熒光原位雜交

1、熒光原位雜交熒光原位雜交熒光原位雜交熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)熒光原位雜交是在熒光原位雜交是在20世紀(jì)世紀(jì)80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù)發(fā)展起來的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù),以熒光標(biāo)記取代同位素以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法,探針首先與某種介導(dǎo)分子探針首先與某種介導(dǎo)分子(reporter molecule)結(jié)合結(jié)合,雜交后再通過免疫細(xì)胞化學(xué)過程連接上熒雜交后再通過免疫細(xì)胞化學(xué)過程連接上熒光染

2、料光染料.熒光原位雜交熒光原位雜交FISHFISH的原理的原理FISHFISH的操作及應(yīng)用的操作及應(yīng)用FISHFISH的展望的展望FISH的原理的原理FISH的基本原理是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，的基本原理是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。由進(jìn)行特異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。由于于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以將探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特列，因而可以將探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特

3、定的基因在染色體上定位。定的基因在染色體上定位。目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因組結(jié)構(gòu)研究、目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究等許多領(lǐng)域。診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究等許多領(lǐng)域。熒光原位雜交熒光原位雜交原有的原有的放射性同位素原位雜交技術(shù)放射性同位素原位雜交技術(shù)存在著較多缺點(diǎn)，諸如每存在著較多缺點(diǎn)，諸如每次檢驗(yàn)均次檢驗(yàn)均 需重新標(biāo)記探針，已標(biāo)記的探針表現(xiàn)出明顯的需重新標(biāo)記探針，已標(biāo)記的探針表現(xiàn)出明顯的不穩(wěn)定性，需要較和時(shí)間的曝光時(shí)間和對(duì)環(huán)境的污染等。

4、不穩(wěn)定性，需要較和時(shí)間的曝光時(shí)間和對(duì)環(huán)境的污染等。在觀察結(jié)果時(shí)，需要較多的分裂進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。此外，在觀察結(jié)果時(shí)，需要較多的分裂進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。此外，由于放射性銀粒和染色體聚集的不同平面，可能引起計(jì)數(shù)由于放射性銀粒和染色體聚集的不同平面，可能引起計(jì)數(shù)上的誤上的誤 差等。差等。 與之比與之比FISH的優(yōu)點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn) 操作操作簡(jiǎn)便操作操作簡(jiǎn)便,探針標(biāo)記后穩(wěn)定探針標(biāo)記后穩(wěn)定,一次標(biāo)記后可使用二年一次標(biāo)記后可使用二年 方法敏感方法敏感,能迅速得到結(jié)果能迅速得到結(jié)果 在同一標(biāo)本上在同一標(biāo)本上,可同時(shí)檢測(cè)幾種不同探針可同時(shí)檢測(cè)幾種不同探針. 不僅可用于分裂期細(xì)胞染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)變化的研究不僅可用于分裂期細(xì)胞染

5、色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)變化的研究,而且還可用于間期細(xì)胞的染色體數(shù)量及基因改變的研究而且還可用于間期細(xì)胞的染色體數(shù)量及基因改變的研究. 缺點(diǎn)：不能達(dá)到缺點(diǎn)：不能達(dá)到100%雜交，特別是在應(yīng)用較短的雜交，特別是在應(yīng)用較短的cDNA探針時(shí)效率明顯下降。探針時(shí)效率明顯下降。熒光原位雜交熒光原位雜交 FISH技術(shù)包括下列幾個(gè)步驟技術(shù)包括下列幾個(gè)步驟：1）探針的制備和標(biāo)記）探針的制備和標(biāo)記 2）探針及標(biāo)本變性）探針及標(biāo)本變性3）雜交）雜交4）洗脫）洗脫5）雜交信號(hào)的放大（適用于使用生物素標(biāo)記的探針）雜交信號(hào)的放大（適用于使用生物素標(biāo)記的探針）6）封片）封片7）熒光顯微鏡觀察）熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果結(jié)果熒光原位

6、雜交熒光原位雜交探針的制備和標(biāo)記探針的制備和標(biāo)記 探針是一段帶有熒光色素或（半）抗原的核苷酸序列。探針是一段帶有熒光色素或（半）抗原的核苷酸序列。其長(zhǎng)度介于其長(zhǎng)度介于15至數(shù)千個(gè)核苷酸之間，但以至數(shù)千個(gè)核苷酸之間，但以250650個(gè)核個(gè)核苷酸雜交效果最好苷酸雜交效果最好探針的熒光素標(biāo)記可以采用探針的熒光素標(biāo)記可以采用直接直接和和間接標(biāo)記間接標(biāo)記的方法。的方法。 間接標(biāo)記間接標(biāo)記是采用生物素標(biāo)記是采用生物素標(biāo)記DNA探針，雜交之后用藕聯(lián)探針，雜交之后用藕聯(lián)有熒光素親和素或者鏈霉親和素進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)還可以有熒光素親和素或者鏈霉親和素進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)還可以利用親和素利用親和素-生物素生物素-熒光素復(fù)合

7、物，將熒光信號(hào)進(jìn)行放熒光素復(fù)合物，將熒光信號(hào)進(jìn)行放大，從而可以檢測(cè)大，從而可以檢測(cè)500bp的片段。的片段。 直接標(biāo)記直接標(biāo)記是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價(jià)結(jié)合，或在缺口平移法標(biāo)記探針時(shí)將熒光素核苷三共價(jià)結(jié)合，或在缺口平移法標(biāo)記探針時(shí)將熒光素核苷三磷酸摻入。直接標(biāo)記法在檢測(cè)時(shí)步驟簡(jiǎn)單，但由于不能磷酸摻入。直接標(biāo)記法在檢測(cè)時(shí)步驟簡(jiǎn)單，但由于不能進(jìn)行信號(hào)放大，因此靈敏度不如間接標(biāo)記的方法。進(jìn)行信號(hào)放大，因此靈敏度不如間接標(biāo)記的方法。熒光原位雜交熒光原位雜交單拷貝探針：?jiǎn)慰截愄结槪海?）種類：）種類：YAC， BAC， Cosmid，Plasmi

8、d， cDNA片段片段 （2）應(yīng)用）應(yīng)用 （a）定位）定位DNA片段及嵌合體克隆驗(yàn)證；片段及嵌合體克隆驗(yàn)證； （b）確定染色體微小缺失與重復(fù)；）確定染色體微小缺失與重復(fù)； （c）染色體斷裂點(diǎn)分析。）染色體斷裂點(diǎn)分析。 （d）間期細(xì)胞染色體數(shù)目異常診斷。）間期細(xì)胞染色體數(shù)目異常診斷。熒光原位雜交熒光原位雜交單拷貝探針單拷貝探針DNA片段的染色體定位片段的染色體定位熒光原位雜交熒光原位雜交單拷貝探針單拷貝探針FISH檢測(cè)微小缺檢測(cè)微小缺失失熒光原位雜交熒光原位雜交單拷貝探針單拷貝探針FISH檢測(cè)微小缺失檢測(cè)微小缺失熒光原位雜交熒光原位雜交染色體片段重復(fù)染色體片段重復(fù) Dup 19(p13.2-13

9、.1) Dup 19(p13.2-13.1)熒光原位雜交熒光原位雜交簡(jiǎn)單重復(fù)序列探針簡(jiǎn)單重復(fù)序列探針簡(jiǎn)單重復(fù)序列探針簡(jiǎn)單重復(fù)序列探針(simple repetitive probes)異染色質(zhì)著絲粒探針異染色質(zhì)著絲粒探針(heterochromatic centromer probes)其靶序列為其靶序列為衛(wèi)星衛(wèi)星DNA或衛(wèi)星或衛(wèi)星III DNA(alpha satellite/satellite III DNA)多位于多位于染色體的著絲粒染色體的著絲粒和和異染色質(zhì)區(qū)域異染色質(zhì)區(qū)域，重復(fù)數(shù)百次至數(shù)千次。，重復(fù)數(shù)百次至數(shù)千次。特點(diǎn)：信號(hào)強(qiáng)特點(diǎn)：信號(hào)強(qiáng)應(yīng)用：應(yīng)用：(a)標(biāo)記染色體識(shí)別標(biāo)記染色體識(shí)別

10、 (b)染色體數(shù)目異常檢測(cè)染色體數(shù)目異常檢測(cè) (c)間期細(xì)胞遺傳學(xué)研究和臨床診斷間期細(xì)胞遺傳學(xué)研究和臨床診斷熒光原位雜交熒光原位雜交簡(jiǎn)單重復(fù)序列探針簡(jiǎn)單重復(fù)序列探針熒光原位雜交熒光原位雜交染色體的著絲粒染色體的著絲粒異染色質(zhì)區(qū)域異染色質(zhì)區(qū)域簡(jiǎn)單重復(fù)序列探針簡(jiǎn)單重復(fù)序列探針 間期細(xì)胞間期細(xì)胞遺傳學(xué)的意義：遺傳學(xué)的意義：細(xì)胞分裂期僅占整個(gè)細(xì)胞周期的幾分之一至幾十分之一，細(xì)胞分裂期僅占整個(gè)細(xì)胞周期的幾分之一至幾十分之一，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)和相應(yīng)處理才能獲得染色體。人體的大部分細(xì)經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)和相應(yīng)處理才能獲得染色體。人體的大部分細(xì)胞并不進(jìn)行分裂，很難通過培養(yǎng)獲得中期染色體分裂相，胞并不進(jìn)行分裂，很難通過培養(yǎng)獲得

11、中期染色體分裂相，間期間期FISH為這一時(shí)期遺期傳物質(zhì)的研究提供了可能，而為這一時(shí)期遺期傳物質(zhì)的研究提供了可能，而且快速。且快速。熒光原位雜交熒光原位雜交染色體涂染探針染色體涂染探針染色體涂染探針染色體涂染探針(chromosome painting probes) 整條染色體探針或染色體區(qū)帶特異性探針整條染色體探針或染色體區(qū)帶特異性探針探針來源：探針來源：（1）含有人單條染色體的人）含有人單條染色體的人-嚙齒類嚙齒類(human-rodent)體細(xì)胞雜種組織融合的產(chǎn)物；體細(xì)胞雜種組織融合的產(chǎn)物；（2）熒光激活的流式細(xì)胞儀）熒光激活的流式細(xì)胞儀(fluorescence-activated c

12、ell sorter,FACS)分離整條染色體分離整條染色體DNA，并以載體克隆，并以載體克隆/PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增；（3）顯微切割得到染色體或染色體片段，）顯微切割得到染色體或染色體片段，PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增；應(yīng)用（應(yīng)用（1）染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常分析；）染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常分析； （2）不同物種間的同源性比較；）不同物種間的同源性比較； （3）白血病及其它腫瘤的染色體診斷和研究。）白血病及其它腫瘤的染色體診斷和研究。熒光原位雜交熒光原位雜交染色體涂染探針染色體涂染探針人類染色體結(jié)構(gòu)分析人類染色體結(jié)構(gòu)分析熒光原位雜交熒光原位雜交染色體涂染探針：染色體涂染探針：染色體結(jié)構(gòu)異常分染色體結(jié)構(gòu)異常分析析熒光原

13、位雜交熒光原位雜交多色復(fù)合染色體多色復(fù)合染色體FISH探針探針多色多色FISH（muti-color FISH) 多色復(fù)合染色體多色復(fù)合染色體FISH探針探針(multiplex FISH, M-FISH probes) 兩種以上不同的兩種以上不同的非同位素標(biāo)記非同位素標(biāo)記，不同的熒，不同的熒光檢測(cè)系統(tǒng)，通過不同的濾光片組合或光檢測(cè)系統(tǒng)，通過不同的濾光片組合或極少數(shù)幾種非同位素標(biāo)記探針后，按照極少數(shù)幾種非同位素標(biāo)記探針后，按照不同的比例混合，可以顯示多種顏色。不同的比例混合，可以顯示多種顏色。熒光原位雜交熒光原位雜交多色復(fù)合染色體多色復(fù)合染色體FISH探針探針熒光原位雜交熒光原位雜交探針及標(biāo)本

14、的變性探針及標(biāo)本的變性1）探針變性）探針變性將探針在將探針在75oC恒溫水浴中溫育恒溫水浴中溫育5min，立即置，立即置0oC，510min，使雙鏈，使雙鏈DNA探針變性。探針變性。2）標(biāo)本變性）標(biāo)本變性將制備好的染色體玻片標(biāo)本于將制備好的染色體玻片標(biāo)本于50oC培養(yǎng)箱中烤片培養(yǎng)箱中烤片23h。（經(jīng)。（經(jīng)Giemsa染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片）。退色后再烤片）。取出玻片標(biāo)本，將其浸在取出玻片標(biāo)本，將其浸在7075oC的體積分?jǐn)?shù)的體積分?jǐn)?shù)70甲酰胺甲酰胺/2SSC的變性液中變性的變性液中變性23min。立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70

15、、體積分?jǐn)?shù)、體積分?jǐn)?shù)90和體積分?jǐn)?shù)和體積分?jǐn)?shù)100冰乙醇系列脫水，每次冰乙醇系列脫水，每次5min，然，然后空氣干燥。后空氣干燥。熒光原位雜交熒光原位雜交雜交雜交 將已變性或預(yù)退火的將已變性或預(yù)退火的DNA探針探針10L 滴于已滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上1818蓋玻蓋玻片，用片，用Parafilm封片，置于潮濕暗盒中封片，置于潮濕暗盒中37oC雜交過夜（約雜交過夜（約1517h）。）。 由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續(xù)由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續(xù)時(shí)間又長(zhǎng)，因此為了保持標(biāo)本的濕潤(rùn)狀態(tài)，時(shí)間又長(zhǎng)，因此為了保持標(biāo)本的濕潤(rùn)狀態(tài)，此過程在濕盒中進(jìn)行。此

16、過程在濕盒中進(jìn)行。熒光原位雜交熒光原位雜交洗脫洗脫此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針，從而降低本底。此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針，從而降低本底。（1） 雜交次日，將標(biāo)本從雜交次日，將標(biāo)本從37oC溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。片揭掉。（2） 將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱4250oC的體積分?jǐn)?shù)的體積分?jǐn)?shù)50甲酰胺甲酰胺/2SSC中洗滌中洗滌3次，每次次，每次5min。（3） 在已預(yù)熱在已預(yù)熱4250oC的的1SSC中洗滌中洗滌3次，每次次，每次5min。（4） 在室溫下，將玻片標(biāo)本于在室溫下，將玻片標(biāo)本于2SSC中輕洗一下。

17、中輕洗一下。（5） 取出玻片，自然干燥。取出玻片，自然干燥。（6） 取取200L復(fù)染溶液（復(fù)染溶液（PI/antifade或或DAPI/antifade染液）滴染液）滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。熒光原位雜交熒光原位雜交（1） 在玻片的雜交部位加在玻片的雜交部位加150L封閉液封閉液I，用保鮮膜覆蓋，用保鮮膜覆蓋，37oC溫育溫育20min。（2） 去掉保鮮膜，再加去掉保鮮膜，再加150L avidin-FITC于標(biāo)本上，用保鮮于標(biāo)本上，用保鮮膜覆蓋，膜覆蓋， 37oC繼續(xù)溫育繼續(xù)溫育40min。（3） 取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱4250oC的

18、洗脫液中洗滌的洗脫液中洗滌3次，次，每次每次5min。（4） 在玻片標(biāo)本的雜交部位加在玻片標(biāo)本的雜交部位加150L封閉液封閉液II，覆蓋保鮮膜，覆蓋保鮮膜，37oC溫育溫育20min。（5） 去掉保鮮膜，加去掉保鮮膜，加150L antiavidin于標(biāo)本上，覆蓋新的保于標(biāo)本上，覆蓋新的保鮮膜，鮮膜，37oC溫育溫育40min。（6） 取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱4250oC的新洗脫液中，洗的新洗脫液中，洗滌滌3次，每次次，每次5min。（7） 重復(fù)步驟重復(fù)步驟(1)、（、（2）、（）、（3），再于），再于2SSC中室溫清洗一中室溫清洗一下。下。（8） 取出玻片，自然干燥。

19、取出玻片，自然干燥。（9） 取取200L PI/antifade染液滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻染液滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。片。雜交信號(hào)的放大（適用于使用生物素標(biāo)記的探針）雜交信號(hào)的放大（適用于使用生物素標(biāo)記的探針）熒光原位雜交熒光原位雜交 可采用不同類型的封片液。如果封片液中可采用不同類型的封片液。如果封片液中不含有不含有MowiolMowiol（可使封片液產(chǎn)生自封閉作（可使封片液產(chǎn)生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的?？墒褂弥讣子蛯⑸w片周圍封閉。封好的玻片標(biāo)本可以在片標(biāo)本可以在-20-20-70-70o

20、C的冰箱中的暗盒的冰箱中的暗盒中保持?jǐn)?shù)月之久。中保持?jǐn)?shù)月之久。 封片封片熒光原位雜交熒光原位雜交 先在可見光源下找到具有細(xì)胞分裂相的視先在可見光源下找到具有細(xì)胞分裂相的視野，然后打開熒光激發(fā)光源。野，然后打開熒光激發(fā)光源。 FITCFITC的激發(fā)波長(zhǎng)為的激發(fā)波長(zhǎng)為490nm490nm。細(xì)胞被。細(xì)胞被PIPI染成染成紅色，紅色， 經(jīng)經(jīng)FITCFITC標(biāo)記的探針?biāo)诘奈恢冒l(fā)出綠色熒標(biāo)記的探針?biāo)诘奈恢冒l(fā)出綠色熒光。光。熒光顯微鏡觀察熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果結(jié)果熒光原位雜交熒光原位雜交所用不同熒光材料的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)及濾光所用不同熒光材料的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)及濾光鏡選擇鏡選擇熒光原位雜交熒光原

21、位雜交FISH技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用FISH技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用1）基因（或）基因（或DNA片段）的染色體定片段）的染色體定位；位；2）染色體數(shù)目與結(jié)構(gòu)異常的檢測(cè)；）染色體數(shù)目與結(jié)構(gòu)異常的檢測(cè)；3）間期細(xì)胞遺傳學(xué)（絨毛）間期細(xì)胞遺傳學(xué)（絨毛/羊水羊水/精精子子/卵裂球卵裂球/其它間期細(xì)胞研究與其它間期細(xì)胞研究與診斷）；診斷）；4）腫瘤遺傳學(xué)研究）腫瘤遺傳學(xué)研究熒光原位雜交熒光原位雜交FISH的展望的展望 熒光原位雜交技術(shù)已越來越廣泛的應(yīng)用在細(xì)胞遺傳學(xué)、熒光原位雜交技術(shù)已越來越廣泛的應(yīng)用在細(xì)胞遺傳學(xué)、 育種學(xué)、醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域育種學(xué)、醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域,尤其在檢測(cè)遺傳物質(zhì)的突變和染色尤其在檢測(cè)遺傳物質(zhì)的突變和染