第二十章 常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用

1、生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 常用分子生物學(xué)技術(shù)的常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用原理及應(yīng)用The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology第20章生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 本章內(nèi)容本章內(nèi)容 分子雜交與印跡技術(shù)分子雜交與印跡技術(shù) PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用技術(shù)的原理與應(yīng)用 基因文庫基因文庫 生物芯片技術(shù)生物芯片技術(shù) 生物大分子相互研究技術(shù)生物大分子相互研究技術(shù)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 第一節(jié)第一節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)分子雜交與印跡技術(shù)Molecular Hybridization and Blot

2、ting Technique生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 n核酸分子雜交核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization) 在在DNA復(fù)性過程中，如果把不同復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈單鏈分子放在同一溶液中，或把分子放在同一溶液中，或把DNA與與RNA放在一放在一起，只要在起，只要在DNA或或RNA的單鏈分子之間有一定的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈成雜化雙鏈(heteroduplex) 。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 復(fù)性復(fù)性RNADNA圖

3、圖20-1核酸的分子雜交核酸的分子雜交生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 （一）印跡技術(shù)（一）印跡技術(shù)“blotting”，物理方法使電泳膠中的生物大分，物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜子轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜( (NC)等各種膜上，成為固相等各種膜上，成為固相化分子的技術(shù)。類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡化分子的技術(shù)。類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針探針”，探針可以與固定在，探針可以與固定在NC膜上的核苷膜上

4、的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。 （二）探針技術(shù)（二）探針技術(shù)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）（一）DNA印跡印跡 (Southern Blotting)（二）（二）RNA印跡印跡 (Northern Blotting)（三）蛋白質(zhì)的印跡（三）蛋白質(zhì)的印跡(Western Blotting)用于基因組用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。 用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。生物化學(xué)與分子

5、生物學(xué)教研室 ( (四四) )其他其他斑點(diǎn)印跡斑點(diǎn)印跡 (dot blotting) 原位雜交原位雜交 (in situ hybridization)DNA點(diǎn)陣點(diǎn)陣 (DNA array) DNA芯片技術(shù)芯片技術(shù) (DNA chip)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 圖圖20-2 三種印跡技術(shù)的比較三種印跡技術(shù)的比較生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 圖圖20-3 分子雜交實驗分子雜交實驗生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 圖圖204放射自顯影照片放射自顯影照片生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 第二節(jié)第二節(jié)PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用技術(shù)的原理與應(yīng)用Principle and Application of Polymerase

6、 Chain Reaction 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 一、一、PCR技術(shù)的工作原理技術(shù)的工作原理5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環(huán)后，模板次循環(huán)后，模板DNA的含量的含量可以擴(kuò)大可以擴(kuò)大100萬倍以上。萬倍以上。生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 模板模板DNA dNTPs 特異性引物特異性引物 耐熱耐熱DNA聚合酶聚合酶 Mg2+PCRPCR體系基本組成成分體系

7、基本組成成分生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 變性變性95C95C延伸延伸72C退火退火Tm-5CPCRPCR體系基本反應(yīng)步驟體系基本反應(yīng)步驟生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 二、二、PCR技術(shù)的主要用途技術(shù)的主要用途（一）目的基因的克?。ㄒ唬┠康幕虻目寺。ǘ┗蛲蛔儯ǘ┗蛲蛔儯ㄈㄈ〥NA和和RNA的微量分析的微量分析（四）（四）DNA序列測定序列測定（五）基因突變分析（五）基因突變分析生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 RT-PCR是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對已知序列的已知序列的RNA進(jìn)行定性及半定量分析的最有效方法。進(jìn)行

8、定性及半定量分析的最有效方法。 （一）逆轉(zhuǎn)錄（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)技術(shù)三、幾種重要的三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)衍生技術(shù)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 （二）原位（二）原位PCR技術(shù)技術(shù)原位原位PCR(in situ PCR) 結(jié)合結(jié)合PCR技術(shù)和原位雜交技技術(shù)和原位雜交技術(shù)，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的一種最佳術(shù)，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。方法。生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 （三）實時（三）實時PCR技術(shù)技術(shù)實時實時PCR(real-time PCR)技術(shù)通過動態(tài)監(jiān)測技術(shù)通過動態(tài)監(jiān)測反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對定量分反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對定量分析的干擾

9、，亦被稱為定量析的干擾，亦被稱為定量PCR。 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 n實時實時PCR分類：分類：實時實時PCR非探針類非探針類 SYBR Green熒光染料熒光染料 探針類探針類1. TaqMan探針法探針法 2. 分子信標(biāo)探針法分子信標(biāo)探針法 3. FRET探針法探針法 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 圖圖20-5 基于基于SYBR Green染料法實時染料法實時PCR技術(shù)技術(shù)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 圖圖20-6 TaqMan探針法實時探針法實時PCR原理示意圖原理示意圖生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 第三節(jié)第三節(jié)基因文庫基因文庫Gene Library生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 基因組基

10、因組DNA文庫文庫 (genomic DNA library) cDNA文庫文庫(cDNA library) n基因文庫基因文庫( (gene library)是指一個包含了某一生物體全部是指一個包含了某一生物體全部DNADNA序列序列的克隆群體。的克隆群體。生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 一、基因組一、基因組DNA文庫文庫基因組基因組DNADNA文庫：生物的基因組文庫：生物的基因組DNA的信的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片片段形式貯存的克隆群體。段形式貯存的克隆群體。 載體載體: : 噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。

11、生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 cDNA文庫文庫是包含某一組織細(xì)胞在一定條件是包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部下所表達(dá)的全部mRNAmRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列序列的克隆群體，它以的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著片段的形式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。 二、二、cDNAcDNA文庫文庫生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 圖圖21-7 21-7 基因組文庫和基因組文庫和cDNA文庫的構(gòu)建和篩選文庫的構(gòu)建和篩選生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 第四節(jié)第四節(jié)生物芯片技術(shù)生物芯片技術(shù)Biological Chip Technique生物化學(xué)與分子生物學(xué)

12、教研室 也被稱作也被稱作DNA微陣列微陣列(DNA microarray)。 將大量（通常每平方厘米點(diǎn)陣密度高于將大量（通常每平方厘米點(diǎn)陣密度高于 400 )探針分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)探針分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強(qiáng)度行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。 一、基因芯片一、基因芯片n基因芯片基因芯片(gene chip)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 圖圖20-9 20-9 基因芯片工作流程示意圖基因芯片工作流程示意圖生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 圖圖20-10D

13、NA芯片結(jié)果芯片結(jié)果生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反應(yīng)時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)應(yīng)時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。對靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)n蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片(protein chip)n蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片作用原理作用原理生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 第五節(jié)第五節(jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)生物大分子相互作用

14、研究技術(shù) The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù) 酵母雙雜交酵母雙雜交 各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等） 熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析 噬菌體顯示系統(tǒng)篩選噬菌體顯示系統(tǒng)篩選n常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 （一）標(biāo)簽蛋白沉淀（一）標(biāo)簽蛋白沉淀應(yīng)用：應(yīng)用：證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合證明兩種蛋白分子是

15、否存在直接物理結(jié)合分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 圖圖21-11標(biāo)簽融合蛋標(biāo)簽融合蛋白沉淀實驗白沉淀實驗流程示意圖流程示意圖生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 （二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途（二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途圖圖21-12酵母雙雜交技術(shù)酵母雙雜交技術(shù)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 n酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用 證明生物信息學(xué)推測的蛋白質(zhì)相互作用。證明生物信息學(xué)推測的蛋白質(zhì)相互作用。 分析蛋白質(zhì)分子的相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵分析蛋白質(zhì)分子

16、的相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基。的氨基酸殘基。 篩選未知的相互作用蛋白質(zhì)。篩選未知的相互作用蛋白質(zhì)。生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 二、二、DNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)（一）電泳遷移率變動測定（一）電泳遷移率變動測定 電泳遷移率變動測定電泳遷移率變動測定(EMSA) 凝膠遷移變動實驗?zāi)z遷移變動實驗(gel shift assay)最初用于研究最初用于研究DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白與相應(yīng)與相應(yīng)DNA序列序列間的相互作用，間的相互作用，轉(zhuǎn)錄因子研究轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。的經(jīng)典方法。研究研究RNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白和特定和特定RNA序列序列間的相互間的相互作用。作用。生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 放放射射自自顯顯影影未結(jié)合探針未結(jié)合探針結(jié)合有蛋白的探針結(jié)合有蛋白的探針標(biāo)記探針標(biāo)記探針1X1X1X1X核蛋白提取