基因組DNA提取方法

1、1 快速微量提取法 A.取1.5ml菌體培養(yǎng)物于一滅菌Ep管中，12000rpm離心1min, 丟去上清夜，收集菌體。 B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸鈉,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混勻,置于37oC水浴1hr。 C.然后加入200ul5mol/L的氯化鈉溶液，混勻后于13000rpm離心15min。 D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。 E.加兩倍體積無水乙醇，1/10體積醋酸鉀(3M ,pH8.0)，-20度保存1小時后，13000rpm離心15min，棄上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室溫干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4oC保存

2、備用。 2 蛋白酶/SDS法制備 先用10ml含適當抗生素的GBM過夜培養(yǎng)Delftia sp.，第二天4000rpm離心10min收集菌體，用Washing TE（50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌體2次，之后將菌體充分懸浮在5ml 1×TE緩沖液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，輕輕混勻后50放置3h5h，接著用等體積的Tris飽和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/異戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自動移液器吸管頭將絮狀DNA沉淀塊吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于適當1

3、×TE或ddH2O中。 3 1) 細菌培養(yǎng)：細菌接種于5ml液體培養(yǎng)基中，37搖床（300rpm）培養(yǎng)過液。 2) 細菌收集：取1ml培養(yǎng)物于1.5ml EP管中，室溫8000rpm離心5min，棄上清，沉淀重新懸浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。 3) 菌體裂解：加入6l 50mg/ml的溶菌酶，37作用2h。再加2mol/LNaCl50l，10%SDS 110l，20mg/ml的蛋白酶K 3l，50作用3h或37過夜。（此時菌液應為透明粘稠液體） 4) 抽提：菌液均分到兩個1.5ml EP管，加等體積的酚氯仿異戊醇(25241)，混勻，室溫放置5-10min。

4、12000rpm離心10min。抽提兩次。（上清很粘稠，吸取時應小心，最好槍頭尖應剪去） 5) 沉淀：加0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置10min。1 2000rpm離心10min。 6)洗滌：沉淀用75%的乙醇洗滌。 7) 抽（涼）干后，溶于50l ddH2O中，取2-5l電泳。作PCR模板用。細菌基因組DNA的微量提取法本方法通過SDS裂解細胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分一：儀器：同方法一二：試劑：TE、TAE緩沖液；10%SDS；NaCL；20mg/ml蛋白酶；CTAB/NaCL溶液(10% CTAB，0.7M NaCL 4.1gNaCL 溶于80ml水中，緩慢加入10gC

5、TAB，加熱溶解)；25/24/1,酚/氯仿/異戊醇; 24/1,氯仿/異戊醇；異丙醇；及100%乙醇三：操作1.5ml 對數(shù)生長期細菌細胞離心，5000rpm,1min沉淀溶于500l TE緩沖液中混勻30l 10%SDS,3L蛋白酶，混勻，37,1小時100l NaCL(5M) 混勻80l的CTAB/NaCL,*混勻；65 10min（可不做）加入等體積酚/氯仿/異戊醇混合液，混勻，離心12000rpm,4-5min取上清，以下操作與方法一中有機溶劑抽提、沉淀、干燥、除RNA 、復溶等步驟一致。注意 ，*此步操作后，離心管中NaCL的濃度不應低于0.5M，否則DNA將與CTAB共沉淀。2,

6、本法適用于從多糖含量高的樣品中提取DNA。對于菌體樣品,通過此流程,可以獲得較為完整的DNA分子。細菌總DNA的提取和鑒定【目的和要求】1. 學會CTAB法提取細菌總DNA。2. 掌握DNA的瓊脂糖凝膠電泳法。【實驗原理】DNA在生物體內(nèi)是與蛋白質(zhì)形成復合物的形式存在的，因此提取出脫氧核糖核蛋白復合物后，必須將其中蛋白質(zhì)去除。CTAB（溴代十六烷基三甲胺）是一種去污劑，它能與核酸形成復合物，在高鹽溶液中可溶并且穩(wěn)定存在，若降低鹽濃度，CTAB與核酸的復合物會沉淀出來，而大部分蛋白和多糖仍溶于溶液中。DNA的電泳原理與蛋白質(zhì)的電泳原理基本相同。DNA分子在高于其等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場

7、中向正極移動。由于DNA分子或DNA片斷的分子量差別，電泳后呈現(xiàn)遷移位置的差異。【實驗試劑和器材】（一）試劑：菌株（E.coli）；蛋白酶K（20mg/ml）；瓊脂糖；標準DNA水解液1. 10%SDS2酚/氯仿/異戊醇（1/1/1）3. 異丙醇；70%乙醇4LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g, 酵母粉5g, NaCl 10g加蒸餾水至1升，然后滅菌備用。5TE緩沖液：10mM Tris HCl, 0.1mM EDTA (pH8.0)。6 CTAB/NaCl溶液(5% w/v)：5g CTAB 溶于100ml 0.5M NaCl溶液中，需要加熱到65使之溶解，然后室溫保存。7TAE緩沖液（50×

8、;） (pH8.0)：每升溶液中含有242g Tris, 57.1ml 冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA。電泳時稀釋成1× 濃度使用。8溴酚蘭-甘油指示劑：先配制0.1%溴酚蘭水溶液，然后取1份0.1%溴酚蘭溶液與等體積的甘油混合即成90.5ug/ml 溴乙啶染液：稱取5mg溴乙啶，用重蒸水溶解定容到10ml, 取1ml此溶液用1xTAE緩沖液稀釋到1升，最終濃度為0.5ug/ml。（二）器材：錐形瓶（250ml），1.5ml 離心管，水浴鍋，離心機，電泳槽，電泳儀，搖床，移液槍，潔凈工作臺，電磁爐，紫外成像儀【實驗方法】（一）細菌總DNA的提取1. 將菌株接種于液體L

9、B培養(yǎng)基，37震蕩培養(yǎng)過夜。2. 取1.5ml培養(yǎng)物12000rpm離心2min。3. 沉淀物加入567 ul的TE緩沖液，反復吹打使之重新懸浮，加入30ul 10%SDS和15ul的蛋白酶K，混勻，于37溫育1h.4. 加入100ul 5mol/L NaCl, 充分混勻，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混勻后再65溫育10min。5. 加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，離心4-5min, 將上清轉入一只新管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，沉淀可稍加離心。6. 沉淀用1ml的70%乙醇洗滌后，離心棄乙醇，在潔凈工作臺中稍加干燥，重溶于20ul TE緩沖

10、液(含RNaseA25ng/ml)中，準備電泳檢測。（二）瓊脂糖凝膠電泳1. 制膠：稱取瓊脂糖粉末，置于三角瓶中，加入TAE緩沖液配成0.8%的濃度，加熱使瓊脂糖全部融化于緩沖液中，待溶液溫度降至65時，立即倒入制膠槽中，插入樣品梳。在室溫放置0.5-1h，待凝膠全部凝結后，輕輕拔出樣品梳。然后在電泳槽中加入電泳緩沖液直到?jīng)]過凝膠為止。2. 加樣：取0.5-1 ug 左右的樣品，體積為10-20ul，加入1/4體積的溴酚蘭-甘油指示劑，混勻后小心地加到樣品槽中。同時另取一個已知分子量的標準DNA水解液，在同一凝膠板上進行電泳。3. 電泳：維持恒壓100V，電泳0.5-1h，直到溴酚蘭指示劑移動

11、到凝膠底部，停止電泳。4. 染色：將凝膠取出后浸入0.5mg/ml 溴乙啶溶液中，染色0.5-1h。染液可反復多次使用。5. 觀察：將凝膠板置于254nm波長紫外燈下進行觀察。DNA存在的位置呈現(xiàn)橙黃色熒光。【注意事項】1. 溴乙啶有毒，配制和使用溶液時要戴手套，勿將溶液滴灑在臺面或地面上。溴乙啶溶液于室溫保存在棕色瓶中。2. 倒凝膠板時不要太厚，否則影響電泳效果。細菌基因組DNA提取方法綜述細菌基因組DNA的提取方法綜述，提供了5種方法。1 快速微量提取法A.取1.5ml菌體培養(yǎng)物于一滅菌Ep管中，12000rpm離心1min, 丟去上清夜，收集菌體。B.加入400ul裂解液（40mMTri

12、s-醋酸，20mM醋酸鈉,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混勻,置于37oC水浴1hr。C.然后加入200ul5mol/L的氯化鈉溶液，混勻后于13000rpm離心15min。D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。E.加兩倍體積無水乙醇，1/10體積醋酸鉀(3M ,pH8.0)，-20度保存1小時后，13000rpm離心15min，棄上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室溫干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4保存?zhèn)溆谩? 蛋白酶/SDS法制備先用10ml含適當抗生素的GBM過夜培養(yǎng)Delftia sp.，第二天4000rpm離心10min收集菌體，用Washing TE（50mm

13、ol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌體2次，之后將菌體充分懸浮在5ml 1×TE緩沖液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，輕輕混勻后50放置3h5h，接著用等體積的Tris飽和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/異戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自動移液器吸管頭將絮狀DNA沉淀塊吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于適當1×TE或ddH2O中。31) 細菌培養(yǎng)：細菌接種于5ml液體培養(yǎng)基中，37搖床（300rpm）培養(yǎng)過液。2) 細菌收集：取1ml培養(yǎng)物于1.5ml EP管中，室溫8

14、000rpm離心5min，棄上清，沉淀重新懸浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。3) 菌體裂解：加入6l 50mg/ml的溶菌酶，37作用2h。再加2mol/LNaCl50l，10%SDS 110l，20mg/ml的蛋白酶K 3l，50作用3h或37過夜。（此時菌液應為透明粘稠液體）4) 抽提：菌液均分到兩個1.5ml EP管，加等體積的酚氯仿異戊醇(25241)，混勻，室溫放置5-10min。12000rpm離心10min。抽提兩次。（上清很粘稠，吸取時應小心，最好槍頭尖應剪去）5) 沉淀：加0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置10min。1 2000rpm離心10min。

15、6)洗滌：沉淀用75%的乙醇洗滌。7) 抽（涼）干后，溶于50l ddH2O中，取2-5l電泳。作PCR模板用。4. DNA EXTRACTION PROCEDURE - GENERAL1) Grow cells overnight in 500 ml broth medium.2) Pellet cells by centrifugation, and resuspend in 5 ml 50 mM Tris (pH 8.0), 50 mM EDTA.3) Freeze cell suspension at -20C4) Add 0.5 ml 250 mM Tris (pH 8.0), 10

16、 mg/ml lysozyme to frozen suspension, and let thaw at room temperature. When thawed, place on ice for 45 min.5) Add 1 ml 0.5% SDS, 50 mM Tris (pH 7.5), 0.4 M EDTA, 1 mg/ml proteinase K. Place in 50C water bath for 60 min.6) Extract with 6 ml Tris-equilibrated phenol and centrifuge at 10,000X g for 1

17、5 min. Transfer top layer to new tube (avoid interface). Re-do this step if necessary.7) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting).Spool out DNA and transfer to 5 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, 200 g/ml RNase. Dissolve overnight by rocking at 4C.8) Ext

18、ract with equal volume chloroform (mix by inverting) and centrifuge at 10,000X g for 5 min. Transfer top layer to a new tube.9) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting).10) Spool out DNA and dissolve in 2 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA.11) Check purity

19、 of DNA by electrophoresis and spectrophotometric analysis.51) 100ml 細菌過夜培養(yǎng)液, 5000rpm離心10分鐘, 去上清液。2) 加9.5ml TE懸浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50l 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混勻, 37保溫1小時。3) 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混勻。4) 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混勻, 65保溫20分鐘。5) 用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm離心10分鐘, 將上清液移至干凈離心管。6) 用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干凈管中。7) 加1倍體積異丙醇, 顛倒混合, 室溫下靜止10分鐘，沉淀DNA。8) 用玻棒撈出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20保存。如DNA沉淀無法撈出,可5000rpm離心, 使DNA沉淀。9) 如要除去其中的RNA, 可以按本章第