蛋白質(zhì)分分離純化和表征

1、1蛋白質(zhì)的分離、純化和表征蛋白質(zhì)的分離、純化和表征第第 7 7 章章P291一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì) 蛋白質(zhì)分子中有很多酸性和堿性解離基團(tuán)，是具有兩性解離性質(zhì)的化合物。各種解離基團(tuán)的解離度與溶液的pH有關(guān)，pH越低，堿性解離度越大，蛋白質(zhì)分子帶正電荷越多，負(fù)電荷越少；pH升高，則解離情況相反。 在特定pH條件下，某種蛋白質(zhì)分子所帶正負(fù)電荷相等，靜電荷為零，這一pH 稱為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn) 有中性鹽時(shí)，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)在一定程度上決定于介質(zhì)中離有中性鹽時(shí)，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)在一定程度上決定于介質(zhì)中離子的組成。如子的組成。如Ca2+、Mg2+、Cl-、等可與蛋白質(zhì)某些可解離、等可與蛋白質(zhì)某

2、些可解離基團(tuán)結(jié)合，影響等電點(diǎn)。基團(tuán)結(jié)合，影響等電點(diǎn)。 無鹽類干擾時(shí)，蛋白質(zhì)分子本身的質(zhì)子供體基團(tuán)解離出來無鹽類干擾時(shí)，蛋白質(zhì)分子本身的質(zhì)子供體基團(tuán)解離出來的質(zhì)子數(shù)與它的質(zhì)子受體基團(tuán)結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時(shí)的溶液的質(zhì)子數(shù)與它的質(zhì)子受體基團(tuán)結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時(shí)的溶液pH稱為等離子點(diǎn)稱為等離子點(diǎn)(isoionic point,或稱等離點(diǎn)或稱等離點(diǎn))。等離子點(diǎn)是。等離子點(diǎn)是每種蛋白質(zhì)的一個(gè)特征常數(shù)。每種蛋白質(zhì)的一個(gè)特征常數(shù)。幾種蛋白質(zhì)等電點(diǎn)幾種蛋白質(zhì)等電點(diǎn)二、蛋白質(zhì)的分子大小與分子量的測二、蛋白質(zhì)的分子大小與分子量的測定定蛋白質(zhì)的分子量的范圍:61031106 Da（一）根據(jù)化學(xué)組成測定最低相對分子量 用化學(xué)

3、分析方法測出蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量。并假設(shè)蛋白質(zhì)分子中含有一個(gè)被測元素的原子，則可由此計(jì)算出蛋白質(zhì)的最低分子量。 例：肌紅蛋白和血紅蛋白含鐵量均為0.335%,計(jì)算二者的相對分子質(zhì)量。 最低相對分子量 x 100 =鐵的百分含量 鐵的原子量0.335 55.8x 100=16700測定蛋白質(zhì)相對分子量的原理和方法也可以利用蛋白質(zhì)中含量特少的也可以利用蛋白質(zhì)中含量特少的aa，用同樣的原，用同樣的原理計(jì)算蛋白質(zhì)的最低分子量。理計(jì)算蛋白質(zhì)的最低分子量。（二）滲透壓法測定相對分子（二）滲透壓法測定相對分子量量 滲透壓法測定Mr操作簡單， Mr在10-100 kDa時(shí)較準(zhǔn)，但不能區(qū)別蛋白質(zhì)分子是否均

4、一 。 滲透壓公式： Mr =RTlimc0c(c=質(zhì)量濃度，g/mol)（三）沉降分析測定（三）沉降分析測定Mr 超速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速超速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速: 6000080 000r/min, 相當(dāng)于位于相當(dāng)于位于距轉(zhuǎn)軸中心距轉(zhuǎn)軸中心10 cm處、單位質(zhì)量處、單位質(zhì)量(1g)分子所受到的離心力分子所受到的離心力(離心場強(qiáng)度離心場強(qiáng)度)為為400 000 g700 000 g. 沉降速度與蛋白質(zhì)分子大小、密度和形狀有關(guān)沉降速度與蛋白質(zhì)分子大小、密度和形狀有關(guān),且與溶劑且與溶劑密度和黏度有關(guān)密度和黏度有關(guān). 單位離心場強(qiáng)度的沉降速度稱為單位離心場強(qiáng)度的沉降速度稱為沉降系數(shù)沉降系數(shù), 用用s(小寫小寫

5、)表示表示: 蛋白質(zhì)、核酸、核糖體和病毒等的沉降系數(shù)介于11013到2001013秒之間。為了使用方便，以1013秒為一個(gè)沉降系數(shù)的單位，稱為斯維得貝格單位（Svedberg unit），或稱沉降系數(shù)單位，用S表示。如人血紅蛋白的S為4.461013秒，即4.46S。 蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)(s)與相對分子質(zhì)量(Mr)的關(guān)系可用斯維得貝格方程表達(dá):)1 (vDRTsMr摩爾氣體常數(shù)(8.314JK-1mol-1);熱力學(xué)溫度(K),舊稱絕對溫度蛋白質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)(cm2/s), 數(shù)值上等于當(dāng)濃度梯度為1個(gè)單位時(shí)在1 s內(nèi)通過1 cm2面積的蛋白質(zhì)質(zhì)量溶劑的密度(g/cm3)偏微比體積(cm3/g) 又

6、稱偏微比容,蛋白質(zhì)溶于水的偏微比容約0.74 cm3/g沉降系數(shù)（四）凝膠過濾法測定（四）凝膠過濾法測定Mr 凝膠過濾（層析）可按照蛋白質(zhì)分子量大小進(jìn)行分離的技術(shù)，同時(shí)可以測定蛋白質(zhì)分子量。 蛋白質(zhì)通過凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關(guān):先測得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的先測得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Ve Ve （VeVe為洗脫體積）為洗脫體積） ，并，并以其分子量對數(shù)對以其分子量對數(shù)對VeVe作圖得作圖得一直線，再測出待測樣品的一直線，再測出待測樣品的VeVe，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定分，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定分子量，并以其分子量對數(shù)對子量，并以其分子量對數(shù)對VeVe作圖得一直線，再測出待作圖得一直線，再測出待測樣品的

7、測樣品的VeVe，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定分子量?？纱_定分子量。LogMLogMA AB BC CLogMLogM測測V V測測（五）（五）SDS-PAGE法測定法測定Mr 聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高分辨率，用它分離、檢測蛋白質(zhì)混合樣品，主要是根據(jù)各蛋白質(zhì)各組分的電泳遷移率的不同。這種差異就蛋白質(zhì)分子本身而言，主要與其所帶凈電荷以及分子量和形狀有關(guān)。 當(dāng)電泳體系中含有一定濃度的十二烷基硫酸鈉（SDS）時(shí)，則得電泳遷移率的大小只取決于蛋白質(zhì)的分子量，從而可直接由電泳遷移率推算出蛋白質(zhì)的分子量。 SDS破壞蛋白氫鍵和疏水相互作用破壞蛋白氫鍵和疏水相互作用, 巰基乙醇能打開二硫巰基乙醇能打開

8、二硫鍵鍵, SDS和巰基乙醇存在下和巰基乙醇存在下,單體蛋白或亞基單體蛋白或亞基(寡聚蛋白質(zhì)解寡聚蛋白質(zhì)解離成亞基離成亞基) 處展開狀態(tài)處展開狀態(tài). SDS 烴鏈與蛋白質(zhì)側(cè)鏈通過疏水相互作用形成復(fù)合體烴鏈與蛋白質(zhì)側(cè)鏈通過疏水相互作用形成復(fù)合體. 在在一定條件下一定條件下, SDS與大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比與大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比: 1.4g SDS / 1 g蛋白質(zhì)蛋白質(zhì),相當(dāng)于每兩分子氨基酸殘基結(jié)合一分子相當(dāng)于每兩分子氨基酸殘基結(jié)合一分子SDS. SDS 與蛋白質(zhì)結(jié)合后與蛋白質(zhì)結(jié)合后: 第一第一, SDS 陰離子使多肽鏈覆蓋上陰離子使多肽鏈覆蓋上相同密度的負(fù)電荷相同密度的負(fù)電荷, 遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)原有

9、電荷量遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)原有電荷量, 掩蓋了不同掩蓋了不同蛋白質(zhì)間原有的電荷差別蛋白質(zhì)間原有的電荷差別; 第二第二, 改變蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象改變蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象, 使大多數(shù)蛋白質(zhì)采取類似的形狀使大多數(shù)蛋白質(zhì)采取類似的形狀. 因此在因此在 SDS 存在下的電存在下的電泳幾乎是完全基于相對分子質(zhì)量分離蛋白質(zhì)的泳幾乎是完全基于相對分子質(zhì)量分離蛋白質(zhì)的.聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ SDS-PAGE）SDS-PAGE，遷移率不受蛋白質(zhì)原有的電荷、分子形狀等因素影響, 但凝膠具分子篩效應(yīng). 因此，遷移率與相對分子質(zhì)量(Mr)之關(guān)系:rrbaMlg常數(shù)常數(shù)相對遷移率：相對遷移率：樣品遷移距離樣品遷移距

10、離/ /前沿前沿( (染料染料) )蛋白質(zhì)親水膠體的穩(wěn)定性主要取決于兩個(gè)因素： 雙電層 水化層三、膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀1蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性 蛋白質(zhì)顆粒大小屬于膠體粒子的范圍(1-100nm)。又由于其分子表面有許多極性基團(tuán)，親水性極強(qiáng)，易溶于水成為穩(wěn)定的親水膠體溶液。 蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性是有條件的，相對的。假若改變環(huán)境條件，破壞其水化膜和雙電層，蛋白質(zhì)親水膠體便失去穩(wěn)定性，發(fā)生絮結(jié)沉淀現(xiàn)象，這既是所謂的蛋白質(zhì)沉淀作用。 鹽析法（salting out） ： 中性鹽（NH4SO4，NaSO4，NaCl等） 蛋白質(zhì)脫去水化層。 優(yōu)點(diǎn)：不引起蛋白質(zhì)變性。 鹽溶（sal

11、ting in）：稀鹽溶液中蛋白質(zhì)溶解度增 加的現(xiàn)象。2蛋白質(zhì)的沉淀 有機(jī)溶劑沉淀法： 極性有機(jī)溶劑（甲醇，乙醇，丙酮）脫去水化層以及降低介電常數(shù) 而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用。 條件：低溫操作，縮短時(shí)間。 重金屬鹽沉淀法:當(dāng)溶液pHpI,蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷,易與重金屬離子 (Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等) 生成沉淀。 生物堿試劑和某些酸類沉淀法:生物堿試劑能引起生物堿沉淀的一類試劑。 當(dāng)溶液pHpI時(shí),蛋白質(zhì)顆粒帶正電荷 易與生物堿試劑,酸根負(fù)離子反應(yīng)沉淀 用途：臨床除去體液中干擾測定的蛋白質(zhì)加熱變性沉淀法 原因：加熱變性使蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，損壞了水化層 用途：制豆腐（

12、加熱+少量鹽鹵）四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則前處理：細(xì)胞破碎前處理：細(xì)胞破碎粗分級(jí)分離：鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等粗分級(jí)分離：鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等細(xì)分級(jí)分離：層析、電泳、結(jié)晶細(xì)分級(jí)分離：層析、電泳、結(jié)晶 蛋白質(zhì)純化測總目標(biāo)：增加蛋白質(zhì)純化測總目標(biāo)：增加純度或比活力純度或比活力 動(dòng)物材料剔除結(jié)締組織、脂肪組織動(dòng)物材料剔除結(jié)締組織、脂肪組織; ; 種子材料應(yīng)先去殼種子材料應(yīng)先去殼和種皮以免受單寧等物質(zhì)的污染和種皮以免受單寧等物質(zhì)的污染, , 油料種子脫脂油料種子脫脂. . 選擇適當(dāng)方法選擇適當(dāng)方法, ,破碎組織或細(xì)胞：動(dòng)物組織破碎組織或細(xì)胞：動(dòng)物組織(

13、 (電動(dòng)搗碎機(jī)電動(dòng)搗碎機(jī)或勻漿器或超聲或勻漿器或超聲);); 植物組織植物組織( (英砂或玻璃粉和適當(dāng)?shù)木彌_液研磨或用英砂或玻璃粉和適當(dāng)?shù)木彌_液研磨或用纖維素纖維素酶酶); ); 細(xì)菌細(xì)胞細(xì)菌細(xì)胞( (超聲超聲, ,與砂研磨或與砂研磨或溶菌酶溶菌酶).). 選擇適當(dāng)?shù)木彌_液把所要的蛋白質(zhì)提取出來選擇適當(dāng)?shù)木彌_液把所要的蛋白質(zhì)提取出來. . 如果蛋白質(zhì)是與細(xì)胞膜或膜質(zhì)細(xì)胞器結(jié)合的如果蛋白質(zhì)是與細(xì)胞膜或膜質(zhì)細(xì)胞器結(jié)合的, , 用超聲波用超聲波或去污劑使膜結(jié)構(gòu)解聚或去污劑使膜結(jié)構(gòu)解聚, , 用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提取。用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提取。前處理: :五、蛋白質(zhì)分離純化的一般方法五、蛋白質(zhì)分離純化的一般方法 根據(jù)

14、分子量：如沉降速度法離心 根據(jù)密度：沉降平衡法離心 根據(jù)電荷和分子量：聚丙烯酰胺凝膠電泳 根據(jù)分子量和分子形狀：凝膠過濾 根據(jù)溶解度：硫酸銨分級(jí)沉淀、有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀 根據(jù)電荷：等電點(diǎn)沉淀 透析：利用半透膜的選擇通透性來純化象蛋白質(zhì)這樣的大分子物質(zhì)的過程叫透析。 超過濾：是利用壓力或離心力，強(qiáng)行使水和其他小分子而蛋白質(zhì)分子被截留在膜上，以達(dá)到濃縮和脫鹽的目的，有時(shí)要用切向流過濾法。（一）根據(jù)分子大小不同的分離純化方法磁力攪拌器磁力攪拌器透析液透析液裝有蛋白溶液的透析袋裝有蛋白溶液的透析袋攪拌子攪拌子 透析透析 超濾超濾 離心技術(shù)主要用于各種生物樣品的分離和制備，生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于

15、巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細(xì)胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離，而沉降速度取決于顆粒的質(zhì)量、大小和密度。 密度梯度離心技術(shù)是利用每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的密度梯度時(shí)即停止不前，最后各種蛋白質(zhì)在離心管中被分離成各自的區(qū)帶。 常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度等。密度梯度（區(qū)帶）離心常用于生成密度梯度常用于生成密度梯度的介質(zhì)是蔗糖、聚蔗的介質(zhì)是蔗糖、聚蔗糖（糖（Ficoll），分離核），分離核酸時(shí)還常用酸時(shí)還常用CsCl作為作為介質(zhì)。介質(zhì)。凝膠過濾法 常用凝膠：交聯(lián)葡聚糖、常用凝膠：交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺凝膠，瓊脂糖聚丙烯酰胺凝膠，瓊脂糖（seph

16、arose 或或 Bio-Gel A）；）； 凝膠網(wǎng)孔大小一定，只允許相應(yīng)大小的分子進(jìn)入凝凝膠網(wǎng)孔大小一定，只允許相應(yīng)大小的分子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，大分子則被排阻在外，即分膠顆粒內(nèi)部，大分子則被排阻在外，即分級(jí)分離范級(jí)分離范圍或排阻極限圍或排阻極限; 大分子從顆粒間隙流下來，洗脫液體積小。小分子大分子從顆粒間隙流下來，洗脫液體積小。小分子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)洗脫歷程長，后洗脫下來，洗脫體在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)洗脫歷程長，后洗脫下來，洗脫體積大；積大； 用洗脫體積同標(biāo)準(zhǔn)分子量的蛋白質(zhì)的比例關(guān)系測定用洗脫體積同標(biāo)準(zhǔn)分子量的蛋白質(zhì)的比例關(guān)系測定蛋白質(zhì)分子量；蛋白質(zhì)分子量；（二）利用溶解度差別的純化方法（二）利用溶解

17、度差別的純化方法影響蛋白質(zhì)溶解度的外部因素很多，其中主要有：溶液的pH、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度。溶解度歸根結(jié)底取決于他們本身的分子結(jié)構(gòu)。1. 通過改變?nèi)芤簆H值的等電點(diǎn)沉淀法2. 通過改變?nèi)芤弘x子強(qiáng)度的鹽析、鹽溶3. 有機(jī)溶劑的分級(jí)沉淀4. 通過改變溫度的沉淀法在等電點(diǎn)pH條件下，蛋白質(zhì)為電中性，其物理性質(zhì)如導(dǎo)電性、溶解度、黏度、滲透壓等都表現(xiàn)為最低值，易發(fā)生絮結(jié)沉淀。因此，等電點(diǎn)性質(zhì)常被用于蛋白質(zhì)的分離制備，被稱為等電點(diǎn)沉淀技術(shù)。等電點(diǎn)沉淀鹽溶與鹽析 鹽溶：一般在低鹽濃度的情況下，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽鹽溶：一般在低鹽濃度的情況下，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這種現(xiàn)象稱為濃度的升高而增

18、加，這種現(xiàn)象稱為鹽溶鹽溶； 鹽析鹽析: :當(dāng)鹽濃度升高到一定程度后，蛋白質(zhì)的溶解度又隨當(dāng)鹽濃度升高到一定程度后，蛋白質(zhì)的溶解度又隨著鹽濃度的升高而降低，結(jié)果使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種著鹽濃度的升高而降低，結(jié)果使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為現(xiàn)象稱為鹽析鹽析; ; 同一濃度鹽溶液中，不同蛋白質(zhì)的溶解度不同，借此可同一濃度鹽溶液中，不同蛋白質(zhì)的溶解度不同，借此可達(dá)到彼此分離的目的。達(dá)到彼此分離的目的。 鹽溶原理鹽溶原理: :蛋白質(zhì)吸附某種鹽離子后彼此排斥。蛋白質(zhì)吸附某種鹽離子后彼此排斥。 鹽析原理：鹽濃度增高到一定數(shù)值后，水活性降低，水鹽析原理：鹽濃度增高到一定數(shù)值后，水活性降低，水化膜相繼被破壞，最終

19、引起蛋白質(zhì)分子間相互聚積并從化膜相繼被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子間相互聚積并從溶液中析出溶液中析出 溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響 0-40之間，大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度的升高而增加。有機(jī)溶劑分級(jí)分離法 降低水溶液的介電常數(shù)，破壞大分子周圍水膜，使溶質(zhì)降低水溶液的介電常數(shù)，破壞大分子周圍水膜，使溶質(zhì)溶解度降低溶解度降低; 利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機(jī)溶劑中的溶解度不同利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機(jī)溶劑中的溶解度不同而使蛋白質(zhì)分離的方法，有機(jī)溶劑沉淀法。經(jīng)常使用的而使蛋白質(zhì)分離的方法，有機(jī)溶劑沉淀法。經(jīng)常使用的有機(jī)溶劑是乙醇和丙酮；有機(jī)溶劑是乙醇和丙酮； 易使蛋白質(zhì)和酶變性，操作必須在易使蛋白質(zhì)

20、和酶變性，操作必須在低溫低溫條件下進(jìn)行。條件下進(jìn)行。電泳 :在外電場的作用下，帶電顆粒向著與其電性相反的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。原則上按電泳的原理來分，可分為：（三）根據(jù)電荷不同的純化方法 自由界面電泳 區(qū)帶電泳 濾紙電泳和薄膜電泳（醋酸纖維素薄膜、聚酰胺薄膜） 粉末電泳（淀粉、纖維素粉、硅膠粉，粉末與適當(dāng)溶劑調(diào)和，鋪板） 細(xì)絲電泳，如尼龍絲和其它人造絲電泳，這是一類微量電泳 凝膠電泳，最常用的支持介質(zhì)是聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)濃縮膠樣品 分離膠 在PAGE中，除了一般的電荷效應(yīng)外，還有凝膠對樣品的分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)， 三種效應(yīng)共同起作用， 使樣品的分離

21、效果大大提高。Tris-Gly pH=8.3Tris-Gly pH=8.3Tris-HCl pH=6.8T=3%Tris-HCl pH=8.9T=7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ SDS-PAGE）0.5 1.0kD33022067603618.5kD9467433020.114.4Mol masskD30020010080605040302010Migration (Rf)Pharmacia: Molecular Markers for electrophoresisA stable pH gradient is established in the gel after applica

22、tion of an electric field.Protein solution is added and electric field is reapplied.After staining, proteins are shown to be distributed along pH gradient according to their pI values.等電聚焦 (IEF)pH梯度制作：利用兩性電解質(zhì)梯度制作：利用兩性電解質(zhì)(商品名商品名: Ampholine)，多氨基多羧，多氨基多羧酸系列兩性化合物同系物的復(fù)雜混合物，它們有相近但不同的酸系列兩性化合物同系物的復(fù)雜混合物，它們有相

23、近但不同的pH和和pI值，在電場作用下，自然形成值，在電場作用下，自然形成pH梯度梯度.電泳就是在凝膠中加入兩性電解質(zhì)從而構(gòu)成從正極到負(fù)極pH逐漸增加的pH梯度，處在其中的蛋白分子在電場的作用下運(yùn)動(dòng)，最后各自停留在其等電點(diǎn)的位置上，測出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等電點(diǎn)。First dimensionI s o e l e c t r i c focusingIsoelectric focusing gel is placed on SDSpolyacrylamide gel.Second dimensionSDS-polyacrylamidegel electrophoresis

24、雙向電泳 (Two-dimensional electrophoresis) 此法是利用離子交換樹脂作為柱層析支持物，將帶有不同電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的方法。 若選擇陽離子交換樹脂，則帶正電荷的物質(zhì)與H+發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。 若選擇陰離子交換樹脂，則帶負(fù)電荷的物質(zhì)可與OH-發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。 物質(zhì)在樹脂上結(jié)合的牢固程度即親和力大小有差異，因此選用適當(dāng)?shù)南疵撘罕憧蓪⒒旌衔镏械慕M分逐個(gè)洗脫下來，達(dá)到分離純化的目的。離子交換層析陽離子交換劑：陽離子交換劑： CM-纖維素：纖維素：-O-CH2COOH P-纖維素：磷酸基纖維素：磷酸基陰離子交換劑：陰離子交換劑： DEAE-纖維素：二乙基氨基乙

25、基纖維素：二乙基氨基乙基 AE-纖維素：氨基乙基纖維素：氨基乙基親和層析利用化學(xué)方法將可與待分離物質(zhì)可逆性特異結(jié)合的化合物（稱配體）連接到某種固相載體上，并將載有配體的固相載體裝柱，當(dāng)待提純的生物大分子通過此層析柱時(shí)，此生物大分子便與載體上的配體特異的結(jié)合而留在柱上，其他物質(zhì)則被沖洗出去。然后再用適當(dāng)方法使這種生物大分子從配體上分離并洗脫下來，從而達(dá)到分離提純的目的 。 抗原和抗體 激素和受體蛋白 凝集素和糖蛋白配體配體蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)和配蛋白質(zhì)和配體復(fù)合物體復(fù)合物交聯(lián)試劑交聯(lián)試劑載體載體配體配體載體與配體載體與配體交聯(lián)體交聯(lián)體雜質(zhì)雜質(zhì)雜質(zhì)雜質(zhì)游離配體游離配體六、蛋白質(zhì)的含量測定與純度 測定

26、蛋白質(zhì)的量是研究蛋白質(zhì)的最基本的一步。 溶液中蛋白質(zhì)的濃度測定方法很多，最早的經(jīng)典方法是凱氏定氮法，稍后應(yīng)用較廣泛的方法是雙縮脲法、福林酚法和紫外吸收法，近年來大多數(shù)人用考馬斯亮藍(lán)法。（一）蛋白質(zhì)的含量測定1. 雙縮脲法 雙縮脲法是基于蛋白質(zhì)分子中的肽鍵，凡具兩個(gè)以上肽鍵的物質(zhì)均會(huì)發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。 在堿性溶液中蛋白質(zhì)可以與Gu2形成紫紅色絡(luò)合物，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量和氨基酸組成無關(guān)。2. 福林酚法 福林酚法主要基于蛋白質(zhì)在堿性溶液中能與銅形成復(fù)合物，此復(fù)合物以及芳香族氛基酸殘基可以還原酚試劑而產(chǎn)生藍(lán)色，再與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(通常采用牛血清白蛋內(nèi))比色定量。 福林酚試劑法靈敏度高，但是如果樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的芳香族氨基酸差異較大時(shí)，會(huì)有較大的系統(tǒng)誤差。3. 紫外吸收法 蛋白質(zhì)組成中常含有酪氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波長處有最大吸收峰，故可用280nm波長的光吸收即光密度的大小來測定一般蛋白質(zhì)的含量。4.考馬氏亮藍(lán)法 考馬斯亮藍(lán)G-250是一種染料，在游離狀態(tài)下呈紅色，與蛋白質(zhì)結(jié)合則呈現(xiàn)藍(lán)色。在一定范圍內(nèi)，溶液在595nm波長下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，可用比色法測定。 本法試劑配制簡單，操作簡便，是一種常見的蛋白質(zhì)快速微量測定方法。（二）蛋白質(zhì)純度鑒定（二）蛋白質(zhì)純度鑒定 常用電泳法(IEE、PAGE和SDS-PAGE)、HPLC法、免疫學(xué)方