蛋白質(zhì)層析技術

1、 蛋白質(zhì)層析技術導言 生物技術有三大部分：生化分離技術；DNA重組及基因轉(zhuǎn)移技術；免疫檢測技術。其中生化分離技術是生物技術的基礎和支柱。 層析是最有效的分離手段，也是最重要的蛋白質(zhì)純化工具。層析主要是物理方法，是混合熵減少的過程，必然消耗自由能。 基因工程下游的核心是層析。 層析技術的理論和實踐已高度發(fā)展和完善。蛋白質(zhì)結構組計劃 目標：用十年的時間獲得一萬種蛋白的三維結構。 但是只有57%被克隆的蛋白能夠成功表達。 而且在這些表達的蛋白中，只有 28% 的重組蛋白能夠被純化出來。 最終，只有2%-10%的最初的目標蛋白被成功的建立。蛋白質(zhì)層析分離純化機制電荷不同：離子交換層析大小、形狀：凝膠過

2、濾層析疏水區(qū)域：疏水層析特異性：親和層析 （選擇性是最優(yōu)秀的）層析介質(zhì)生物兼容性：親水性，大孔徑，不會使生 物大分子失活，沒有生物化學毒性過強吸附、泄露?；瘜W穩(wěn)定性：在生物大分子存在的化學條件下是穩(wěn)定的。必要的機械性能：流體中的耐壓性、彈性。化學組成：親水多孔高聚物等親水的介質(zhì)對蛋白有吸附作用，因此要在層析溶液中加一定濃度的鹽。聚合物機體孔的結構結構：典型層析介質(zhì)的放大觀察孔的結構可分為三種類型整體柱（monolithic column ） 概念：它是由單體、引發(fā)劑、致孔劑等混合物通過原位制備而成一個棒狀整體,具有制備方法簡單、內(nèi)部結構均勻、重現(xiàn)性好、具有較高的柱效和可進行快速分離等優(yōu)點,已在

3、反相色譜、離子交換色譜、疏水作用色譜、親和色譜、體積排阻色譜中獲得了應用,并成功分離了肽、蛋白質(zhì)、類固醇、芳烴、聚合物、低聚核苷酸、氨基酸等物質(zhì)。 整體柱（monolithic column ） 大孔結構平均孔徑為2m的大孔網(wǎng)絡，允許流動相快速通過，反壓極低，從而大大降低了分離時間。 中孔結構大量孔徑為13nm的“中孔”，保證了目標分子在色譜分離過程中吸附/解吸附作用所需的表面積，因此，整體化色譜柱可以在高流速時保持高柱效。整體柱（monolithic column ） 高流速整體化色譜柱的總孔率約80，填料具有優(yōu)越的滲透性，即便使用高流速進行色譜分離，柱壓也很低 ；基本不會因臟的樣品而受堵，

4、壽命長。 高柱效整體化色譜柱的柱效和3.5m粒徑的顆粒型色譜柱相當，而大大優(yōu)于5m粒徑的色譜柱。并且，整體化色譜柱在流速升高時，柱效下降程度低。整體柱（monolithic column ） 目前,商品化的聚合物整體柱有CIMTM,硅膠整體柱有SilicaRODTM和PrepRODsTM。 默克 整體柱 ChromolithTM 蛋白質(zhì)純化平臺純化平臺的硬件結構中心設備：中壓至高壓層析儀輔助設備：過濾裝置，超濾裝置，離心機，蛋白質(zhì)電泳等蛋白質(zhì)純化平臺的結構和組成含量較高的蛋白質(zhì)純化，基本可以在三個層析步驟中實現(xiàn)。用目標蛋白的三個獨立的物理化學性質(zhì)進行層析分離。幾步完成純化？綜合考慮樣品的各種性

5、質(zhì)穩(wěn)定性（PH值，活性）疏水性分子大小，形狀。關鍵輔助因子 關鍵雜質(zhì) 產(chǎn)品濃度 引進污染物 產(chǎn)品純度 單位成本 產(chǎn)量設計合理的方案 各種機制交替試用，相互銜接、補充。（3步）分辨率：疏水層析離子交換層析載量： 疏水層析離子交換層析同樣的起始樣品不同的純化方案通常純化流程：選擇性 分辨率 載量 目標蛋白為堿性蛋白，在中性附近運用陽離子交換，選擇性好，除核酸多糖； 目標蛋白為酸性蛋白，則第一步層析采用分子篩，最好此前將溶液脫鹽，并在含 .-. M NaCl的緩沖液中運行，緩沖成分視下一步而定。 如果介質(zhì)含聚丙烯酰胺，則應含Tris 等含氮的緩沖成分，減少 -互相作用造成的吸附.梯度洗脫還是分步洗脫

6、 蛋白質(zhì)層析因為保留值差別很大，比如相差1000倍，這樣能夠洗脫的唯一方法就是強度遞增的洗脫階段洗脫或連續(xù)梯度洗脫樣品通常特點及對后續(xù)純化的影響 大多數(shù)蛋白將帶負電荷，樣品會含一定量核酸； 運行層析，則蛋白濃度不應大于10 mg/ml。 (NH4)2SO4 沉淀，通常蛋白濃度1-5mg/ml. 平臺的操作（軟件：知識結構） 樣品處理及準備工作 用SDS-PAGE監(jiān)測整個流程 富含目標蛋白的提取物的獲得：應采用盡量低強度的抽提方法。 通常PBS或TBS抽提能力過強，沒有必要.低滲更有利于破碎，甚至可用水進行抽提（如1：4左右）；平臺的操作（軟件：知識結構） 無特殊理由，pH應準確控制在中性附近，

7、盡量用酸性buffer； 緩沖容量：在pKa附近 緩沖容量正比于緩沖溶液的總濃度； 最好運用(NH4)2SO4沉淀，縮小體積，便于保存。終止生化代謝反應，除糖、脂類。個別情形中會造成不可逆沉淀；平臺的操作（軟件：知識結構） 經(jīng)驗：具有3000個理論塔板的凝膠過濾可近似地將分子量相當2倍的蛋白質(zhì)完全分開；6000個理論塔板可分開相差1.5倍分子量的蛋白。 通常，要達到3000個理論塔板的分子排阻層析柱，如用50m的介質(zhì)，流速20cm/h（參照產(chǎn)品說明書）應在80cm以上至120cm，上樣5%，一般1-2%。平臺的操作（軟件：知識結構） 實驗室規(guī)模的層析應采用不大于50 m的離子交換或疏水介質(zhì)，應

8、具有10 cm左右，則不少于 600個理論塔板。 精制：高效預裝柱1 - 5 ml，10 m左右粒度，如Mono系列等。 通常條件下，采用15 m的 Resource精制也可以達到較好效果。平臺的操作（軟件：知識結構） E.Coli表達產(chǎn)物的抽提以滲透沖擊法為宜，沒有特殊原因不要使用超聲破碎法。 0C ，20%蔗糖，10mM左右緩沖液，含2.5mMEDTA，高滲后，加入低滲液，迅速充分懸浮。如果必要，應含DTT至2mM左右； 均漿液組成原則：離子強度盡量低：50mM，有時需DTT，不一定加EDTA，可考慮加PMSF，但此時不宜用Tris等胺類緩沖劑；平臺的操作（軟件：知識結構） 離子交換后，采

9、用疏水層析，可省去緩沖液交換步驟（Buffer Exchange）； 如有必要，濃縮后，Buffer Exchange，進行精制。 電導率更能反映影響離子交換的強度。 離子交換：平衡液應采用盡量低的離子強度，上樣體積不限；Donnan效應會造成1個pH單位的偏離，是蛋白質(zhì)柱上變性的重要原因；緩沖液的離子強度越低，離子交換介質(zhì)的電荷密度越大偏移越大。平臺的操作（軟件：知識結構） pH：陽離子通常低于pI 一個pH單位 陰離子通常高于pI 一個pH單位 Sticky protein：40% 在某pH附近，與陽離子和陰離子層析介質(zhì)都結合。 pH 的篩選主要是考慮分離的選擇性而非載量。 參數(shù)獲得.上樣

10、體積運行離子交換及疏水，樣品不需平衡。IgG樣品中蛋白酶的降解作用陽離子交換與DNA污染蛋白質(zhì)分子的柱上失活 分離過程可能是蛋白質(zhì)失去穩(wěn)定因子，如輔酶，金屬離子等。 吸附作用可能降低失活過程的活化能,加快蛋白的動力學過程。一般蛋白質(zhì)的變性或失活過程活化能125kj/mol,高于一般化學反應的活化能，從而對溫度的變化十分敏感。 由上，對于易在層析過程中變性或失活的蛋白質(zhì)分子，30度的溫差會造成5-200倍的活性回收差別。吸附層析造成的失活有些蛋白在柱上存留的時間長后，活性也易喪失。蛋白質(zhì)層析過程中可能的氧化損傷氧化損傷的直接后果和預防 產(chǎn)生部位：蛋白質(zhì)的金屬結合部位。 后果：造成蛋白質(zhì)結構變化，

11、失活，對蛋白酶更加敏感。 預防： 避免金屬離子與還原性保護劑同時存在。 掩蔽和消除還原型金屬離子物質(zhì)是最有效 的減輕蛋白質(zhì)氧化損傷的途徑。 （EDTA可把金屬絡合，但不能阻止金屬離子的氧化作用）蛋白質(zhì)變性因素 自然狀態(tài)下，細胞中蛋白質(zhì)濃度：200-400mg/ml 動物血液中蛋白質(zhì)濃度：50-70mg/ml 。 蛋白質(zhì)在生理條件和進化過程中從來沒有單獨的在純化中那樣的低濃度下存在過。 多亞基蛋白中，亞基-亞基解離與濃度直接相關，很多蛋白質(zhì)分子的不穩(wěn)定，就是亞基間結合力不夠強造成。 表面張力，氣泡，振蕩，剪切和稀釋都會造成蛋白質(zhì)失活。動態(tài)載量 動態(tài)載量是制備層析的重要概念，也是制備層析介質(zhì)的重要

12、性指標。層析過程是偏離平衡態(tài)的，流速越大，偏離越遠，反之亦反。層析介質(zhì)顆粒度與動態(tài)載量吸附動力學與動態(tài)載量從動態(tài)載量看上樣條件吸附蛋白的大小與動態(tài)載量吸附等溫線 概念：一定溫度下溶質(zhì)分子在兩相界面上進行的吸附過程達到平衡時它們在兩相中濃度之間的關系曲線。停留時間流速 影響介質(zhì)載量流速 影響分辨率FDA 關于蛋白質(zhì)產(chǎn)品的重要規(guī)定FDA要求: 對于用于注射用的蛋白質(zhì)產(chǎn)品，純度至少要達到99.99%,而且要保證產(chǎn)品純度和活性的重現(xiàn)性;FDA要求: 如果原材料中有不尋常的物質(zhì)(unusualmaterial ),則生產(chǎn)者必須建立相應的檢測方法來特異的檢測這個物質(zhì);FDA 關于蛋白質(zhì)產(chǎn)品的重要規(guī)定 FD

13、A認為: 電泳的單一條帶還不足以作為蛋白質(zhì)純度的證據(jù) ,要結合其他更靈敏的定量的方法,比如質(zhì)譜; FDA規(guī)定: 除了要測定蛋白質(zhì)的純度,還要考慮蛋白質(zhì)的翻譯后修飾及其生物學活性; FDA規(guī)定: 如果有蛋白質(zhì)中有必要的糖基化,那就要證明產(chǎn)品蛋白質(zhì)中確實有這個糖基化;FDA 關于蛋白質(zhì)產(chǎn)品的重要規(guī)定 FDA規(guī)定: 一個生產(chǎn)程序,每次必須產(chǎn)出相同數(shù)量和品質(zhì)的產(chǎn)品, 否則不會被認可; FDA規(guī)定: 必須進行蛋白質(zhì)產(chǎn)品的生物活性測定 ,測定方法必須證明是規(guī)范和有效的,并且要確保每次生產(chǎn)的產(chǎn)品最后的活性和效用是一致的; FDA規(guī)定: 產(chǎn)品必須有確切的可以耐受運輸時間和貨架時間;FDA 關于蛋白質(zhì)產(chǎn)品的重要規(guī)定 FDA無法認可使用含有便于純化的標簽的蛋白質(zhì)用于注射型藥物. FDA新調(diào)整 : 1996年提出, 可以對生產(chǎn)工藝做調(diào)整, 只需申請相應變動部分的許可.謝謝！聚合物機體孔的結構蛋白質(zhì)純化平臺的結構和組成含量較高的蛋白質(zhì)純化，基本可以在三個層析步驟中實現(xiàn)。用目標蛋白的三個獨立的物理化學性質(zhì)進行層析分離。梯度洗脫還是分步洗脫 蛋白質(zhì)層析因為保留值差別很大，比如相差1000倍，這樣能夠洗脫的唯一方法就是強度遞增的洗脫階段洗脫或連續(xù)梯度洗脫蛋白質(zhì)分子的柱上失活 分