質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上實驗26質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌該實驗主要有兩個用途：1重組質(zhì)粒的鑒定。當(dāng)質(zhì)粒的重組或其它載體重組后，通常會發(fā)生質(zhì)粒的重組失敗，包括質(zhì)粒的自身環(huán)化。因而要求進(jìn)行篩選，把重組成功的質(zhì)粒找出來。在目前常用的質(zhì)粒和其它載體中含有相應(yīng)的抗生素抗性基因，一旦重組成功，質(zhì)粒環(huán)化（包括自身環(huán)化），抗生素抗性基因表達(dá)，被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌便具備抗相應(yīng)抗生素的能力，可以含該抗生素的培養(yǎng)基中生長傳代，不然，重組失敗，大腸桿菌便不能抵抗該抗生素而死亡。2為擴(kuò)增質(zhì)粒和其它載體作準(zhǔn)備。由于大腸桿菌繁殖快，在適宜的條件下繁殖一代僅需要2030分鐘，而且常用質(zhì)粒可以在大腸桿菌中達(dá)到幾百個拷貝，因此，通過對轉(zhuǎn)化

2、成功的大腸桿菌培養(yǎng)，可以在短時內(nèi)極大地擴(kuò)增目的質(zhì)粒。（作為分子生物學(xué)用大腸桿菌，是經(jīng)過實驗室改造過的工程菌。）原 理本實驗通過CaCl2對特定的大腸桿菌處理，制備感受態(tài)的細(xì)菌。這些細(xì)菌可使每微克超螺旋質(zhì)粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重組質(zhì)粒，產(chǎn)生5×1062×107 個轉(zhuǎn)化的菌落。當(dāng)質(zhì)粒與這些大腸桿菌混合后，質(zhì)粒粘附在大腸桿菌的表面，在42的溫度時，大腸桿菌出現(xiàn)熱休克，質(zhì)?？赏ㄟ^大腸桿菌細(xì)胞膜上形成的空隙進(jìn)入菌體內(nèi)。隨后，加入LB培養(yǎng)液，于37振動培養(yǎng)可使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因，提高轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌可以在相應(yīng)抗生素培養(yǎng)皿中傳代，形成菌落

3、。實驗準(zhǔn)備一器材天平、秤量匙、秤量皿加熱磁力攪拌器、攪拌子可調(diào)移液器P1000、P200、P20及其經(jīng)消毒的盒裝藍(lán)、黃吸頭經(jīng)消毒的1.5ml Eppendorf管、試管架及其水浴用試管架定時器、記號筆、一次性手套和筒紙42恒溫水浴4和-70冰箱煤氣燈或酒精燈恒溫培養(yǎng)搖床（調(diào)至37，225rpm）37培養(yǎng)箱玻璃涂棒（普通玻璃吸管，細(xì)頭部在煤氣燈上燒成“L”形）消毒過的潔凈培養(yǎng)皿（直徑10cm）二試劑LB培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨10g細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5gNaCl 5g 加800ml水，放入磁力攪拌棒，在磁力攪拌器上攪拌至徹底溶解，用5M NaOH（約0.2 ml）調(diào)節(jié)pH值至7.0，加水定容

4、至1000 ml。高壓15 lbf/in2（1.034×105pa）消毒30分鐘，冷卻后可加入氨芐青霉素（50mg/ml）500ul，視載體特性而定，混勻，即為含抗生素的LB培養(yǎng)液。存放于避光處。含有瓊脂的培養(yǎng)基即在以上1000ml培養(yǎng)基中加入15g細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂?？股丨傊桨宕协傊呐囵B(yǎng)基冷卻后，加入抗生素，傾入培養(yǎng)皿，約3050 ml，用煤氣燈火焰掠過培養(yǎng)基表面，以消除氣泡。冷卻后，標(biāo)記，封于塑料袋中，倒置，于4冰箱內(nèi)避光保存。pH試紙（或pH計）三實驗材料來源于實驗一的重組質(zhì)粒受感態(tài)大腸桿菌碎冰及碎冰保溫盛器 實驗步驟自-70冰箱中取出受感態(tài)大腸桿菌，插入濕冰中溶解約15

5、分鐘，輕輕混勻。吸取50ul移入1.5ml管，并立刻將細(xì)菌放回-70冰箱。細(xì)菌 50 ulDNA 5 ul 輕輕混勻，靜置冰上30分鐘。于42水浴中熱休克細(xì)菌45秒，迅速移入濕冰中，靜置2分鐘，加入900ul LB培養(yǎng)液，放入37恒溫箱搖床，225rpm搖晃培養(yǎng)1小時。取50ul涂于含氨卞青霉素的LB瓊脂平板皿上，待干燥后，倒置，存放于37的培養(yǎng)箱中過夜。次日，檢查各培養(yǎng)皿中是否出現(xiàn)菌落。實驗結(jié)果轉(zhuǎn)化成功，培養(yǎng)皿中可見散在的菌落。轉(zhuǎn)化失敗，培養(yǎng)皿上無菌落，或菌落布滿如苔樣，后者提示可能是抗生素濃度不夠或失效。實驗27 陽性單菌落擴(kuò)增與小量DNA制備目 的1為進(jìn)一步鑒定重組質(zhì)粒提供適量的質(zhì)粒DN

6、A。排除自身環(huán)化。鑒定方法主要有：（1）PCR法及其利弊。采用載體兩端的引物進(jìn)行PCR，一旦插入成功，則可以在電泳的凝膠中見到與插入片段分子量大小一致的PCR產(chǎn)物。（2）Southern blot法及其利弊。將培養(yǎng)皿上的菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，變性、固定，以插入片段為探針作Southern blot。重組成功者，在相應(yīng)的菌落位置上可以見到放射自顯影的黑點，培養(yǎng)皿上對應(yīng)的菌落即為重組成功者。（3）酶切鑒定法及其利弊。2提供一定數(shù)量的DNA以滿足一些實驗，比如1）測序、2）準(zhǔn)備雜交用的探針。這便是本實驗的兩個主要目的。有關(guān)微型真空柱和離心柱的利弊。原理與本實驗近似，區(qū)別在于DNA的回收不是采用酒

7、精沉淀，而痕量乙醇，這將妨礙一些對乙醇敏感的酶的活性，使后續(xù)的工作困難。原 理挑選單一菌落，培養(yǎng)擴(kuò)增。離心收集擴(kuò)增了的大腸桿菌，用堿性液裂解細(xì)菌，再經(jīng)酸性溶液形成鉀-SDS-蛋白質(zhì)-膜復(fù)合物，離心后，此復(fù)合物與細(xì)菌染色體DNA、高分子量的RNA得到沉淀，而細(xì)菌中小分子量的質(zhì)粒DNA溶于上清之中。上清經(jīng)乙醇沉淀后，得到質(zhì)粒DNA。實驗準(zhǔn)備一器材Falcon 2070管臺式Eppendorf管離心機可調(diào)移液器P1000、P200、P20及其經(jīng)消毒的盒裝藍(lán)、黃吸頭經(jīng)消毒的1.5ml Eppendorf管、試管架及其水浴用試管架定時器、記號筆、一次性手套和筒紙4和20冰箱煤氣燈或酒精燈恒溫培養(yǎng)搖床（調(diào)

8、至37，240rpm）臺式4 Eppendorf管離心機離心真空干燥器37水浴二試劑含抗生素的LB培養(yǎng)液TE（10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0）100預(yù)冷乙醇75預(yù)冷乙醇RNase （10mg/ml）3M NaAC溶液I50 mM 葡萄糖25 mM Tris.Cl （pH 8.0）10 mM EDTA （pH 8.0） 在10 lbf/in2（6.895*104pa）高壓滅菌15分鐘，貯存于4。溶液II0.2 N NaOH1 SDS溶液III5 M 乙酸鉀 300 ml冰乙酸 58 ml水 142 ml 存于4。消毒過的雙蒸水三實驗材料含陽性菌落的培養(yǎng)皿碎冰及碎冰保溫盛器實驗

9、步驟1第一天（通常為下午）從瓊脂平板上挑取單一菌落，接種到Falcon管內(nèi)的5ml LB培養(yǎng)液（含氨卞青霉素）中。放入37恒溫?fù)u床，225-250 rpm劇烈搖晃培養(yǎng)過夜（O/N）。2第二天（通常上午開始）（1）吸取1.5ml培養(yǎng)液，移入Eppendorf管中，臺式離心機室溫下1.4萬轉(zhuǎn)離心2分鐘，棄上清，重復(fù)一次，以取得較大的沉淀。剩余培養(yǎng)液存入4冰箱。（2）棄上清，加入100ul溶液I，蓋上蓋，劇烈震蕩（可以將管底抵于試管架面上，劃15下），充分浮懸細(xì)胞沉淀，置-20冰箱內(nèi)5分鐘。（3）自冰箱中取出試管，加入200ul溶液II，輕輕顛倒混勻，放于冰上5分鐘。（4）加入150ul溶液III，輕輕顛倒混勻，放于冰上15分鐘。（5）放入臺式離心機，室溫下1.4萬轉(zhuǎn)離心3分鐘，將上清移入一新的Eppendorf管，加入1ml 100乙醇，混勻，放入-20冰箱5分鐘。（6）自冰箱中取出試管，迅速移入4環(huán)境下的臺式離心機，1.4萬轉(zhuǎn)離心5分鐘，小心棄去上清，倒置試管于紙巾上流盡乙醇。（7）加入300ul TE和2ul RNase，重浮懸沉淀，放試管于37的水浴中溫育30分鐘。（8）加入3M NaAC 34ul，混勻，加入1ml預(yù)冷的100乙醇，-20存