實驗三、血液葡萄糖的測定

1、實驗七實驗七 血液葡萄糖的測定血液葡萄糖的測定（福林（福林-吳憲氏法）吳憲氏法）一、實驗一、實驗 目的目的1. 掌握無蛋白濾液的制備方法；掌握無蛋白濾液的制備方法；2. 掌握采用福林掌握采用福林-吳憲氏法測定血液中葡萄糖的吳憲氏法測定血液中葡萄糖的原理；原理；3. 進一步熟悉分光光度計的使用。進一步熟悉分光光度計的使用。吳憲的科學(xué)貢獻吳憲的科學(xué)貢獻 吳憲的博士論文為基礎(chǔ)的一系列工作，為吳憲的博士論文為基礎(chǔ)的一系列工作，為現(xiàn)代臨床血液化學(xué)分析提供了重要的分析現(xiàn)代臨床血液化學(xué)分析提供了重要的分析手段，在國際上長時間被廣泛采用。其中手段，在國際上長時間被廣泛采用。其中關(guān)于血糖測定的方法被國際上沿用長

2、達關(guān)于血糖測定的方法被國際上沿用長達70年，為此他被譽為國際血液分析的權(quán)威。年，為此他被譽為國際血液分析的權(quán)威。 在在20世紀(jì)世紀(jì)20年代以前，測驗血中的非蛋白年代以前，測驗血中的非蛋白氮組分對病人來說是個沉重的負擔(dān)，例如氮組分對病人來說是個沉重的負擔(dān)，例如僅一次尿酸測定就需耗血僅一次尿酸測定就需耗血25毫升。而福毫升。而福林林吳的新方法只需吳的新方法只需10毫升就足以進行包毫升就足以進行包括尿素、肌氨酸、肌氨酸酐、尿酸和糖的括尿素、肌氨酸、肌氨酸酐、尿酸和糖的測定（其中只需一滴血就能測定血糖）。測定（其中只需一滴血就能測定血糖）。二、實驗原理二、實驗原理磷鉬酸磷鉬酸鉬藍鉬藍 （藍色）（藍色）

3、C6H12O6 +2Cu(OH)2C5H11O5COOH +Cu 2O 3Cu 2O +3H3PO42MoO3 12H2O6CuO +3H3PO4Mo2O3 12H2ONa2CO3H2ONaOH+NaHCO3NaOH+CuSO4=Cu(OH)2+ Na2 SO4堿性銅試劑堿性銅試劑 鉬藍溶液顯藍色，其藍色的深淺與血濾液中葡鉬藍溶液顯藍色，其藍色的深淺與血濾液中葡萄糖的濃度成正比，選用顏色深淺較接近于測定管萄糖的濃度成正比，選用顏色深淺較接近于測定管的標(biāo)準(zhǔn)管一同比色，即可求出測定管中葡萄糖的含的標(biāo)準(zhǔn)管一同比色，即可求出測定管中葡萄糖的含量。量。 血糖管的使用：血糖管的使用： 血糖管下部的管徑較細

4、，以避免還原生成的氧血糖管下部的管徑較細，以避免還原生成的氧化亞銅被空氣中的氧再氧化，降低實際結(jié)果。化亞銅被空氣中的氧再氧化，降低實際結(jié)果。鎢酸法鎢酸法 原理：血液中的蛋白質(zhì)在原理：血液中的蛋白質(zhì)在pH小于其等電點時，可小于其等電點時，可用鎢酸來沉淀。鎢酸鈉與硫酸混合產(chǎn)生鎢酸和硫用鎢酸來沉淀。鎢酸鈉與硫酸混合產(chǎn)生鎢酸和硫酸鈉，游離的鎢酸被，蛋白質(zhì)吸附，形成不溶性酸鈉，游離的鎢酸被，蛋白質(zhì)吸附，形成不溶性的鎢酸蛋白而沉淀，經(jīng)過濾或離心，除去沉淀即的鎢酸蛋白而沉淀，經(jīng)過濾或離心，除去沉淀即得無蛋白的血濾液。得無蛋白的血濾液。 試劑：試劑： 10%鎢酸鈉溶液；鎢酸鈉溶液；0.333molL硫酸溶液。

5、硫酸溶液。 儀器與器材：錐形瓶、吸管、奧氏吸管、濾紙、儀器與器材：錐形瓶、吸管、奧氏吸管、濾紙、漏斗或離心管及離心機。漏斗或離心管及離心機。 方法與步驟：方法與步驟： 取取50ml錐形瓶錐形瓶1只，加入蒸餾水只，加入蒸餾水7份；用奧份；用奧氏吸管吸取抗凝血氏吸管吸取抗凝血l份，擦去管壁外血液，將吸管份，擦去管壁外血液，將吸管插人錐形瓶中水的底部，緩慢地放出血液。放完插人錐形瓶中水的底部，緩慢地放出血液。放完血液后，將吸管提高吸取上清液再吹人，反復(fù)洗血液后，將吸管提高吸取上清液再吹人，反復(fù)洗管管3次。充分混合，使紅細胞完全溶解；次。充分混合，使紅細胞完全溶解； 加入加入1/3molL硫酸溶液硫酸

6、溶液1份，隨加隨搖，充分混勻。份，隨加隨搖，充分混勻。此時血液由鮮紅變成棕色，靜置此時血液由鮮紅變成棕色，靜置510min，使，使其酸化完全；加入其酸化完全；加入10鎢酸鈉溶液鎢酸鈉溶液1份，邊加份，邊加邊搖，血液由透明變成凝塊狀。當(dāng)振搖到不再產(chǎn)邊搖，血液由透明變成凝塊狀。當(dāng)振搖到不再產(chǎn)生泡沫為止；放置數(shù)分鐘后用定量濾紙過濾或生泡沫為止；放置數(shù)分鐘后用定量濾紙過濾或離心除去沉淀，即得完全澄清的無蛋白血濾液，離心除去沉淀，即得完全澄清的無蛋白血濾液，供測定用。供測定用。 用此法制得的無蛋白血濾液為用此法制得的無蛋白血濾液為10倍稀釋的血濾液。倍稀釋的血濾液。即每毫升血濾液相當(dāng)于全血即每毫升血濾液

7、相當(dāng)于全血0.ml，適用于葡萄糖、，適用于葡萄糖、非蛋白氮、尿素氮、肌酸酐和氯化物等的測定。非蛋白氮、尿素氮、肌酸酐和氯化物等的測定。三、實驗步驟三、實驗步驟1 1、全血無蛋白濾液的制備、全血無蛋白濾液的制備抗凝血抗凝血1ml蒸餾水蒸餾水7ml混勻混勻1/3mol/L硫酸硫酸1ml振搖振搖10%10%鎢酸納鎢酸納1 1ml振搖振搖過濾過濾放置放置5 5minmin無蛋白血濾液無蛋白血濾液2 2、按表操作、按表操作混勻，置沸水浴中煮混勻，置沸水浴中煮8min。取出用流動自來水冷卻取出用流動自來水冷卻3min無蛋白血濾液無蛋白血濾液蒸餾水蒸餾水標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖應(yīng)用液標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖應(yīng)用液堿性銅試劑堿性銅試劑空

8、白管空白管標(biāo)準(zhǔn)管標(biāo)準(zhǔn)管測定管測定管1.01.02.02.01.01.01.01.0- - - -1.01.0- -2.02.02.02.02.02.0血糖管血糖管試劑試劑ml磷鉬酸試劑磷鉬酸試劑2.02.02.02.02.02.01 1：4 4磷鉬酸溶液磷鉬酸溶液加至加至混勻后放置混勻后放置2 2min12.512.512.512.512.512.53 3、比色測定、比色測定 將各管顛倒混勻后，用空白管調(diào)零，在將各管顛倒混勻后，用空白管調(diào)零，在420420nm處處測定吸收度。測定吸收度。四、操作注意四、操作注意1、等水沸騰后，才能放入血糖管。加熱要準(zhǔn)確、等水沸騰后，才能放入血糖管。加熱要準(zhǔn)確8

9、分鐘。分鐘。2、冷卻時切不可搖動血糖管，以免還原的氧化亞銅被、冷卻時切不可搖動血糖管，以免還原的氧化亞銅被空氣中的氧再氧化，降低實際結(jié)果?？諝庵械难踉傺趸?，降低實際結(jié)果。3、加入磷鉬酸后迅速比色。、加入磷鉬酸后迅速比色。4、分光光度計的使用。、分光光度計的使用。五、結(jié)果計算五、結(jié)果計算測定管吸收度測定管吸收度標(biāo)準(zhǔn)管吸收度標(biāo)準(zhǔn)管吸收度 葡萄糖葡萄糖（mg/100ml ）0.10.1 1000.10.1 六、分析討論六、分析討論=1、分光光度計的原理、分光光度計的原理 分光光度計是根據(jù)物質(zhì)對光的選擇性吸收來分光光度計是根據(jù)物質(zhì)對光的選擇性吸收來測量微量物質(zhì)濃度的儀器，具有靈敏度、準(zhǔn)測量微量物質(zhì)濃度

10、的儀器，具有靈敏度、準(zhǔn)確度高，操作方便、快速等特點。其工作原確度高，操作方便、快速等特點。其工作原理為光的吸收定律（朗伯理為光的吸收定律（朗伯比爾定律）：一比爾定律）：一束單色光束單色光(強度為強度為I0)通過某吸光物質(zhì)的溶液通過某吸光物質(zhì)的溶液時，其光能量的被吸收與該物質(zhì)濃度的關(guān)系時，其光能量的被吸收與該物質(zhì)濃度的關(guān)系符合朗伯符合朗伯比爾定律，即當(dāng)入射光波長、溫比爾定律，即當(dāng)入射光波長、溫度和溶液的厚度一定時，吸光度與溶液的濃度和溶液的厚度一定時，吸光度與溶液的濃度成正比。度成正比。 用公式表示為： T = II0 則 A = lg（1T） =Kbc 式中 T 透光率 I 透過光強度 I0

11、入射光強度 A 吸光度 K 比例常數(shù) b 溶液的厚度 c 溶液的濃度 7200分光光度計分光光度計分光光度計的組成分光光度計的組成分光光度計種類很多，一般包括光源、單色器、吸收池、檢測器和指示器分光光度計種類很多，一般包括光源、單色器、吸收池、檢測器和指示器五大部件組成。五大部件組成。1.光源：光源： 是一種可以發(fā)射出供溶液或吸收物質(zhì)選擇性吸收的光。光源光強是一種可以發(fā)射出供溶液或吸收物質(zhì)選擇性吸收的光。光源光強度應(yīng)大，有良好的穩(wěn)定性，在整個光譜區(qū)域內(nèi)光的強度不應(yīng)隨波長有度應(yīng)大，有良好的穩(wěn)定性，在整個光譜區(qū)域內(nèi)光的強度不應(yīng)隨波長有明顯的變化。明顯的變化。2.單色器：單色器： 將來自光源的光按波

12、長的長短順序分散為單色光并能隨意改變波將來自光源的光按波長的長短順序分散為單色光并能隨意改變波長的一種分光部件，包括入口狹縫、色散元件、出口狹縫和準(zhǔn)直鏡四長的一種分光部件，包括入口狹縫、色散元件、出口狹縫和準(zhǔn)直鏡四部分組成。部分組成。 3. 吸收池：吸收池： 又稱為比色皿或比色杯等。常用吸收池是用無色透明、耐腐蝕的又稱為比色皿或比色杯等。常用吸收池是用無色透明、耐腐蝕的玻璃或石英材料制成，前者用于可見光區(qū)，后者用于紫外光區(qū)，吸收玻璃或石英材料制成，前者用于可見光區(qū)，后者用于紫外光區(qū)，吸收池光程池光程0.110cm不等，其中以不等，其中以1cm為最多。為最多。 4.檢測器：檢測器： 檢測器的作用

13、是檢測通過溶液后的光強度、并把光信號轉(zhuǎn)變成電信檢測器的作用是檢測通過溶液后的光強度、并把光信號轉(zhuǎn)變成電信號。常見的檢測器有硒光電池、光電管和光電倍增管，后二者主要用號。常見的檢測器有硒光電池、光電管和光電倍增管，后二者主要用于分光光度計。于分光光度計。5.指示器：指示器： 常用儀器指示器有光點檢流計、微安表、記錄器和數(shù)字顯示器等。常用儀器指示器有光點檢流計、微安表、記錄器和數(shù)字顯示器等。光點檢流計和微安表指示器的標(biāo)尺上刻有百分透光度（光點檢流計和微安表指示器的標(biāo)尺上刻有百分透光度（T%）和吸光度）和吸光度A。7200型分光光度計使用方法型分光光度計使用方法1 1準(zhǔn)備準(zhǔn)備 在接通電源前，應(yīng)對儀器

14、的安全性進行檢查，電源在接通電源前，應(yīng)對儀器的安全性進行檢查，電源線、接線應(yīng)牢固，接地線通地要良好，各個調(diào)節(jié)旋線、接線應(yīng)牢固，接地線通地要良好，各個調(diào)節(jié)旋鈕的起始位置應(yīng)該正確。鈕的起始位置應(yīng)該正確。通電：通電：指示燈亮，指示燈亮， 儀器自檢，預(yù)熱儀器自檢，預(yù)熱20min; 用鍵設(shè)置測試方式用鍵設(shè)置測試方式:透射比透射比(T),吸光度吸光度(A),已知標(biāo)樣已知標(biāo)樣濃度方式濃度方式(C)和已知標(biāo)樣濃度斜率和已知標(biāo)樣濃度斜率(K)方式方式; 波長選擇：用波長調(diào)節(jié)旋鈕設(shè)置所需的單色光波長波長選擇：用波長調(diào)節(jié)旋鈕設(shè)置所需的單色光波長;放樣順序：打開樣品室蓋，在放樣順序：打開樣品室蓋，在14號放置比色皿槽

15、號放置比色皿槽中，依次放入中，依次放入%T校具校具(黑體黑體)，參比液，樣品液，參比液，樣品液1和和樣品液樣品液2. 容積容積光面對光面對準(zhǔn)光路準(zhǔn)光路手握手握毛面毛面 7200型分光光度計的使用方法型分光光度計的使用方法2 2校正校正 校具校具(黑體黑體)校校“0.000”：將：將%T校具校具(黑體黑體)置入光路，置入光路，在在T方式下按方式下按“%T”鍵，此時儀器自動校正后顯示鍵，此時儀器自動校正后顯示0.000 參比液校參比液校“100”%（T）或）或“0.000”（A）：將參比）：將參比液拉入光路中，按液拉入光路中，按“0A/100%T”鍵調(diào)鍵調(diào)0A/100%T，此時儀器顯示此時儀器顯示

16、“BLA”，表示儀器正在自動校正，校，表示儀器正在自動校正，校正完畢后顯示正完畢后顯示“100”%T或或“0.000”A后，表示校正后，表示校正完畢，可以進行樣品測定。完畢，可以進行樣品測定。該模式下使空白試樣該模式下使空白試樣透光率透光率100%該模式下使空白試該模式下使空白試樣吸光度為樣吸光度為0.000拉動滑竿測定拉動滑竿測定樣品的吸光度樣品的吸光度3.3.測定測定 將兩樣品液分別拉入光路中將兩樣品液分別拉入光路中,此時若在此時若在“T”方式方式下則可依次顯示樣品的透射比下則可依次顯示樣品的透射比(透光度透光度)若在若在“A”方式方式下，則顯示測得的樣品吸光度。下，則顯示測得的樣品吸光度

17、。4 4結(jié)束結(jié)束 測量完畢，關(guān)閉電源，將各調(diào)節(jié)旋鈕恢復(fù)至初始測量完畢，關(guān)閉電源，將各調(diào)節(jié)旋鈕恢復(fù)至初始位置。取出吸收池，維持其干凈，不能有液體。比位置。取出吸收池，維持其干凈，不能有液體。比色皿洗凈，晾干，存于專用盒內(nèi)。色皿洗凈，晾干，存于專用盒內(nèi)。5.5.注意事項：注意事項：使用前，使用者應(yīng)該首先了解本儀器的結(jié)構(gòu)和原理，以及各個使用前，使用者應(yīng)該首先了解本儀器的結(jié)構(gòu)和原理，以及各個旋鈕之功能。儀器接地要良好，否則顯示數(shù)字不穩(wěn)定。旋鈕之功能。儀器接地要良好，否則顯示數(shù)字不穩(wěn)定。如果大幅度改變測試波長時，在調(diào)整如果大幅度改變測試波長時，在調(diào)整“00.000.0”和和“100100”后稍后稍等片刻

18、（因光能量變化急劇，光電管受光后響應(yīng)緩慢，需一段等片刻（因光能量變化急劇，光電管受光后響應(yīng)緩慢，需一段光響應(yīng)平衡時間），當(dāng)穩(wěn)定后，重新調(diào)整光響應(yīng)平衡時間），當(dāng)穩(wěn)定后，重新調(diào)整“00.000.0”和和100100” 。儀器左側(cè)下角有一只干燥劑筒，應(yīng)保持其干燥，發(fā)現(xiàn)干燥劑變儀器左側(cè)下角有一只干燥劑筒，應(yīng)保持其干燥，發(fā)現(xiàn)干燥劑變色應(yīng)立即更新或烘干后再用。色應(yīng)立即更新或烘干后再用。 儀器停止工作時，關(guān)掉電源，電源開關(guān)需同時切斷，并罩好儀器儀器停止工作時，關(guān)掉電源，電源開關(guān)需同時切斷，并罩好儀器比色皿的清潔程度比色皿的清潔程度, ,直接影響實驗結(jié)果直接影響實驗結(jié)果. .不要用手摸比色皿的光不要用手摸比色皿的光滑的表面，更不要用毛刷刷洗比色皿，因此滑的表面，更不要用毛刷刷洗比色皿，因此, ,特別要將比色皿清特別要將比色皿清洗干凈洗干凈. .先用自來水將用過的比色皿反復(fù)沖洗先用自來水將用過的比色皿反復(fù)沖洗, ,然后用蒸餾水淋然后用蒸餾水淋洗洗, ,倒立于濾紙片上倒立于濾紙片上, ,待干后再收回比色皿盒中待干后再收回比色皿盒中. .必要