核酸雜交技術(shù)

1、第四章第四章 核酸雜交技術(shù)核酸雜交技術(shù) 目 錄第一節(jié)第一節(jié) 核酸分子雜交的概念核酸分子雜交的概念一、核酸探針一、核酸探針二、分子雜交信號檢測二、分子雜交信號檢測第二節(jié)第二節(jié) 經(jīng)典的核酸分子雜交技術(shù)經(jīng)典的核酸分子雜交技術(shù)一、固相雜交一、固相雜交二、液相雜交二、液相雜交目 錄第四節(jié)第四節(jié) 影響雜交信號檢測的因素影響雜交信號檢測的因素一、探針的選擇一、探針的選擇二、探針的標(biāo)記方法二、探針的標(biāo)記方法三、探針的濃度三、探針的濃度四、雜交率四、雜交率五、雜交溫度五、雜交溫度六、雜交的嚴(yán)格謹(jǐn)性六、雜交的嚴(yán)格謹(jǐn)性七、雜交反應(yīng)時(shí)間七、雜交反應(yīng)時(shí)間八、雜交促進(jìn)劑八、雜交促進(jìn)劑核酸分子雜交(molecular hy

2、bridization of nucleic acid)核酸分子雜交核酸分子雜交：單鏈的核酸分子在合適的條：單鏈的核酸分子在合適的條件下，與具有堿基互補(bǔ)序列的異源核酸形成雙件下，與具有堿基互補(bǔ)序列的異源核酸形成雙鏈雜交體的過程。鏈雜交體的過程。核酸分子雜交技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)：利用核酸分子雜交檢測：利用核酸分子雜交檢測靶序列的一類技術(shù)稱核酸分子雜交技術(shù)。靶序列的一類技術(shù)稱核酸分子雜交技術(shù)。核酸分子雜交技術(shù)目前應(yīng)用廣泛，是定性或核酸分子雜交技術(shù)目前應(yīng)用廣泛，是定性或定量檢測特異定量檢測特異RNARNA或或DNADNA序列片段的有力工具。序列片段的有力工具。第一節(jié)第一節(jié) 核酸分子雜交的概念核酸分子

3、雜交的概念變性變性 退火退火 復(fù)性復(fù)性核酸分子雜交的基本原理1 1、變性（、變性（denaturationdenaturation）定義：在一定的條件下，雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，定義：在一定的條件下，雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成無規(guī)則線團(tuán)，雙鏈解鏈成為單鏈。形成無規(guī)則線團(tuán)，雙鏈解鏈成為單鏈。 2 2、融解溫度、融解溫度 (Melting Temperature, Tm)(Melting Temperature, Tm)定義：在定義：在DNADNA熱變性時(shí)，其熱變性時(shí)，其A260A260的升高達(dá)最大值一半時(shí)的溫度。的升高達(dá)最大值一半時(shí)的溫度。影響影響TmTm的因素：的因素： （1

4、）DNA堿基的組成 G-C含量越多 Tm值越高 A-T含量越多 Tm值越低 （2）溶液的離子強(qiáng)度 低離子強(qiáng)度 Tm值越低 高離子強(qiáng)度 Tm值越高 （3）pH值 pH值5-9 Tm值變化不明顯 pH11 不利于氫鍵形成 （4）變性劑 干擾堿基堆積力和氫鍵的形成3.3.復(fù)性復(fù)性 變性變性DNADNA經(jīng)過一定處理重新形成雙螺旋的過程。經(jīng)過一定處理重新形成雙螺旋的過程。影響復(fù)性速度的因素：影響復(fù)性速度的因素： DNA濃度 DNA片段的大小 DNA片段復(fù)雜性 合適的復(fù)性溫度 適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度重點(diǎn)提示 分子雜交：指具有一定同源序列的兩條核酸單鏈（DNA或RNA），在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對原則經(jīng)過退火處理，

5、形成異質(zhì)雙鏈的過程。利用這一原理，就可以使用已知序列的單鏈核酸片段作為探針，去查找各種不同來源的基因組DNA分子中的同源基因或同源序列。一、核酸探針一、核酸探針 核酸探針指能與靶核酸序列發(fā)生堿基互補(bǔ)雜交，并能由其標(biāo)記被特異性檢測的核酸分子。探針的種類探針的種類寡核苷酸探針寡核苷酸探針基因組基因組DNADNA探針探針cDNAcDNA探針探針RNARNA探針探針DNADNA探針探針（一一）常用探針的種類）常用探針的種類1. DNA探針探針 最常用的核酸探針三大三大優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 這類探針大多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，制這類探針大多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，制備方法簡便；備方法簡便； DN

6、ADNA探針相對不易被降解，一般探針相對不易被降解，一般DNADNA酶活性能有效地酶活性能有效地被抑制；被抑制； DNADNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移法、隨機(jī)引物法、如缺口平移法、隨機(jī)引物法、PCRPCR標(biāo)記法等，能用于標(biāo)記法等，能用于放射性核素和非放射性物質(zhì)標(biāo)記。放射性核素和非放射性物質(zhì)標(biāo)記。 2.RNA探針探針 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：雜交效率高，穩(wěn)定性高，非特異性雜交效率高，穩(wěn)定性高，非特異性雜交較少，未雜交探針可用雜交較少，未雜交探針可用RNase RNase 降解，降解，減少本底的干擾。減少本底的干擾。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：易降解，標(biāo)

7、記方法復(fù)雜易降解，標(biāo)記方法復(fù)雜 。3.3.寡核苷酸探針寡核苷酸探針寡核苷酸探針一般由寡核苷酸探針一般由17175050個(gè)核苷酸組成。個(gè)核苷酸組成。優(yōu)勢：優(yōu)勢：可以區(qū)分僅僅一個(gè)堿基差別的靶序列；可以區(qū)分僅僅一個(gè)堿基差別的靶序列；缺陷：缺陷：寡核苷酸不如長的雜化核酸分子穩(wěn)定，寡核苷酸不如長的雜化核酸分子穩(wěn)定，需優(yōu)化雜交和洗脫條件以保證寡核苷酸探針需優(yōu)化雜交和洗脫條件以保證寡核苷酸探針雜交的特異性。雜交的特異性。（二）探針的長度（二）探針的長度1.DNA和和RNA探針探針 DNA探針通常為探針通常為400500個(gè)堿基個(gè)堿基2. 寡核苷酸探針寡核苷酸探針 探針的最小長度取決于其靶序列的復(fù)雜性探針的最小

8、長度取決于其靶序列的復(fù)雜性（三）核酸探針的標(biāo)記 1. 1. 探針標(biāo)記物的選擇探針標(biāo)記物的選擇（1 1）放射性標(biāo)記）放射性標(biāo)記（2 2）非放射性標(biāo)記）非放射性標(biāo)記根據(jù)標(biāo)記物摻入情況可分為根據(jù)標(biāo)記物摻入情況可分為均勻標(biāo)記均勻標(biāo)記和和末端標(biāo)記末端標(biāo)記探針。探針。不同標(biāo)記類型探針的比較： 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)缺點(diǎn)放射性探放射性探針針可以準(zhǔn)確定量；靈可以準(zhǔn)確定量；靈敏度高；本底低；敏度高；本底低；易于除去舊探針易于除去舊探針, ,重新雜交新探針重新雜交新探針短半衰期的探針需臨用短半衰期的探針需臨用前制備；放射性遞減使前制備；放射性遞減使探針降解；放射性物質(zhì)探針降解；放射性物質(zhì)對人體有害；費(fèi)用貴對人體有害；費(fèi)用貴

9、非放射性非放射性探針探針對人體危害??；穩(wěn)對人體危害??；穩(wěn)定，可供長時(shí)間內(nèi)定，可供長時(shí)間內(nèi)持續(xù)使用；檢測過持續(xù)使用；檢測過程快；可同時(shí)進(jìn)行程快；可同時(shí)進(jìn)行不同標(biāo)記探針的雜不同標(biāo)記探針的雜交；本底較低交；本底較低靈敏度不如放射性探針；靈敏度不如放射性探針；雜交條件受報(bào)告基團(tuán)的雜交條件受報(bào)告基團(tuán)的限制；重新雜交新探針限制；重新雜交新探針比較困難比較困難2.2.探針標(biāo)記方法的選擇探針標(biāo)記方法的選擇 制備探針步驟：制備探針步驟：探針標(biāo)記探針標(biāo)記清除未標(biāo)記的核酸探針清除未標(biāo)記的核酸探針檢測探針標(biāo)記效率檢測探針標(biāo)記效率 核酸探針的標(biāo)記方法核酸探針的標(biāo)記方法(1) DNA(1) DNA切口平移標(biāo)記法切口平移標(biāo)

10、記法(2) DNA(2) DNA隨機(jī)引物標(biāo)記法隨機(jī)引物標(biāo)記法(3) DNA(3) DNA的末端標(biāo)記的末端標(biāo)記(7) RNA(7) RNA探針的標(biāo)記探針的標(biāo)記(4) cDNA(4) cDNA探針的標(biāo)記探針的標(biāo)記(5) (5) 寡核苷酸探針的標(biāo)記寡核苷酸探針的標(biāo)記(6) (6) 單鏈單鏈DNADNA探針的標(biāo)記探針的標(biāo)記隨機(jī)引物：含有各種可隨機(jī)引物：含有各種可能排列順序的寡核苷酸能排列順序的寡核苷酸片段的混合物。片段的混合物。DNADNA聚合酶聚合酶KlenowKlenow片段片段：保留保留53DNA53DNA聚合酶聚合酶活性活性, ,弱弱3535外切酶外切酶活性，無活性，無5353外切外切酶活性。

11、酶活性。（1 1）DNADNA隨機(jī)引物標(biāo)記隨機(jī)引物標(biāo)記5 3 3 5 32P-部分標(biāo)記的部分標(biāo)記的單鏈單鏈DNA片段片段切口切口原始原始位置位置切口切口最終最終位置位置32P-標(biāo)記的標(biāo)記的DNADNA聚合酶聚合酶I-32P-dCTP變性變性DNase I，Mg2+dATP，dGTP，dTTPDNADNA酶酶：在雙鏈：在雙鏈DNADNA上隨機(jī)打開若干個(gè)單上隨機(jī)打開若干個(gè)單鏈缺口，產(chǎn)生鏈缺口，產(chǎn)生3-OH3-OH端。端。大腸桿菌大腸桿菌DNADNA聚合酶聚合酶：53DNA53DNA聚合酶聚合酶活性；活性；53 53 外切外切核酸酶活性。核酸酶活性。（2 2）DNADNA切口平移標(biāo)記切口平移標(biāo)記 條

12、件是有條件是有5-5-OHOH存在，人工合成寡核苷酸最常用；雙鏈存在，人工合成寡核苷酸最常用；雙鏈DNADNA需用堿性磷酸酶切除需用堿性磷酸酶切除5-5-P P后再標(biāo)記后再標(biāo)記55p-HOp-HO-CpGpTpA3-CpGpTpA355HO-HO-CpGpTpA3CpGpTpA3T4T4噬菌體多核苷酸激酶噬菌體多核苷酸激酶-3232P-ATPP-ATP553232p p-O-CpGpTpA3-O-CpGpTpA33737，反應(yīng)，反應(yīng)10min, -10min, -3232P-ATP P-ATP 需需150 150 cici/ /反應(yīng)反應(yīng)1) DNA1) DNA的的55末端標(biāo)記末端標(biāo)記堿性磷酸酶

13、堿性磷酸酶(3) DNA(3) DNA的末端標(biāo)記的末端標(biāo)記5335完整雙鏈完整雙鏈DNADNA限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶5335-3232P-P-dNTPdNTP其他其他3 3 種種dNTPdNTPKlenowKlenow DNA DNA聚合酶聚合酶5335變性533555末端突出的末端突出的DNADNA33末端標(biāo)記的末端標(biāo)記的DNADNA3232P-P-末端標(biāo)記的末端標(biāo)記的單鏈單鏈DNADNA探針探針2) DNA2) DNA的的33末端標(biāo)記末端標(biāo)記二、分子雜交信號檢測（一）放射性標(biāo)記探針檢測（一）放射性標(biāo)記探針檢測1、放射自顯影、放射自顯影2、液體閃爍計(jì)數(shù)法、液體閃爍計(jì)數(shù)法（二）非放射性標(biāo)記探

14、針的雜交檢測（二）非放射性標(biāo)記探針的雜交檢測1、酶促顯色檢測、酶促顯色檢測2、熒光檢測、熒光檢測3、化學(xué)發(fā)光檢測、化學(xué)發(fā)光檢測4、多探針檢測、多探針檢測（一）放射性標(biāo)記探針檢測1. 1.放射自顯影放射自顯影 放射性雜交的檢測基于放射性核素釋放的放射性雜交的檢測基于放射性核素釋放的能量將照片紙感光的原理。能量將照片紙感光的原理。用用3232P P標(biāo)記雜交最常用的檢測方法是放射自標(biāo)記雜交最常用的檢測方法是放射自顯影。顯影。2.液體閃爍計(jì)數(shù)法 液體閃爍計(jì)數(shù)法的工作原理是被測樣液體閃爍計(jì)數(shù)法的工作原理是被測樣品輻射發(fā)出的輻射能經(jīng)溶劑分子傳遞給閃品輻射發(fā)出的輻射能經(jīng)溶劑分子傳遞給閃爍劑分子，當(dāng)被激發(fā)的閃

15、爍劑分子從激發(fā)爍劑分子，當(dāng)被激發(fā)的閃爍劑分子從激發(fā)態(tài)退激為穩(wěn)態(tài)時(shí)，以熒光光子的形式輻射態(tài)退激為穩(wěn)態(tài)時(shí)，以熒光光子的形式輻射能量，經(jīng)光電倍增管放大并被測量，就可能量，經(jīng)光電倍增管放大并被測量，就可以實(shí)現(xiàn)對放射性核素的測定。以實(shí)現(xiàn)對放射性核素的測定。（二）非放射性標(biāo)記探針的雜交檢測 1. 1.酶促顯色檢測酶促顯色檢測（1 1）直接檢測）直接檢測酶本身作為標(biāo)記分子摻入到核酸中去，在洗脫后酶本身作為標(biāo)記分子摻入到核酸中去，在洗脫后就可直接進(jìn)行檢測。就可直接進(jìn)行檢測。酶直接作用于酶直接作用于顯色顯色的底物，產(chǎn)生顏色沉淀，顯色的底物，產(chǎn)生顏色沉淀，顯色沉淀可用肉眼檢測。沉淀可用肉眼檢測。酶直接作用于酶直接

16、作用于化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光的底物發(fā)光的底物發(fā)光, , 發(fā)光的檢測發(fā)光的檢測要依賴于對藍(lán)光敏感的要依賴于對藍(lán)光敏感的X X膠片。膠片。這種檢測法常用于這種檢測法常用于寡核苷酸探針雜交寡核苷酸探針雜交，這類雜交，這類雜交反應(yīng)反應(yīng)溫度低溫度低。 堿性磷酸酶顯色反應(yīng)示意圖堿性磷酸酶顯色反應(yīng)示意圖HRPHRP酶顯色反應(yīng)示意圖酶顯色反應(yīng)示意圖(DAB)(TMB)Dig：半抗原，可通過抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)與顯色體系偶聯(lián)：半抗原，可通過抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)與顯色體系偶聯(lián)Dig-DNADig-DNA探針探針 + + 抗抗DigDig抗體抗體- -堿性磷酸酶堿性磷酸酶（或辣根過（或辣根過氧化物酶）氧化物酶）+ + 底物底物（

17、2）間接檢測）間接檢測 檢測含地高辛、熒光素或生物素標(biāo)記的探針時(shí)，檢測含地高辛、熒光素或生物素標(biāo)記的探針時(shí)，就要增加一個(gè)將酶連接到雜化核酸分子上的步驟。就要增加一個(gè)將酶連接到雜化核酸分子上的步驟。 熒光素：一類能在激發(fā)光作用下發(fā)射出熒光的物質(zhì)熒光素：一類能在激發(fā)光作用下發(fā)射出熒光的物質(zhì) 熒光顯微鏡觀察、免疫組織化學(xué)法熒光顯微鏡觀察、免疫組織化學(xué)法 2 2熒光檢測熒光檢測 化學(xué)發(fā)光是指化學(xué)反應(yīng)中釋放的能量以光的形式化學(xué)發(fā)光是指化學(xué)反應(yīng)中釋放的能量以光的形式發(fā)射出來形成檢測信號。發(fā)射出來形成檢測信號。 化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)中目前常用的酶有化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)中目前常用的酶有堿性磷酸堿性磷酸酶及酶及辣根

18、過氧化物酶辣根過氧化物酶 發(fā)射光線的強(qiáng)度反映了酶的活性，反應(yīng)了雜化分發(fā)射光線的強(qiáng)度反映了酶的活性，反應(yīng)了雜化分子的量。子的量。 3 3化學(xué)發(fā)光底物化學(xué)發(fā)光底物 辣根過氧化物酶催化的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)辣根過氧化物酶催化的化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 采用發(fā)色體檢測的最大益處是可同時(shí)檢測一個(gè)以上的采用發(fā)色體檢測的最大益處是可同時(shí)檢測一個(gè)以上的雜化分子雜化分子 每種探針分別用不同的報(bào)告基團(tuán)如生物素、熒光素和每種探針分別用不同的報(bào)告基團(tuán)如生物素、熒光素和地高辛標(biāo)記并同時(shí)與固定在濾膜上的核酸雜交地高辛標(biāo)記并同時(shí)與固定在濾膜上的核酸雜交 采用不同的鏈霉抗生素或抗體采用不同的鏈霉抗生素或抗體- -酶和相應(yīng)底物組合酶和相應(yīng)底物組合

19、4 4多探針檢測多探針檢測 第二節(jié)第二節(jié) 經(jīng)典的核酸分子雜交技術(shù)經(jīng)典的核酸分子雜交技術(shù)核酸分子雜交分類核酸分子雜交分類根據(jù)雜交核酸分子的根據(jù)雜交核酸分子的種類種類 DNA DNA與與DNADNA雜交雜交 DNA DNA與與RNARNA雜交雜交 RNA RNA與與RNARNA雜交雜交根據(jù)雜交根據(jù)雜交探針標(biāo)記探針標(biāo)記 同位素雜交同位素雜交 非同位素雜交非同位素雜交根據(jù)根據(jù)雜交介質(zhì)雜交介質(zhì) 液相雜交液相雜交 固相雜交固相雜交 原位雜交原位雜交菌落雜交菌落雜交Southern印跡雜交印跡雜交Northern印跡雜交印跡雜交點(diǎn)雜交點(diǎn)雜交狹縫雜交狹縫雜交分子雜交技術(shù)一般過程分子雜交技術(shù)一般過程 探針制備及

20、標(biāo)記（同位素或非同位素）探針制備及標(biāo)記（同位素或非同位素） 待測核酸樣品制備（分離，純化）待測核酸樣品制備（分離，純化） 雜交（液相，固相，原位雜交）雜交（液相，固相，原位雜交） 雜交后處理（去掉非特異雜交分子）雜交后處理（去掉非特異雜交分子） 顯示結(jié)果（顯色，發(fā)光，放射自顯影）顯示結(jié)果（顯色，發(fā)光，放射自顯影） 結(jié)果分析結(jié)果分析固相雜交：固相雜交：先將待測單鏈核酸樣品結(jié)合到先將待測單鏈核酸樣品結(jié)合到固相固相支持物（常用有支持物（常用有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、化學(xué)活化膜等）上，然硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、化學(xué)活化膜等）上，然后與溶液中的已知序列的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，放射后與溶液中的已知序列的標(biāo)記探

21、針進(jìn)行雜交，放射自顯影分析雜交結(jié)果。自顯影分析雜交結(jié)果。（一）反向點(diǎn)雜交（一）反向點(diǎn)雜交反向點(diǎn)雜交（反向點(diǎn)雜交（reverse dot blot, RDBreverse dot blot, RDB） 是將多種探針固定在同一膜上，同時(shí)參與檢測的是將多種探針固定在同一膜上，同時(shí)參與檢測的樣品樣品DNADNA又互不干擾，又互不干擾， 故能一次性篩查出多種故能一次性篩查出多種不同的序列。不同的序列。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：簡單、快捷、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好簡單、快捷、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好 較較Northern blotNorthern blot省去了電泳和毛細(xì)轉(zhuǎn)膜過程省去了電泳和毛細(xì)轉(zhuǎn)膜過程（二）（二）Souther

22、n印跡雜交印跡雜交 Southern印跡雜交印跡雜交（Southern blot hybridization/ Southern blotting）是指）是指DNA與與DNA分子之間的雜交。分子之間的雜交?？捎糜诨蚪M可用于基因組DNA的定性與定量分析，重組質(zhì)粒的定性與定量分析，重組質(zhì)粒和噬菌體的分析等。和噬菌體的分析等。（二）（二）Southern印跡雜交印跡雜交包括兩個(gè)主要過程：包括兩個(gè)主要過程：將待測定核酸分子通過一定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到將待測定核酸分子通過一定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，一定的固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，即印跡（即印跡（blot

23、tingblotting）。）。固定于膜上的核酸與同位素標(biāo)記的探針在一定的固定于膜上的核酸與同位素標(biāo)記的探針在一定的溫度和離子強(qiáng)度下退火，即分子雜交過程。溫度和離子強(qiáng)度下退火，即分子雜交過程。SouthernSouthern印跡雜交的基本步驟：印跡雜交的基本步驟： 待測待測DNADNA樣品的限制性內(nèi)切酶消化樣品的限制性內(nèi)切酶消化 酶切酶切DNADNA樣品的電泳分離樣品的電泳分離 凝膠中凝膠中DNADNA的變性和的變性和SouthernSouthern轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移 探針的制備探針的制備 Southern Southern雜交雜交 雜交結(jié)果的檢測雜交結(jié)果的檢測限制性內(nèi)切酶消化限制性內(nèi)切酶消化酶切酶切D

24、NADNA樣品的電泳分離樣品的電泳分離凝膠中凝膠中DNADNA的的NaOHNaOH變變性性凝膠中凝膠中DNADNA分離帶分離帶SouthernSouthern印跡印跡凝膠中凝膠中DNADNA帶被帶被轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到NCNC膜上膜上標(biāo)記標(biāo)記探針探針雜交雜交探針雜交帶曝光顯探針雜交帶曝光顯影影SouthernSouthern雜交的應(yīng)用雜交的應(yīng)用 應(yīng)用應(yīng)用單基因遺傳病的基因診斷單基因遺傳病的基因診斷基因點(diǎn)突變的檢測基因點(diǎn)突變的檢測臨床應(yīng)用臨床應(yīng)用用于下列疾病的產(chǎn)前診斷用于下列疾病的產(chǎn)前診斷 鐮型細(xì)胞貧血鐮型細(xì)胞貧血 苯丙酮酸尿癥苯丙酮酸尿癥 珠蛋白合成障礙性貧血珠蛋白合成障礙性貧血 假肥大型肌營養(yǎng)不良假

25、肥大型肌營養(yǎng)不良 血友病血友病 慢性進(jìn)行型舞蹈病慢性進(jìn)行型舞蹈?。ㄈㄈ㎞orthern印跡雜交印跡雜交Northern 印跡（印跡（Northern blot）雜交是應(yīng)用雜交是應(yīng)用DNA探針探針檢測特異檢測特異mRNA的另一種膜上印跡技術(shù)。的另一種膜上印跡技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)的原理此項(xiàng)技術(shù)的原理和過程與和過程與Southern印跡基本相同，只是檢印跡基本相同，只是檢測的分子是測的分子是RNA，可用來對組織，可用來對組織或細(xì)胞中的或細(xì)胞中的mRNA進(jìn)行定性或定進(jìn)行定性或定量分析。量分析。Northern雜交應(yīng)用雜交應(yīng)用 1. RNA病毒的檢測病毒的檢測2. 基因表達(dá)的檢測基因表達(dá)的檢測North

26、ern印跡技術(shù)被認(rèn)為是檢測基因表達(dá)印跡技術(shù)被認(rèn)為是檢測基因表達(dá)水平的金標(biāo)準(zhǔn)。水平的金標(biāo)準(zhǔn)。 二、液相雜交 液相雜交是指待測核酸和探針都存在于液相雜交是指待測核酸和探針都存在于雜交液雜交液中，探針與待測核酸在液體環(huán)境中按照堿基互補(bǔ)配中，探針與待測核酸在液體環(huán)境中按照堿基互補(bǔ)配對形成雜交分子的過程。對形成雜交分子的過程。液相雜交液相雜交 一種研究最早且操作簡便的雜交類型。一種研究最早且操作簡便的雜交類型。 原理原理和反應(yīng)條件與固相雜交基本相同，僅是將待和反應(yīng)條件與固相雜交基本相同，僅是將待檢測的核酸樣品和雜交探針同時(shí)溶于雜交液中進(jìn)行檢測的核酸樣品和雜交探針同時(shí)溶于雜交液中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)。 液相雜交

27、后過量的未雜交探針在溶液中除去較困液相雜交后過量的未雜交探針在溶液中除去較困難，同源與異源的難，同源與異源的DNA分子在雜交的過程中會(huì)發(fā)生分子在雜交的過程中會(huì)發(fā)生競爭，使得雜交結(jié)果的分析十分困難。競爭，使得雜交結(jié)果的分析十分困難。 因此液相雜交應(yīng)用較少因此液相雜交應(yīng)用較少三、原位雜交 應(yīng)用核酸探針與應(yīng)用核酸探針與組織或細(xì)胞中組織或細(xì)胞中的的核酸核酸按堿基配對原則進(jìn)行特異性結(jié)合形成按堿基配對原則進(jìn)行特異性結(jié)合形成雜交體，然后應(yīng)用雜交體，然后應(yīng)用組織細(xì)胞化學(xué)或免疫組組織細(xì)胞化學(xué)或免疫組織化學(xué)織化學(xué)方法在顯微鏡下進(jìn)行方法在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位或細(xì)胞內(nèi)定位或基因表達(dá)基因表達(dá)的檢測技術(shù)。的檢測技術(shù)。

28、（一）基本操作步驟：（一）基本操作步驟： 雜交前準(zhǔn)備雜交前準(zhǔn)備：保持細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、保存核酸、：保持細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、保存核酸、增加組織的通透性、減低背景。增加組織的通透性、減低背景。 雜交雜交：使探針與細(xì)胞中的把序列結(jié)合。：使探針與細(xì)胞中的把序列結(jié)合。 雜交后處理雜交后處理：鹽溶液的漂洗，以減少背景。：鹽溶液的漂洗，以減少背景。 顯示顯示：根據(jù)核酸探針標(biāo)志物的種類選擇相應(yīng)：根據(jù)核酸探針標(biāo)志物的種類選擇相應(yīng)的檢測系統(tǒng)。的檢測系統(tǒng)。 （二）原位雜交的應(yīng)用（二）原位雜交的應(yīng)用1. 細(xì)胞遺傳學(xué)分析細(xì)胞遺傳學(xué)分析產(chǎn)前診斷產(chǎn)前診斷生殖醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用生殖醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用血液疾病中染色體易位的檢測血液疾病中染色體易位的

29、檢測實(shí)體瘤研究實(shí)體瘤研究2. 比較基因組雜交比較基因組雜交3. 基因圖譜繪制基因圖譜繪制4. 病原學(xué)檢測病原學(xué)檢測熒光原位雜交熒光原位雜交(FISH, Fluorescence (FISH, Fluorescence in situ in situ Hybridization)Hybridization)利用利用熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記的探針與的探針與待測標(biāo)本的核酸進(jìn)行待測標(biāo)本的核酸進(jìn)行原原位位雜交，在熒光顯微鏡雜交，在熒光顯微鏡下對熒光信號進(jìn)行辨別下對熒光信號進(jìn)行辨別和計(jì)數(shù)，從而對染色體和計(jì)數(shù)，從而對染色體或基因異常的細(xì)胞、組或基因異常的細(xì)胞、組織標(biāo)本進(jìn)行檢測和診斷織標(biāo)本進(jìn)行檢測和診斷 核酸分子雜交

30、技術(shù)類型核酸分子雜交技術(shù)類型 雜交類型雜交類型檢測目的及范圍檢測目的及范圍SouthernSouthern印跡雜交印跡雜交檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的膜上的DNADNA分子分子NorthernNorthern印跡雜交印跡雜交檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的膜上的RNARNA分子分子反向斑點(diǎn)雜交反向斑點(diǎn)雜交檢測樣品中的檢測樣品中的DNADNA或或RNARNA分子分子原位雜交原位雜交檢測細(xì)胞或組織上的檢測細(xì)胞或組織上的DNADNA或或RNARNA分子分子 第四節(jié)第四節(jié) 影響雜交信號檢測的因素影響雜交信號檢測的因素 在核酸雜交反應(yīng)中影響雜交體形

31、成因素在核酸雜交反應(yīng)中影響雜交體形成因素較多，主要有探針的選擇、探針的標(biāo)記方法、較多，主要有探針的選擇、探針的標(biāo)記方法、探針的濃度、雜交率、雜交最適溫度、探針的濃度、雜交率、雜交最適溫度、雜交雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性的嚴(yán)謹(jǐn)性、雜交反應(yīng)時(shí)間及雜交促進(jìn)劑等。、雜交反應(yīng)時(shí)間及雜交促進(jìn)劑等。一、探針的選擇在大多數(shù)情況下，可以選擇克隆的在大多數(shù)情況下，可以選擇克隆的DNADNA或或cDNAcDNA雙鏈探針。雙鏈探針。但是在有些情況下，必須選用其它類型的但是在有些情況下，必須選用其它類型的探針如寡核苷酸探針和探針如寡核苷酸探針和RNARNA探針。探針。二、探針的標(biāo)記方法探針的標(biāo)記方法很多，選擇什么標(biāo)記方法主要視探針的

32、標(biāo)記方法很多，選擇什么標(biāo)記方法主要視個(gè)人的習(xí)慣和可利用條件而定。個(gè)人的習(xí)慣和可利用條件而定。但在選擇標(biāo)記方法時(shí)，還應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)的要求，如但在選擇標(biāo)記方法時(shí)，還應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)的要求，如靈敏度和顯示方法等。靈敏度和顯示方法等。一般認(rèn)為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高。一般認(rèn)為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高。三、探針的濃度隨探針濃度增加，雜交率也增加。隨探針濃度增加，雜交率也增加。在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。探針濃度過低會(huì)降低雜交的靈敏度，過高又會(huì)增加探針濃度過低會(huì)降低雜交的靈敏度，過高又會(huì)增加背景的染色。背景的染色。一般認(rèn)為，一般認(rèn)為，最佳原則最佳原則是應(yīng)用與靶核苷酸探針達(dá)到最是應(yīng)用與靶核苷酸探針達(dá)到最大結(jié)合度的最低探針濃度。大結(jié)合度的最低探針濃度。四、雜交率傳統(tǒng)雜交率分析主要用于傳統(tǒng)雜交率分析主要用于DNADNA復(fù)性研究，在這種復(fù)性研究，在這種情況下，探針和靶鏈在溶液中的濃度相同。情況下，探針和靶鏈在溶液中的濃度相同?，F(xiàn)代雜交實(shí)驗(yàn)無論在液相雜交還是固相雜交均在現(xiàn)代雜交實(shí)驗(yàn)無論在液相雜交還是固相雜交均在探針過剩的條件下進(jìn)行，此外，固相雜交中靶序探針過剩的條件下進(jìn)行，此外，固相雜交中靶序列不在液