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文檔簡介

1、間接免疫熒光 武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室潘勤外周血單個(gè)核細(xì)胞分離 - 葡蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法 原理 外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMC包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞，其體積、形狀和比重與其他細(xì)胞不同。紅細(xì)胞和多核細(xì)胞比重較大，為1.092左右，而淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞比重為1.075左右。利用比重為1.077左右的分層液作密度梯度離心，使一定比重的細(xì)胞按密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。 資料資料 1 1、淋巴細(xì)胞分層液葡蔗糖、淋巴細(xì)胞分層液葡蔗糖- -泛泛影葡胺，比重為影葡胺，比重為 1.0771.0770.001g/L0.001g/L） 2 2、 2 2臺(tái)盼藍(lán)染液臺(tái)盼藍(lán)染液 3 3、 Hank

2、 Hanks s液或者液或者RPMI-1640RPMI-1640培養(yǎng)培養(yǎng)基基 4 4、試管、吸管、水平離心機(jī)等、試管、吸管、水平離心機(jī)等方法1、無菌采集靜脈血2ml注入盛有2ml Hanks液含100u/ml肝素的試管中，混勻。2、吸取淋巴細(xì)胞分層液2ml加入離心管中，再將稀釋抗凝血液小心沿管壁加至分層液上，應(yīng)注意保持兩者界面清晰。（關(guān)鍵）3、室溫2000rmin離心20min。管內(nèi)可分為四層。4、用毛細(xì)吸管輕輕吸出乳白色的單個(gè)核細(xì)胞，加入另一支已含有25 mlHanks液的離心管中，混勻。5、室溫下，1500 rpm離心10 min。6、棄上清，將PBMC用1ml PBS稀釋，混勻 間接免疫熒光間接免疫熒光檢測人外周血單個(gè)核細(xì)胞檢測人外周血單個(gè)核細(xì)胞First antibodyPBMCsecondary antibody-fluorochrome原 理材材 料料 PBMC 兔抗人白細(xì)胞血清 (Ab1) FITC-抗兔單克隆抗體 (Ab2)方方 法法吸管取1滴PBMC液體約10ul滴加到標(biāo)本片黑色圈圈背面中央, 靜止5-10分鐘，待PBMC干燥。 15 ml Ab1 加入玻片上濕盒內(nèi)孵育 30min。甩干玻片, 用洗脫液洗5次，甩干玻片玻片上加15 ml 熒光二抗 (Ab2) 濕盒內(nèi)孵育 30min。(避光操作)甩干玻片, 用洗脫液洗5次，甩

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