降解時產(chǎn)生的隔離結(jié)構(gòu)和xenophagy也定義為自噬體，還是應(yīng)該將其另外分別定義為過氧化物酶體自噬和xenophagosome，盡管它們的膜結(jié)構(gòu)和形成機制與饑餓誘導(dǎo)產(chǎn)生的自噬體相同。確定吞噬小體中原材料來源于自我吞食還是異

14、源吞噬也十分困難；適當(dāng)?shù)臅r候，特殊的分析方法可以對吞噬原材料的來源進(jìn)行評估。無論如何，證明被膜隔離起來的區(qū)域里的物質(zhì)完全被降解十分必要。這是通過證明膜隔離結(jié)構(gòu)（線粒體或粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)潴泡）從完整到相繼瓦解直到完全消失的現(xiàn)象完成的。在降解過程中仍保持不離散的事實說明吞噬小體在三維結(jié)構(gòu)上被膜包被。利用傳統(tǒng)的免疫細(xì)胞化學(xué)方法證明在融合后的細(xì)胞自噬體內(nèi)存在溶酶體酶也是可行的。最后，由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的池狀結(jié)構(gòu)，包圍線粒體或其他細(xì)胞器的雙層膜結(jié)構(gòu)經(jīng)常能在剖面觀察到，這實際上與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)潴泡結(jié)構(gòu)出入橫剖平面有關(guān)。膜上存在的核糖體有助于我們區(qū)分出自噬體的無核糖體雙層膜結(jié)構(gòu)。在潛在不確定的情況下，需要使用免疫金標(biāo)簽電子顯微鏡

15、，使用底物蛋白（細(xì)胞質(zhì)來源的；在這種情況下底物不能是大量存在的細(xì)胞質(zhì)蛋白否則背景會很亮，細(xì)胞器標(biāo)記很適用）和LC3的抗體來證實自噬的結(jié)構(gòu)特性。這種方法的成功依賴于抗體的質(zhì)量，電子顯微鏡的準(zhǔn)備工作和樣品的固定化程序。應(yīng)用免疫電鏡時，作者要控制標(biāo)簽是獨特的，確保信號在背景下清晰可見。此外,我們建議提供統(tǒng)計信息，因為有必要顯示一個選擇的多個部分。再次,我們建議為定量數(shù)據(jù)首選適當(dāng)?shù)娜萘糠治龇椒ǎ粌H僅是對選擇的區(qū)段進(jìn)行計數(shù)。我們必須牢記，即使是容量的形態(tài)測量學(xué)/立體測量學(xué)分析只顯示穩(wěn)態(tài)水平，其本身不能為自噬通量提供信息。另一方面，定量分析表明自噬體的體積在很多情況下與蛋白質(zhì)的降解率有關(guān)。關(guān)于電子顯微

16、鏡的一點附加說明，在一定程度上和共聚焦熒光顯微鏡一樣，分析一個細(xì)胞的某一單一部分可能會產(chǎn)生誤導(dǎo)并且可能引起自噬結(jié)構(gòu)的識別困難。一個潛在的折中方法是利用熒光顯微鏡定量整個細(xì)胞中的自噬體，然后用電子顯微鏡來定性確認(rèn)，顯示熒光中亮點的變化反映自噬結(jié)構(gòu)數(shù)量上的增加。共聚焦顯微鏡和熒光顯微鏡與層層分解分析軟件（或者更多的工作，電子顯微鏡）可以用于產(chǎn)生同一細(xì)胞多重/連續(xù)的部位來降低這一顧慮，但是這一般不是必要的，因為分析多個細(xì)胞的單一部位更方便并且能夠提供更多的信息。另外一個值得關(guān)注的方法將光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡聯(lián)系起來，CLEM，有助于確定熒光標(biāo)記的結(jié)構(gòu)是自噬體結(jié)構(gòu)。最后，即使是一種間接測量方法，根據(jù)自

17、噬體數(shù)量與電鏡下的自噬泡數(shù)量的比值，可以以此來改變其它程序中確認(rèn)自噬的方法。在這種情況下，經(jīng)常比較樣品和同一細(xì)胞類型的控制組，自噬體和自噬泡的比率在一個細(xì)胞中的變化依賴于背景的樣式，依賴于他們余下的活性。區(qū)別自噬體和末溶酶體/第二溶酶體（前者活躍的參與到降解中，而后者在腔內(nèi)物質(zhì)的降解過程中已經(jīng)到達(dá)末期）也十分重要，因為當(dāng)自噬被誘導(dǎo)時溶酶體的數(shù)量往往增加。2.Atg8/LC3western印跡和泛素蛋白結(jié)合系統(tǒng)Atg8/LC3是一種類似泛素蛋白的蛋白，可以與磷脂酰乙醇胺結(jié)合。在酵母中，結(jié)合形式為Atg8-磷脂酰乙醇胺。在哺乳動物中Atg8的同源物質(zhì)組成了一個蛋白家族，其中微管相關(guān)蛋白1的輕鏈3（

18、LC3）與我們的討論關(guān)聯(lián)最密切（在其它體系中，這個蛋白也被稱作“Atg8”，但是為了簡化，我們稱它為LC3，以便其和酵母中的蛋白相區(qū)分）。LC3最初是以未加工的形式合成的，前LC3，經(jīng)過解朊作用切除C端的氨基酸轉(zhuǎn)化成為LC3-I，最終修飾成與磷脂酰乙醇胺結(jié)合的形式LC3-II（圖2）。Atg8-磷脂酰乙醇胺/LC3-II是唯一一種可靠的與自噬體相關(guān)聯(lián)的蛋白標(biāo)記，但是也可以在吞噬泡中得到定位。在酵母中，當(dāng)自噬被誘導(dǎo)時，Atg8的含量至少會增加十倍。然而在哺乳動物細(xì)胞中，LC3的總含量沒有必然的變化，LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化可能加快，或者是LC3-II通過溶酶體自溶而快速降解引起LC3-II

19、含量相對于LC3-I含量的降低。更進(jìn)一步說，即使LC3的總含量增加了，其增加的比率也要小于酵母中增加的比率。Western印跡可以十分簡便的應(yīng)用于LC3含量（圖2）變化的檢測過程。需要注意的是，LC3-II的Western印跡還沒有在果蠅中得到成功。注意在使用LC3-II的自噬過程中有兩個重要的注意事項。第一點，LC3-II含量的變化是依賴于組織和細(xì)胞環(huán)境而變化的。實際上，在某些情況下，運用電子顯微鏡檢測自噬體積累時沒有發(fā)現(xiàn)LC3-II含量的增加。相反，正常水平的LC3-II不能作為自噬的充分證據(jù)。例如，在胚胎干細(xì)胞中純合缺失beclin 1基因雖然會導(dǎo)致自噬的缺陷，但是不會阻礙LC3-II的

20、形成，然而atg5基因的缺失會導(dǎo)致LC3-II的完全消失（見圖2B和參考文獻(xiàn)32中的補充數(shù)據(jù)）。因此，重要的是要記住，并不是所有的自噬相關(guān)蛋白都需要像Atg8/LC3一樣的過程，包括脂化。檢測手段和LC3-I與LC3-II相對含量的變化莫測暴露出了技術(shù)性問題。例如，LC3-I在腦組織中含量豐富，LC3-I鍵的強度可能會使LC3-II的檢測結(jié)果模糊不清，除非所用的聚丙烯酰胺交聯(lián)密度得到過優(yōu)化。相反，在某一細(xì)胞系中LC3-I的含量比LC3-II的含量少得多。此外，組織中可能會含有異步和異質(zhì)的細(xì)胞群體，這可能會給利用Western印跡的方法分析LC3帶來挑戰(zhàn)。第二點，在用Western印跡的方法分析

21、LC3時要謹(jǐn)慎，適宜的標(biāo)準(zhǔn)化控制是必要的。例如，在用某一特定的LC3抗體檢測時，LC3-I相對低活性，同時LC3-I沒有LC3-II穩(wěn)定。LC3-I對凍融和在SDS樣品緩沖液中降解也更敏感，所以新鮮的樣品必須煮沸并要求盡快檢測，同時避免樣品受到反復(fù)的凍融。關(guān)于用Western印跡的方法分析LC3的注意要點已經(jīng)被囊括在最近的一篇評論文章中，另外一個重要的建議是研究人員在檢測LC3-II的相對含量時應(yīng)該和肌動蛋白的含量相關(guān)聯(lián)，而不是LC3-I的含量。另外，Triton X-100可能不能有效的溶解LC3-II。相反，在1%的SDS中加熱能夠確保完全溶解，這對于正確解釋W(xué)estern印跡的結(jié)果十分重

22、要。而且測量LC3-I的效用取決于被分析的細(xì)胞。例如，與外圍組織的細(xì)胞相比，中樞神經(jīng)組織細(xì)胞中的LC3-I含量豐富并且穩(wěn)定，在這些細(xì)胞中LC3-II與LC3-I的相對比率和LC3-II的含量可以用于監(jiān)測自噬體的形成。最后，LC3在哺乳動物細(xì)胞中存在三種亞型，LC3A, LC3B和LC3C，在不同的組織內(nèi)有不等的分布，用不同的抗血清或抗體區(qū)分這些亞型可能很有必要。在這里提醒一點，LC3B-II含量的增加，而不是LC3A-II,與自噬囊泡數(shù)量的增加有關(guān)，這一結(jié)果可由電子顯微鏡或與反應(yīng)自噬誘導(dǎo)壓力的鼠GFP-LC3轉(zhuǎn)染實驗檢測得到。這一結(jié)果支持了LC3的亞型顯示不同功能的觀點，我們建議在wester

23、n印跡和免疫熒光實驗中使用抗LC3B，而不是抗LC3A。補充一點關(guān)于監(jiān)測共價結(jié)合的Atg12-Atg的關(guān)注，其已在一些研究中用來衡量自噬。在一些哺乳動物細(xì)胞中所有的Atg5蛋白和Atg12蛋白均以共價結(jié)合的形式存在并且表達(dá)水平不變，至少是在短期饑餓處理時不變。因而，監(jiān)測共價結(jié)合的Atg12-Atg5來反映自噬的誘導(dǎo)在本質(zhì)上可能是一個無效的方法。然而值得注意的是，在某些細(xì)胞系中檢測到了游離的Atg5，意味著Atg5的含量可能依賴于細(xì)胞系本身。另外一個可能值得考慮的變量是共價結(jié)合的Atg12-Atg5的含量可能會由于長時間處于饑餓狀態(tài)而增加，這一現(xiàn)象由肝細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中觀察得到。最后，我想指出一

24、個普遍存在的問題，即在檢測過程中可能引入多種的壓力，例如：由于細(xì)胞溶解而產(chǎn)生的機械壓力，加熱或冷卻樣品產(chǎn)生的溫度壓力，顯微鏡滑動產(chǎn)生的氧化壓力，這些都可能引起一些認(rèn)為變化。提出這一點不是為了有意限制使用任何特殊的方法，而是為了指出沒有完美的檢測方法。因而，證實在檢測過程中正向調(diào)控（雷帕霉素處理）和負(fù)向調(diào)控（抑制劑處理）的方法按照預(yù)期的想法進(jìn)行十分重要。3.熒光顯微鏡LC3B（從本文的此處后用LC3代替），或者N端標(biāo)記了熒光蛋白（如GFP, GFP-LC3）的蛋白質(zhì)，已經(jīng)被應(yīng)用于間接免疫熒光或直接熒光顯微鏡的方法監(jiān)測自噬，衡量的方法是測定LC3或GFP-LC3亮點的增加量。GFP-LC3/Atg

25、8的檢測在用轉(zhuǎn)基因生物，如：線蟲、粘菌、果蠅、擬南芥和鼠中進(jìn)行的體內(nèi)研究也十分有用。也可以在免疫細(xì)胞化學(xué)或免疫組織化學(xué)的實驗中使用抗LC3的抗體，具有檢測內(nèi)源性蛋白，省卻轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)基因的程序的優(yōu)點，以及避免可能因過度表達(dá)而引起的潛在人工因素。檢測內(nèi)源性蛋白顯然依賴于在感興趣的系統(tǒng)中檢測的能力。如果內(nèi)源性蛋白的含量達(dá)不到檢測的水平，那么必須確保使用內(nèi)源性蛋白質(zhì)的構(gòu)建。在這種情況下，考慮使用比瞬時轉(zhuǎn)染穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化十分重要。穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化因為蛋白表達(dá)低所以可以減少背景，同時也具有消除暴露于轉(zhuǎn)染試劑的優(yōu)點。更進(jìn)一步說，利用轉(zhuǎn)化更多的細(xì)胞可以便宜的分析，因為幾乎100%的細(xì)胞將會表達(dá)被標(biāo)記的LC3。另一方面，穩(wěn)

26、定的轉(zhuǎn)染子有一個缺點，即整合位點不能完全被預(yù)測，表達(dá)水平也不是很合適。更進(jìn)一步說，瞬時轉(zhuǎn)染具有檢測被轉(zhuǎn)染蛋白對自噬的即時效應(yīng)的優(yōu)點。另外，用雙重轉(zhuǎn)染（用GFP-LC3和感興趣的蛋白）來直觀的標(biāo)記可以表達(dá)待檢測蛋白的細(xì)胞，這種方法可能和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子間存在更多地問題?？傊谑褂梅€(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時轉(zhuǎn)染之間沒有適用的簡單規(guī)則。當(dāng)使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時，篩選具有最佳信噪比的克隆是值得的，在使用瞬時轉(zhuǎn)染時，優(yōu)化GFP-LC3 DNA的濃度以獲得最佳的信噪比是值得的。優(yōu)化和適宜的控制，有助于克服檢測中的內(nèi)在易變性效應(yīng)。GFP-LC3的另外一個作用是在與自噬相關(guān)聯(lián)的過程中，如細(xì)胞器的降解和病原微生物的隔離，監(jiān)測其與目標(biāo)

27、分子的共定位。在線蟲中觀測自噬時，最好選用GFP-LC3 (GFP:LGG-1；圖四)的整合變體而不是染色體外構(gòu)建，因為后者在不同的動物中的表達(dá)水平易變。另外，使用整合變體后仍可以利用western印跡的方法分析脂化。最后，我們指出基于GFP的顯微鏡的納米分辨能力的提高，將進(jìn)一步加強這項技術(shù)所帶來的價值和可能性的可用性增加。在巨自噬（細(xì)胞質(zhì)的非特異性隔離）和自噬相關(guān)過程（如：細(xì)胞質(zhì)到液泡的標(biāo)記途徑，細(xì)胞器特異性降解和自噬清除入侵的微生物）均需要酵母Atg18的參與。近期的一項研究表明當(dāng)自噬被誘導(dǎo)時，人類中與Atg18同源的物質(zhì)（WIPI-1)在LC3陽性的膜結(jié)構(gòu)處積累，同時Atg18含量的增加

28、與LC3-II含量的增加相關(guān)。Atg18的內(nèi)源性含量也可以通過間接的熒光顯微鏡和免疫電鏡的方法檢測，轉(zhuǎn)染后GFP-Atg18的存在位置相似。因此，在檢測中Atg18含量和分布可以替代LC3。至于其它的Atg蛋白，Atg9也顯示出與GFP-LC3部分共定位的特性。監(jiān)測Atg9的定位還沒有廣泛的應(yīng)用于高等真核生物中，但是和在酵母中觀察到的現(xiàn)象一樣，這種蛋白在Atg1/Ulk1踏車中表現(xiàn)相同的類型依賴性，這表明這種蛋白質(zhì)可以作為Atg1功能的指示標(biāo)志。最后，Atg8/LC3是在高等真核生物中與自噬體保持相關(guān)的唯一的蛋白，其余的蛋白，特別是Atg5, Atg12和Atg16，通過熒光和免疫熒光檢測顯示

29、其與吞噬泡相關(guān)。注意雖然GFP-LC3的熒光分析是一個很實用的方法,但是通過測量GFP-LC3(或LC3免疫)的方法定量分析自噬比用western印跡的方法測定LC3-II更加繁瑣。最理想的情況是包括檢測和兩組結(jié)果的比較。另外，如果GFP-LC3已經(jīng)被定量了，那么最好檢測每個細(xì)胞中反映GFP-LC3的亮點數(shù)量，而不是簡單的記錄所有細(xì)胞中顯示的亮點總數(shù)。后一點十分關(guān)鍵，因為即使是在營養(yǎng)豐富的條件下仍會顯示一些基本含量的GFP-LC3亮點，除非那些細(xì)胞缺少自噬相關(guān)基因（即使缺失相關(guān)基因，在特殊的條件下仍有可能得到GFP-LC3的亮點）（圖3B）。這里還存在人工的和可靠的亮點計數(shù)的實際問題，特別是當(dāng)

30、每個細(xì)胞中的數(shù)量都較大時（這可能比依賴于程序軟件的計數(shù)更加準(zhǔn)確，因為確定只有適宜的亮點才被計數(shù)十分重要）。同時，當(dāng)自噬體-溶酶體的融合被阻斷時，較大的自噬體能夠檢測得到，這可能是自噬體-自噬體融合的結(jié)果。在許多細(xì)胞類型中，也許可以為每個細(xì)胞中的亮點數(shù)建立一個截至值，來區(qū)分低自噬和高自噬。這可以通過使細(xì)胞接觸自噬誘導(dǎo)劑和阻斷劑的實驗檢驗。因此，細(xì)胞群體中含有自噬體的細(xì)胞比例比擾動條件下的截至數(shù)目占對照組細(xì)胞數(shù)目的比例更大，這一點可以提供自噬改變的定量證據(jù)。然后就可以根據(jù)細(xì)胞數(shù)和百分比來顯示自噬體數(shù)目。這種方法在背景的亮點數(shù)目很低時是唯一可行的方法，并且在這種條件下，對大量細(xì)胞的計數(shù)尤為重要（根據(jù)

31、不同的系統(tǒng)和實驗，可能要求50或更多的細(xì)胞，最好至少復(fù)查三次）。為了讓其他試圖重復(fù)這些實驗的研究人員進(jìn)行比較，作者指定亮點基線用來定義“正?！被颉暗汀弊允墒株P(guān)鍵。此外，應(yīng)該采用無偏程序（在包含所有細(xì)胞的一定間隔處使用隨機起點）進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，由于檢測結(jié)果是高度變化的，所以基線和環(huán)境改變的信息必須進(jìn)行統(tǒng)計。一個在大量細(xì)胞中進(jìn)行無偏GFP-LC3亮點計數(shù)的可能方法是多光譜成像流式細(xì)胞儀。這種方法通過形態(tài)和免疫熒光圖案相結(jié)合的方法允許描述群體內(nèi)的單個細(xì)胞的特性，從而提供統(tǒng)計上有意義的數(shù)據(jù)。另外一個需要引起注意的地方是在使用熒光顯微鏡時確定大小是成問題的，除非仔細(xì)的提出一套標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)定。更進(jìn)一步說，不同

32、大小的GFP-LC3亮點與自噬水平的關(guān)系還不是很清楚。一種可能確定亮點背景水平的控制方法是檢測未加GFP（綠色熒光蛋白）標(biāo)記的熒光強度。在使用GFP-LC3時一點特別的需要注意的是，這種嵌合體可以與聚合關(guān)聯(lián)在一起，尤其是在高水平易聚合蛋白存在的情況下，這可能會導(dǎo)致對結(jié)果的誤解。值得注意的是，GFP-LC3可以與泛素蛋白聚合體相關(guān)聯(lián)；然而，當(dāng)GFP-LC3表達(dá)水平很低時這一現(xiàn)象不會發(fā)生。這些聚合體在其他系統(tǒng)中也有被描述，經(jīng)常被稱為聚合樣誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)或ALIS，樹突細(xì)胞ALIS，p62bodies/sequestosomes和包裹體。在體內(nèi)和體外抑制自噬的活性導(dǎo)致這些聚合體的積累，暗示著自噬介導(dǎo)聚合體

33、的清除。在體外，泛素蛋白聚合體的形成需要接頭蛋白p62。在這種情況下，p62蛋白與泛素蛋白和LC3之間的相互作用被認(rèn)為能夠介導(dǎo)聚合體向自噬系統(tǒng)的傳導(dǎo)。許多細(xì)胞內(nèi)壓力可以誘導(dǎo)聚合體的形成，包括轉(zhuǎn)染試劑。例如：MEFs的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，COS7的磷酸鈣轉(zhuǎn)染，神經(jīng)元細(xì)胞基本水平很高的GFP-LC3亮點水平和LC3-II含量的提高。在這里考慮一件十分有趣的事情，在許多轉(zhuǎn)染過程中用到的氯喹可以刺激自噬體的形成，但是它會抑制整個自噬過程；許多轉(zhuǎn)染試劑是通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用發(fā)揮作用的，一些基于脂質(zhì)和聚乙烯亞胺的試劑處在防止溶酶體酸化的緩沖液中時效力更強。一種解決方法是在穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3的細(xì)胞中檢測GFP-L

34、C3的亮點數(shù)量；由于GFP-LC3和LC3-II含量的增加往往是瞬時的，所以另外一種方法是用GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，這些細(xì)胞受到模擬時間匹配的轉(zhuǎn)染作為背景對照物（負(fù)調(diào)控）。一個脂化缺陷LC3的突變體，其中第120位甘氨酸突變?yōu)楸彼?，針對這些不依賴于自噬（可能通過其與P62的相互作用，見上文）的聚集體，并導(dǎo)致這種突變可以作為另外一個有價值的對照物。泛素蛋白聚合體的形成和消失代表了一個細(xì)胞循環(huán)的過程。當(dāng)自噬過程被抑制或者當(dāng)傳導(dǎo)到聚合體的蛋白形成能力超過自噬的降解能力時，聚合體開始形成。原則上講GFP-LC3陽性聚合體的形成是自噬過程的一部分。然而，泛素化的GFP-LC3陽性蛋白的形成不能夠直接反映自噬

35、的誘導(dǎo)（或者自噬體的形成），或者是流經(jīng)這個系統(tǒng)。實際上，泛素化蛋白聚合體可以在自噬缺陷的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生。因此我們應(yīng)該記住，GFP-LC3亮點可能代表在細(xì)胞質(zhì)中一個混合的泛素化蛋白聚合體，自噬體和其他傳統(tǒng)意義上的吞噬泡和自噬體中的泛素化蛋白聚合體承載著細(xì)胞質(zhì)中的其它底物。再者，最近的一項研究表明，用皂素和其它類的洗滌劑處理可人工的刺激GFP-LC3亮點的形成。在肝細(xì)胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP-LC3的HEK-293細(xì)胞中沒有檢測到GFP-LC3的情況下，皂素處理的方法已經(jīng)被用于降低熒光背景；然而，根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)的結(jié)果，在這類實驗中需要添加對照實驗。一般說來，最好包含一些額外的測量自噬的檢測方法，而不僅僅是依靠

36、監(jiān)測GFP-LC3。此外，我們建議研究人員在一開始就通過證實在用藥理學(xué)或基于RNA干擾的自噬抑制劑處理過的細(xì)胞內(nèi)不存在GFP-LC3亮點來驗證他們的檢測方法是否正確。例如，3-甲基腺嘌呤(3-MA)廣泛應(yīng)用于抑制饑餓或雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬過程。另外一個普遍存在的局限性是GFP-LC3的檢測需要適合轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)基因（如感染）的系統(tǒng)。因而在一個基本的的非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞內(nèi)使用GFP-LC3具有很大的挑戰(zhàn)性。再次強調(diào)，必須包含有證實轉(zhuǎn)染過程本身不會人工誘導(dǎo)產(chǎn)生GFP-LC3亮點或?qū)е翷C3聚合的對照物。更進(jìn)一步說，轉(zhuǎn)染的構(gòu)建程度要較低，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞要經(jīng)過一下檢測（1）什么時候達(dá)到適合檢測的表達(dá)水平，（2）在檢測的

37、時限里，基礎(chǔ)的GFP-LC3亮點保持適當(dāng)?shù)牡退?。此外，在自噬被抑制的條件下證明被誘導(dǎo)的GFP-LC3亮點含量在數(shù)量上有所減少十分有用。對于一些基本的細(xì)胞，通過重組慢病毒、腺病毒或者逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染方法將GFP-LC3運送到前體細(xì)胞中，隨后分化成為感興趣的細(xì)胞類型，是已分化細(xì)胞類型轉(zhuǎn)染的有力替代者。另外一個需要考慮的是，轉(zhuǎn)染過程或者病毒感染過程，激活某些細(xì)胞中的壓力途徑，并可能誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生，再次強調(diào)了適當(dāng)?shù)膶φ瘴锏闹匾?，如表達(dá)GFP的對照病毒。當(dāng)提到轉(zhuǎn)染時，改變依賴于背景環(huán)境的過程是必須的（詳見關(guān)于氯喹的注意事項）。此外，改變培養(yǎng)基的成分然后在轉(zhuǎn)染后等待24到48小時有助于減少轉(zhuǎn)染試劑引起

38、的GFP-LC3亮點的背景水平。當(dāng)在瞬時轉(zhuǎn)染中使用mCherry-GFP-p62雙標(biāo)簽時（詳見下文中的Tandem RFP-GFP熒光顯微鏡），在轉(zhuǎn)染后最好等待48小時以減少聚合體的形成和潛在的自噬抑制效應(yīng)。最后，盡管LC3-II主要是與膜相連的，但是這并不意味著像想象中的那樣與自噬體相連；這種蛋白經(jīng)常在自噬體的前體吞噬泡上找到。此外，LC3連接到PE的位點還沒有找到，即使在不能形成自噬體的自噬突變體中Atg8PE/LC3-II的水平也可以增加。一種可以用來檢測LC3-II與膜結(jié)合的方法是在Triton X-114中進(jìn)行差異性提取，這可以應(yīng)用于哺乳動物細(xì)胞中。另外一種方法是檢測LC3與Atg5

39、的共定位（或者其它Atg蛋白）；Atg12Atg5結(jié)合體不能與自噬體保持關(guān)聯(lián)，所以共定位結(jié)構(gòu)可能對應(yīng)于吞噬泡。重要的是，我們再次強調(diào)GFP-LC3亮點的數(shù)量和LC3-II含量的穩(wěn)態(tài)相似，僅僅反映自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)（如自噬體）某一瞬間的數(shù)量，而不是自噬通量。至于說Atg18或者GFP-Atg18的檢測，至今仍未證明Atg18亮點是否能在人類細(xì)胞之外的系統(tǒng)中檢測出來，而且亮點形成的數(shù)量依賴于細(xì)胞所處的環(huán)境。另外，Atg18還沒有在完整的（成熟的）自噬體中檢測到，所以Atg18可能只裝點吞噬泡。此外，Atg18亮點的形成可能只對監(jiān)測自噬有用，對自噬通量沒有幫助。4.TOR和Atg1激酶活性 TOR復(fù)合物I

40、 (TORC1)在蛋白激酶B的下游以一種不依賴于轉(zhuǎn)錄的方式負(fù)向調(diào)控自噬過程。在大多數(shù)系統(tǒng)下，TOR的抑制將導(dǎo)致自噬被誘導(dǎo)。TORC1的活性可以通過其靶蛋白的磷酸化程度和下游效應(yīng)，如p70S6激酶或者S6蛋白，而檢測出來。對p70S6激酶而言，檢測TOR的直接作用位點并且雷帕霉素敏感的389位蘇氨酸的磷酸化程度十分重要；C末端磷酸化位點并不總是與TOR的活化作用相關(guān)。因此，在體外定量分析p70S6激酶的活性比較好，但是這需要更多的努力。TORC1活性的下降可以導(dǎo)致自噬的誘導(dǎo)，然而這并不是直接的衡量方法。相反，在體外當(dāng)自噬被誘導(dǎo)時，Atg1對外源性底物的激酶活性上升。在酵母中和其它可能的生物中，有

41、可能利用檢測Atg1激酶活性的方法來驗證自噬被誘導(dǎo)。注意還有一些不依賴于TOR的機制誘導(dǎo)自噬過程。因此，證實待分析的途徑依賴于TOR的抑制十分必要。目前，由于真正的底物還沒有被描述所以把Atg1激酶活性當(dāng)作工具來檢測自噬受到很大限制；現(xiàn)在的檢測方法依賴于人工底物髓磷脂堿性蛋白的體外磷酸化修飾。如果能夠鑒定出一個Atg1的生理底物，就可能像分析TOR一樣在體內(nèi)追蹤它的磷酸化。5.轉(zhuǎn)錄調(diào)控自噬的誘導(dǎo)在一定情況下伴隨著某些自噬基因mRNA水平的增加，如Atg8/LC389和Atg12基因。因此，利用northern印跡或qRT-PCR的方法檢測LC3 mRNA的含量也許能過提供與誘導(dǎo)自噬有關(guān)的相關(guān)數(shù)

42、據(jù)。這些改變是否足以誘導(dǎo)自噬還不是很清楚，因而這并不是直接的檢測方法。值得注意的是，Atg2, Atg4, Atg5 和Atg7等Atg基因轉(zhuǎn)錄水平的巨大改變就發(fā)生在果蠅唾液腺細(xì)胞死亡之前（伴隨著自噬水平的增加），而Atg8a和Atg8b沒有明顯的變化。然而，在幼蟲發(fā)育的最后階段伴隨著自噬的誘導(dǎo)，在脂肪體內(nèi)可觀察到果蠅Atg8a和Atg8b基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，果蠅l(2)mbn細(xì)胞在饑餓條件下表現(xiàn)出果蠅Atg8b基因轉(zhuǎn)錄水平的增加。注意 當(dāng)自噬被誘導(dǎo)時，大多數(shù)Atg基因的mRNA含量不會發(fā)生明顯的改變。即使是LC3 mRNA的增加也是適度的，并且還依賴于細(xì)胞的類型和來源的生物。此外，最好是追蹤蛋白

43、質(zhì)水平，因為蛋白質(zhì)才是與自噬的起始和完成相關(guān)的最終有效因子，盡管Atg蛋白的含量不是大幅度的改變而且增加的程度依賴于細(xì)胞類型和組織來源。最后，自噬蛋白含量的改變并不是自噬誘導(dǎo)的充分證據(jù)，必須伴隨著這里描述的其它檢測方法才可以。B 通過通量的方法監(jiān)測自噬自噬不僅僅包括Atg8/LC3的合成和脂化，以及自噬體的形成，更重要的是通量，或者說是整個系統(tǒng)中的流體，包括溶酶體和液泡。因此，自噬的底物需要被監(jiān)測已確定它們到達(dá)過這個細(xì)胞器，并且在適當(dāng)?shù)臅r候降解。1.自噬性蛋白質(zhì)的降解蛋白質(zhì)降解分析代表了一種測量自噬通量的行之有效的方法，并且能夠很好的量化。一般的策略是用放射性的氨基酸（如14C-亮氨酸或 14

44、C-纈氨酸）標(biāo)記蛋白，最好是相對較長的一段時間，以達(dá)到代表自噬底物最好的長壽命蛋白質(zhì)得到充分標(biāo)記的目的，隨后經(jīng)過一個長的冷凍過程以確保檢測開始時被標(biāo)記的短壽命蛋白質(zhì)已經(jīng)被降解了。下一步，測量來自未受損的細(xì)胞中或被灌注的器官中標(biāo)記蛋白的酸溶液的放射性依賴于時間的釋放。然而測量的降解中的一部分與自噬無關(guān)，所以必須在3-MA或者是氨基酸抑制自噬的濃度下進(jìn)行平行測量；然后從總測量值里減去這一部分?；パa的辦法是使用阻斷其它降解途徑的化合物，如蛋白酶抑制劑，由于不同降解系統(tǒng)間的干擾可能產(chǎn)生意想不到的結(jié)果。例如阻斷蛋白酶功能可以刺激自噬。因此，在特殊細(xì)胞類型和背景中進(jìn)行檢測時，了解所使用的抑制劑是否會改變自

45、噬十分關(guān)鍵。此外，在一些特定的條件下3-MA可能產(chǎn)生一些不依賴于自噬的效果，所以驗證3-MA敏感的降解是否對一般的溶酶體抑制劑（如氯化銨）也敏感是明智的。另外一個可以考慮的檢測方法依賴于甜菜堿高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（BHMT）融合蛋白的有限水解。先前的一項研究表明全長44kDa的BHMT在存在亮肽素的肝細(xì)胞溶酶體內(nèi)被切割生成32kDa的片段。32kDa片段的積累依賴于時間并且可以通過用自噬抑制劑處理而阻斷。這個標(biāo)記分子的一個修飾形式，GST-BHMT，可以和野生型蛋白質(zhì)的行為相似的在其它細(xì)胞系中表達(dá)。其它的底物可以考慮使用相似類型的檢測方法。例如，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II-GFP(NeoR-GFP)

46、融合蛋白是自噬的靶標(biāo)。將具有表達(dá)NeoR-GFP質(zhì)粒的淋巴母細(xì)胞繁殖一段時間后在3-MA中繼續(xù)繁殖，通過流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)這會引起NeoR-GFP蛋白的積累。注意 檢測長壽命蛋白質(zhì)的降解需要預(yù)先放射性標(biāo)記那些細(xì)胞（隨后把酸溶液從放射性酸不溶性物質(zhì)中分離出來），盡管這種標(biāo)記在培養(yǎng)的細(xì)胞中很容易操作，但是這樣的脈沖追蹤實驗不適用于動物中，雖然它們可以在灌流的器官中實現(xiàn)。在細(xì)胞中，也可以通過色譜的方法來檢測未標(biāo)記氨基酸的釋放，因而免除了預(yù)標(biāo)記的必要。在任何情況下，一個潛在的問題是被釋放的氨基酸可能繼續(xù)參與代謝。例如，支鏈氨基酸在肝細(xì)胞中是很好的水解指示標(biāo)志，但是在肌細(xì)胞中它們被進(jìn)一步氧化。更進(jìn)一步的

47、說，氨基酸可以重新組合成蛋白質(zhì)；因此，類似的實驗可以在存在放線菌酮的條件下進(jìn)行，但是這又會引起額外的需要關(guān)注的地方（詳見下文中的自噬區(qū)間的周轉(zhuǎn)周期）。在標(biāo)記的氨基酸的情況下，在示蹤氨基酸過剩的地方追加未標(biāo)記的氨基酸（注意不要使用抑制自噬的氨基酸），或者采用單次通過灌注器官或超灌注細(xì)胞的方法。灌注器官系統(tǒng)也允許水解效果的可逆性檢測和在同一個實驗的準(zhǔn)備階段使用特異性自噬抑制劑，這是適當(dāng)評估的關(guān)鍵性控制手段。如果自噬蛋白的降解水平很低（有可能發(fā)生在培養(yǎng)基供應(yīng)充足的細(xì)胞中），那么在與非自噬相關(guān)的降解水平高的背景下測量自噬蛋白的水解可能會十分困難。還應(yīng)當(dāng)指出，通常做法中所說的在“降解條件”下培養(yǎng)細(xì)胞指的

48、是在含鹽的緩沖液中培養(yǎng)，指示的是自噬的潛在能力（可達(dá)到的最大活性），而不是一般體內(nèi)培養(yǎng)或是在營養(yǎng)豐富的條件培養(yǎng)下的自噬能力。最后，某一降解途徑的抑制通常伴隨著另外一條途徑的增加，因為細(xì)胞試圖補償降解能力的下降。這種補償在試圖抑制巨自噬的條件下，可能會干擾對照物的測量；然而，由于后者是主要的降解途徑，所以在這類實驗中其它類型的降解的貢獻(xiàn)往往是可以忽略的。2.LC3-II的周轉(zhuǎn)周期 在存在和不存在降解溶酶體的條件下，自噬通量可以通過利用western印跡（圖2）的方法推斷LC3-II的周轉(zhuǎn)周期來測量。阻止溶酶體降解的方法有，使用蛋白酶抑制劑（亮肽素和E64d），改變?nèi)苊阁wpH的巴弗洛霉素A1等藥物

49、，或者是使用阻斷自噬體和溶酶體融合的試劑。監(jiān)測自噬的方法的最近一項補充依賴于在某些類型的細(xì)胞中觀察到了LC3-II的一個亞群以胞質(zhì)的形式存在（LC3-IIs）。胞質(zhì)中LC3-IIs的含量和LC3-I占LC3-IIs的比例與自噬的改變相關(guān)聯(lián)，相比基于LC3-II的總含量的比例而言提供了一個更加準(zhǔn)確的測量通量的方法。這種方法的有效性已經(jīng)通過比較在鼠肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中的自噬蛋白水解通量而得到證實。這種方法的一個優(yōu)點是不需要自噬抑制劑或溶酶體抑制劑來阻斷LC3-II的降解。注意 在測量LC3-IIs/LC3-I時的一點重要說明即這種方法是否也適用于其它類型的細(xì)胞中還不清楚，而且在許多標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞類型中

50、，如HeLa, HEK293和PC12，沒有觀察到溶解形態(tài)的LC3-II。此外，同樣的顧慮適用于用western印跡的方法檢測LC3-I。需要注意的是LC3-IIs/LC3-I的比例必須使用細(xì)胞質(zhì)組分進(jìn)行分析，而不是總的勻漿混合物。此外，在上文中關(guān)于使用LC3進(jìn)行定量分析自噬的說明同樣適用于使用這種標(biāo)記分子追蹤通量的情況。放射性脈沖追蹤的使用提供了可替代溶酶體蛋白酶抑制劑的析方法，盡管這些抑制劑仍然要被用于確認(rèn)降解是依賴于溶酶體的。此外，使用藥物時濃度要適宜，時間跨度要在抑制融合或降解中有效，但是又不引起細(xì)胞死亡。因此，在使用酶抑制劑成問題的地方和脈沖標(biāo)記需要短期培養(yǎng)的條件可能誘導(dǎo)自噬的地方，

51、這技術(shù)也許不可能在所有類型的細(xì)胞中或整個機體的組織中都成熟應(yīng)用。如果其它的底物可以同時被監(jiān)測，那么追蹤LC3-II的周轉(zhuǎn)周期可能就不是絕對必要的了。例如，LC3-II和去除了一個自噬底物（例如被研究人員用于神經(jīng)退行性疾病研究的polyQ-expanded蛋白，或者是一個細(xì)胞器）的溶酶體（理想的認(rèn)為是自噬特異性的）的結(jié)合體含量的增加，并沒有為自噬通量的獨立評估提供一個好的蛋白酶底物。3. GFP-Atg8/LC3溶酶體運輸和蛋白水解 GFP-LC3B(GFP-LC3)也被用于追蹤通量。首先，當(dāng)GFP-Atg8或者GFP-LC3被運輸?shù)饺苊阁w后，嵌合體中的Atg8/LC3部分對降解敏感，而GFP蛋

52、白（盡管不是綠色熒光）相對來說抗水解。因此，用western印跡的方法顯示游離的GFP可以用來檢測自噬體內(nèi)膜的裂解和底物的降解（圖5）。GFP-LC3向溶酶體的移動也可以通過熒光顯微鏡檢測出來，盡管GFP熒光信號對酸性pH比對其它熒光團更敏感。在這兩種情況下，由于GFP-LC3不斷被合成，所以用GFP熒光來追蹤通量都存在一定的問題。這一問題的可能解決方法是使用一個光催化的熒光蛋白，使得這種檢測方法在本質(zhì)上和脈沖/追蹤分析方法一樣。另外一種追蹤通量的替代方法是通過向表達(dá)GFP-LC3的細(xì)胞中添加溶酶體蛋白酶抑制劑來使用GFP-LC3熒光，檢測亮點數(shù)量上的變化。在這種情況下，溶酶體抑制劑的存在會使

53、得GFP-LC3陽性結(jié)構(gòu)的數(shù)目增加，如果對GFP-LC3亮點的總數(shù)或者顯示大量亮點的細(xì)胞的百分比沒有影響，那么可能暗示著自噬通量的缺陷。蛋白酶抑制劑（阻止GFP的降解）或者是像氯化銨和氯喹一樣能修飾溶酶體pH值的化合物，抑或是像巴弗洛霉素A1的藥物，和阻斷自噬體與溶酶體融合的化合物（如長春堿）的結(jié)合體可能能夠最有效的阻止依賴于溶酶體的GFP-LC3亮點的減少。然而由于GFP的穩(wěn)定性受溶酶體pH的影響，我們建議在使用蛋白酶抑制劑時是否將超溶酶體（lysosomotropic）化合物和融合抑制劑均加入進(jìn)來。最后，最近發(fā)明了一種利用有熒光活性細(xì)胞的分選來定量分析LC3-II的周轉(zhuǎn)周期的新方法。注意

54、GFP-LC3的加工檢測的主要限制的是，它似乎依賴于細(xì)胞類型和培養(yǎng)條件。顯然，GFP對哺乳動物細(xì)胞溶酶體的水解酶要比酵母液泡中的降解環(huán)境更加敏感。此外，溶酶體相對于液泡來說的低pH值可能對檢測游離的GFP有影響。因此，使用這種方法時必須伴隨使用包括對照物的免疫印跡，來確定非溶酶體GFP的穩(wěn)定性，如GFP-LC3-I。沿著這些思路，關(guān)于使用eGFP熒光蛋白顯微鏡的一個警告是，這種熒光團最適強度熒光的pH是中性的，所以其信號可能會在pH值降低時迅速減少。因此，最好選用其它的一些熒光團，如紅色熒光蛋白（RFP）或mCherry，它們在酸性條件下仍保持一定的熒光強度。除了RFP和mCherry之外另外

55、一種供選擇的方法是使用YFP的Venus variant，它比mRFP更明亮，對pH沒有GFP敏感。當(dāng)用到GFP-LC3的結(jié)構(gòu)時，考慮eGFP的最適pH很重要，因為最初的GFP-LC3標(biāo)記分子要使用eGFP的變體，這可能導(dǎo)致amphisomes或自噬體形成信號的降低。當(dāng)使用光催化的結(jié)構(gòu)PA-GFP需要注意，光子激活這一過程時可能會誘導(dǎo)DNA的損傷，反過來引起自噬的誘導(dǎo)。最后，GFP相對來說抗變性，需要煮沸5分鐘以防止折疊的蛋白質(zhì)在的SDS-PAGE凝膠電泳期間被截留在濃縮膠中。4.p62 western印跡 除了LC3，在特定的條件下也可以把p62/SQSTM1作為標(biāo)記分子使用。P62蛋白的作

56、用是聯(lián)系LC3和泛素化底物。p62被包含到完整的自噬體中，在自噬泡階段被降解（圖6A）。最近的一項研究表明p62含量的增加與自噬的抑制相關(guān)，指出這種蛋白穩(wěn)定狀態(tài)下的含量反映了自噬過程的狀態(tài)。有趣的是，最近的一個報告顯示p62參與到包涵體的形成過程，并且p62的缺失引起自噬不足從而減輕肝的損傷。相反，p62的缺失對神經(jīng)元退化的影響很小，暗示了與包涵體相關(guān)病狀的細(xì)胞類型特異性性質(zhì)。注意 p62存在一個問題即目前還不知道這個蛋白是不是自噬的一般標(biāo)記，盡管它與LC3以及泛素化底物連接緊密。另外，它最易應(yīng)用于評估下調(diào)調(diào)節(jié)，而不是自噬的誘導(dǎo)（例如只有當(dāng)自噬過程被阻斷時p62的含量才上升；圖6B）。例如，在

57、自噬被誘導(dǎo)三十分鐘后p62的含量沒有明顯的不同，而LC3-II的改變這時已經(jīng)能被檢測出來。更進(jìn)一步說，檢測內(nèi)源性p62的含量十分必要，因為這種蛋白質(zhì)的過表達(dá)將引起蛋白質(zhì)包裹體的形成。實際上，即使是內(nèi)源性的p62在蛋白聚合體存在和自噬降解被抑制時也會變的不溶于Triton X-100；因此利用這種蛋白而產(chǎn)生的結(jié)果往往是依賴于背景環(huán)境的。此外，p62還參與到蛋白酶降解過程中，當(dāng)?shù)鞍酌副灰种茣r它的含量也可能增加。最后，在特定條件下，p62可能引起轉(zhuǎn)錄上調(diào)，這使得解釋結(jié)果更加的復(fù)雜?？傊m然p62的分析有助于評估自噬的減值，但是我們不建議單獨使用p62來監(jiān)測通量。5.自噬隔離的檢測 自噬的活性也可以

58、通過自噬底物的隔離，（電鍍）注射如3H蜜三糖的惰性細(xì)胞質(zhì)標(biāo)記分子，或者內(nèi)源性細(xì)胞質(zhì)蛋白如乳酸脫氫酶的方法來檢測，在后一種情況下用蛋白酶抑制劑（如亮肽素）處理可以阻止蛋白質(zhì)標(biāo)記分子在溶酶體內(nèi)的降解。這種分析十分簡易的檢測底物從細(xì)胞中的可溶性（細(xì)胞質(zhì)）部分向不可溶性（沉淀）部分（包括自噬的部分）的轉(zhuǎn)移，不需要復(fù)雜精細(xì)的亞細(xì)胞分離（一種可能與離心功能相同的滲濾法，盡管驗證過濾膜不會破壞去核上清部分物質(zhì)的完整性十分有必要）。底物分子可以通過酶催化分析或western印跡的方法進(jìn)行定量。原則上講，細(xì)胞內(nèi)的任何成分均可以作為底物標(biāo)記分子，但是具有低沉淀特性的細(xì)胞質(zhì)酶類是最好的選擇。與膜相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記分子不是

59、十分適用，像LC3蛋白這樣本身是隔離體一部分的標(biāo)記分子，相對于純化的底物標(biāo)記分子，如乳酸脫氫酶，與自噬通量的關(guān)系更加復(fù)雜。然而，由于根據(jù)細(xì)胞所處的環(huán)境不同的途徑均可以降解同一種蛋白，所以證實在巨自噬用3-MA阻斷后或者是Atg蛋白基因被敲除后，標(biāo)記分子蛋白的降解速率不再明顯改變十分重要。隔離體分析可以被用來在自噬途徑上的某一步測量通量。例如，微管抑制劑長春花堿可以阻斷自噬體和溶酶體融合，溶酶體內(nèi)隔離體降解探針14C乳酸標(biāo)記的只能是細(xì)胞中用抑制劑處理過的前溶酶體單元，這些已經(jīng)被用于為監(jiān)測整個的自噬途徑(autophagic lactolysis)獲得背景控制條件下的數(shù)據(jù)。需要提醒一點，有些抑制劑會通過未知的機制（見自噬的抑制和誘導(dǎo)）促進(jìn)促進(jìn)隔離體的產(chǎn)生。這種方法的變型適用于哺乳動物細(xì)胞中，包括活細(xì)胞成像技術(shù)。自噬的誘導(dǎo)通過底物（如線粒體）運動到GFP-LC3共定位區(qū)域來檢測的，然后通量/流量通過底物輸送到溶酶體而檢測得到。此外，被膜結(jié)構(gòu)隔離的熒光標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)蛋白可以被