轉(zhuǎn)錄組分析(RNA-Seq)

1、轉(zhuǎn)錄組分析（RNA-Seq） 李江攀RNA-Seq 的技術(shù)背景RNA-Seq 的應(yīng)用領(lǐng)域RNA-Seq 面臨的挑戰(zhàn)及發(fā)展前景RNA-Seq 的技術(shù)背景RNA-Seq又稱轉(zhuǎn)錄組高通量測序（transcriptome sequencing）或稱為全轉(zhuǎn)錄組鳥槍法測序（Whole Transcriptom Shotgun Sequencing WTSS）原則上, 所有的高通量測序技術(shù)都能進(jìn)行RNA測序。自2005年以來, 以Roche 公司的454 技術(shù)、Illumina 公司的Solexa 技術(shù)和ABI 公司的SOLiD 技術(shù)為標(biāo)志的新一代測序技術(shù)相繼誕生, 之后HelicosBiosciences

2、 公司又推出單分子測序(Single molecule sequencing, SMS)技術(shù)。新一代測序又稱作深度測序或高通量測序, 是相對于傳統(tǒng)的Sanger 測序而言,主要特點是測序通量高, 測序時間和成本顯著下降。各平臺測序原理及序列長度的差異決定了各種高通量測序儀具有不同的應(yīng)用側(cè)重 轉(zhuǎn)錄組是特定組織或細(xì)胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA 的集合轉(zhuǎn)錄組？RNA-Seq 原理把高通量測序技術(shù)應(yīng)用到由mRNA 逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA 上, 從而獲得來自不同基因的mRNA 片段在特定樣本中的含量, 這就是mRNA 測序或 mRNA-Seq, 同樣原理, 各種類型的轉(zhuǎn)錄本都可以用深度

3、測序技術(shù)進(jìn)行高通量檢測, 統(tǒng)稱作RNA-Seq- 6 -Total RNA Rich mRNA(polyA RNA) Fragmentation (200700 bp)Oligo(dT) primed cDNA synthesisPaired-endSolexa SequencingRandom hexamer primed cDNA synthesisRNA fragment(200700 nt)Random hexamer primed cDNA synthesisProcedure of RNA-Seq1. 樣品RNA準(zhǔn)備2. 測序文庫構(gòu)建 使用oligo dT微珠純化mRNA mRNA

4、片段化處理 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成合成雙鏈cDNA 雙鏈DNA末端修復(fù)及3末端加A 使用特定的測序接頭連接DNA片段兩端 高保真聚合酶擴(kuò)增構(gòu)建成功的測序文庫3. DNA成簇（Cluster）擴(kuò)增4. 高通量測序（Illumina Genome Analyzer IIx） 5. 數(shù)據(jù)分析 原始數(shù)據(jù)讀取 與數(shù)據(jù)庫比對并進(jìn)行注釋 深層次數(shù)據(jù)分析RNA-Seq 的應(yīng)用領(lǐng)域圖所示 RNA-seq獲得的數(shù)據(jù)能夠進(jìn)行全面的數(shù)據(jù)挖掘，既能夠進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，鑒定UTR、可變剪切位點，也能夠發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本及非編碼RNA，比較樣本間的表達(dá)水平差異RNA-Seq 面臨的挑戰(zhàn)n龐大的數(shù)據(jù)量所帶來的信息學(xué)難題n如何針對更復(fù)雜的

5、轉(zhuǎn)錄組來識別和追蹤所有基因中罕見RNA 亞型的表達(dá)變化n目前的高通量測序技術(shù)大都需要較多的樣品起始量, 這使得來源極為有限的生物樣品分析受到限制, 因此如何對單細(xì)胞或少量細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序是一個亟待解決的問題RNA-seq常見問題 送樣要求：送樣要求： 濃度400ng/ul，RNA總量20ug；OD260/280為1.8-2.2，28S/18S1.8，RIN 8. 在進(jìn)行原核生物轉(zhuǎn)錄組分析時在進(jìn)行原核生物轉(zhuǎn)錄組分析時需要提供純化后的原核生物mRNA或cDNA樣品。 進(jìn)行非編碼進(jìn)行非編碼RNARNA測序時測序時需要提供去除rRNA和tRNA的RNA樣品。 測序測序1Gb1Gb的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)錄組

6、數(shù)據(jù)時通?？梢缘玫介L度大于500bp的Unigene12000個以上，但轉(zhuǎn)錄組大小受基因數(shù)目和基因豐度雙重影響，組織差異、狀態(tài)和實驗處理也會影響轉(zhuǎn)錄組組成。RNA-Seq 的的發(fā)展前景 1、雖然RNA-Seq 技術(shù)還面臨著種種困難, 但作為一個剛剛起步的新技術(shù)RNA-Seq 已經(jīng)顯示出其他轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)無可比擬的優(yōu)勢：既能提供單堿基分辨率的轉(zhuǎn)錄組注釋又能提供全基因組范圍的“數(shù)字化”的基因表達(dá)譜, 而且其成本通常比芯片和大規(guī)模的Sanger EST 測序要低, 有 2、就目前來看, 作為兩個高通量的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究技術(shù), 在應(yīng)用的某些方面既存在重疊和競爭也存在優(yōu)勢互補, 一種技術(shù)能彌補另一種技術(shù)遺漏的部分, 通常對一個生物學(xué)問題的回答需要不同實驗技術(shù)的協(xié)同配合 3、 RNA-Seq 的強項, 就在于它是一個“開放系統(tǒng)”, 它的發(fā)現(xiàn)能力和尋找新的信息的能力從本質(zhì)上高于芯片技術(shù), 相信隨著相關(guān)學(xué)科的進(jìn)一步發(fā)展和測序成本的進(jìn)一步降低, RNA-Seq 必將在轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究領(lǐng)域占主導(dǎo)地位 特特 點點數(shù)字表達(dá)