基因工程菌生長代謝的特點(diǎn)

1、第五節(jié)第五節(jié) 基因工程菌生長代謝的特點(diǎn)基因工程菌生長代謝的特點(diǎn) 菌體的生長通常用比生長速率來表示。菌體的生長通常用比生長速率來表示。 工程菌培養(yǎng)可通過選用不同的碳源控工程菌培養(yǎng)可通過選用不同的碳源控制補(bǔ)料和稀釋速率等方法來控制菌體的生制補(bǔ)料和稀釋速率等方法來控制菌體的生長。長。 控制菌體的生長對提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性、控制菌體的生長對提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性、減少代謝副產(chǎn)物積累、提高外源蛋白產(chǎn)率減少代謝副產(chǎn)物積累、提高外源蛋白產(chǎn)率有重要意義。有重要意義。一、菌體的生長與能量的關(guān)系一、菌體的生長與能量的關(guān)系 碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的主要成分。碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的主要成分。 碳源物質(zhì)為細(xì)胞提供能量，當(dāng)菌體生長碳

2、源物質(zhì)為細(xì)胞提供能量，當(dāng)菌體生長所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時(shí)，所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時(shí)，菌體會(huì)產(chǎn)生乙酸，導(dǎo)致培養(yǎng)基的菌體會(huì)產(chǎn)生乙酸，導(dǎo)致培養(yǎng)基的pHpH值下降，值下降，從而影響菌體的生長。適當(dāng)提高從而影響菌體的生長。適當(dāng)提高pHpH，可減少，可減少乙酸的抑制作用乙酸的抑制作用 分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源，連續(xù)分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源，連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率等都能一定范圍內(nèi)控培養(yǎng)中控制稀釋速率等都能一定范圍內(nèi)控制菌體的生長，從而控制乙酸的產(chǎn)生，減制菌體的生長，從而控制乙酸的產(chǎn)生，減少它的抑制作用。少它的抑制作用。 加入蛋氨酸和酵母提取物都能減少加入蛋氨酸和酵母提取物都能減少乙酸

3、的產(chǎn)生。乙酸的產(chǎn)生。 大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的VHBVHB蛋白的基因可提高菌體生長速率。蛋白的基因可提高菌體生長速率。 采用磷酸乙?；溉毕葜曜鳛樗藿M采用磷酸乙酰化酶缺陷株作為宿組主細(xì)胞，阻止乙酸產(chǎn)生，可提高產(chǎn)量。主細(xì)胞，阻止乙酸產(chǎn)生，可提高產(chǎn)量。二、菌體生長與前體供應(yīng)的關(guān)系二、菌體生長與前體供應(yīng)的關(guān)系 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸（小分在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸（小分子前體）能使菌體比生長率提高，蛋白子前體）能使菌體比生長率提高，蛋白合成增加。合成增加。 基因工程菌質(zhì)粒的表達(dá)需與宿主細(xì)基因工程菌質(zhì)粒的表達(dá)需與宿主細(xì)胞競爭共同的前體和催化結(jié)構(gòu)，致工程胞競爭共同的前體和催化

4、結(jié)構(gòu)，致工程菌生長速率降低。菌生長速率降低。 質(zhì)粒存在對菌體代謝的影響：中等質(zhì)粒存在對菌體代謝的影響：中等拷貝質(zhì)粒（拷貝質(zhì)粒（5656拷貝）的工程菌中與前體合拷貝）的工程菌中與前體合成有關(guān)的酶增加，這些酶的基因大多受終成有關(guān)的酶增加，這些酶的基因大多受終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)。產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)。 高拷貝質(zhì)粒的工程菌（高拷貝質(zhì)粒的工程菌（240240拷貝）中，拷貝）中，生長速率和菌體總蛋白合成均減少。這與生長速率和菌體總蛋白合成均減少。這與工程菌大量前體被利用引起前體不足，從工程菌大量前體被利用引起前體不足，從而產(chǎn)生而產(chǎn)生“嚴(yán)緊反應(yīng)嚴(yán)緊反應(yīng)”有關(guān)。有關(guān)。 “ “嚴(yán)緊反應(yīng)嚴(yán)緊反應(yīng)”是當(dāng)氨酰是當(dāng)氨酰tRNAt

5、RNA不足時(shí)不足時(shí), ,核糖體在密碼子上停留核糖體在密碼子上停留, ,并合成被稱為魔并合成被稱為魔點(diǎn)的點(diǎn)的ppGppppGpp的結(jié)果。的結(jié)果。 ppGppppGpp是一個(gè)重要的調(diào)控分子。它通是一個(gè)重要的調(diào)控分子。它通過影響過影響RNARNA鏈的延深過程減少轉(zhuǎn)錄。鏈的延深過程減少轉(zhuǎn)錄。 它的濃度增加會(huì)導(dǎo)致在合成它的濃度增加會(huì)導(dǎo)致在合成mRNAmRNA和和rRNArRNA時(shí)時(shí)RNARNA聚合酶在模板上的移動(dòng)產(chǎn)生停頓，聚合酶在模板上的移動(dòng)產(chǎn)生停頓，RNARNA鏈延長速度減慢，使游離的鏈延長速度減慢，使游離的RNARNA聚合酶濃度降聚合酶濃度降低，嚴(yán)緊控制的啟動(dòng)子如低，嚴(yán)緊控制的啟動(dòng)子如rrnArrn

6、A等的轉(zhuǎn)錄減少。等的轉(zhuǎn)錄減少。 也可能也可能ppGppppGpp是通過干擾是通過干擾RNARNA聚合酶與聚合酶與PLPL啟動(dòng)子專一識(shí)別反應(yīng)。啟動(dòng)子專一識(shí)別反應(yīng)。第六節(jié)第六節(jié) 基因工程菌的不穩(wěn)定性基因工程菌的不穩(wěn)定性 基因工程菌在傳代過程中常出現(xiàn)質(zhì)?；蚬こ叹趥鞔^程中常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象。不穩(wěn)定的現(xiàn)象。 質(zhì)粒不穩(wěn)定可分為：質(zhì)粒不穩(wěn)定可分為： 分裂不穩(wěn)定分裂不穩(wěn)定 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一 定定 比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象。比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象。結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：指外源基因從質(zhì)粒上丟失或結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失

7、所致工程菌性能的改變堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變一、質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因一、質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因 常見分裂不穩(wěn)定的兩個(gè)因素：常見分裂不穩(wěn)定的兩個(gè)因素：含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率；含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率；這兩種菌比數(shù)率差異的大小。這兩種菌比數(shù)率差異的大小。 對同一工程菌控制不同的比生長數(shù)率對同一工程菌控制不同的比生長數(shù)率可改變質(zhì)粒的拷貝數(shù)：可改變質(zhì)粒的拷貝數(shù)： 低拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代低拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率高如增加工程菌質(zhì)?？截悢?shù)可提菌頻率高如增加工程菌質(zhì)?？截悢?shù)可提高穩(wěn)定性；高穩(wěn)定性； 高拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代高拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子

8、代菌頻率低但對穩(wěn)定性不利。菌頻率低但對穩(wěn)定性不利。質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法樣品樣品不含抗性標(biāo)記抗生素不含抗性標(biāo)記抗生素 平平 板板 培培 養(yǎng)基養(yǎng)基10-12h10-12h100100個(gè)菌落個(gè)菌落含抗性標(biāo)記抗生素含抗性標(biāo)記抗生素平平 板板 培培 養(yǎng)養(yǎng) 基基 10-12h10-12h統(tǒng)計(jì)生長菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)生長菌落數(shù)重復(fù)三次重復(fù)三次, ,計(jì)算比值計(jì)算比值 ( (穩(wěn)定性穩(wěn)定性stability)stability)二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法 為了提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，工程菌培養(yǎng)采用為了提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，工程菌培養(yǎng)采用兩階段培養(yǎng)法：兩階段培養(yǎng)法： 先使菌體生長至一定密度；先使菌

9、體生長至一定密度； 再誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)再誘導(dǎo)外源基因的表達(dá) 由于第一階段外源基因未表達(dá)，減小由于第一階段外源基因未表達(dá)，減小了重組菌與質(zhì)粒丟失菌的生長速率的差別，了重組菌與質(zhì)粒丟失菌的生長速率的差別，增加了質(zhì)粒穩(wěn)定性。增加了質(zhì)粒穩(wěn)定性。 在培養(yǎng)基中加入抗菌素抑制質(zhì)粒丟失在培養(yǎng)基中加入抗菌素抑制質(zhì)粒丟失菌的生長，提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。菌的生長，提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。 調(diào)控環(huán)境參數(shù)如溫度、調(diào)控環(huán)境參數(shù)如溫度、pHpH、培養(yǎng)基組、培養(yǎng)基組分和溶解氧濃度分和溶解氧濃度 有些含質(zhì)粒菌對發(fā)酵環(huán)境的改變有些含質(zhì)粒菌對發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒菌反應(yīng)慢，間歇改變培養(yǎng)條比不含質(zhì)粒菌反應(yīng)慢，間歇改變培養(yǎng)條件以改變兩種菌比生長

10、速率，可改善質(zhì)件以改變兩種菌比生長速率，可改善質(zhì)粒穩(wěn)定性。通過間歇供氧和改變稀釋數(shù)粒穩(wěn)定性。通過間歇供氧和改變稀釋數(shù)率，都可以提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。率，都可以提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。 大腸桿菌的蛋白大腸桿菌的蛋白/ /菌體量的比值是基菌體量的比值是基本恒定的，因而菌體的生長速度反映了本恒定的，因而菌體的生長速度反映了蛋白質(zhì)的合成速度。蛋白質(zhì)的合成速度。 培養(yǎng)條件的改變，都會(huì)改變菌體的能培養(yǎng)條件的改變，都會(huì)改變菌體的能量代謝和小分子前體的供應(yīng)，影響生物量代謝和小分子前體的供應(yīng)，影響生物大分子的和成和菌體的生長。大分子的和成和菌體的生長。第七節(jié)第七節(jié) 基因工程菌中試基因工程菌中試基因工程菌中試應(yīng)考慮的問題：適宜

11、商品化生基因工程菌中試應(yīng)考慮的問題：適宜商品化生產(chǎn)的工程菌，設(shè)計(jì)發(fā)酵反應(yīng)器，選擇反應(yīng)過產(chǎn)的工程菌，設(shè)計(jì)發(fā)酵反應(yīng)器，選擇反應(yīng)過程，發(fā)酵培養(yǎng)基組分，維持生產(chǎn)工藝最佳化程，發(fā)酵培養(yǎng)基組分，維持生產(chǎn)工藝最佳化的方法，工藝監(jiān)測方法，工藝控制方法，工的方法，工藝監(jiān)測方法，工藝控制方法，工藝自動(dòng)化使用方法，生物催化劑使用，產(chǎn)品藝自動(dòng)化使用方法，生物催化劑使用，產(chǎn)品提取方法的選擇，分離精制技術(shù)的選擇。提取方法的選擇，分離精制技術(shù)的選擇。一一 工程菌選擇工程菌選擇 用于中試的工程菌需具備的條件試能用一般用于中試的工程菌需具備的條件試能用一般基因重組技術(shù)獲得，有高產(chǎn)潛力，能有工基因重組技術(shù)獲得，有高產(chǎn)潛力，能有工

12、業(yè)原料薇培養(yǎng)基，生產(chǎn)工期能采用一般工業(yè)原料薇培養(yǎng)基，生產(chǎn)工期能采用一般工業(yè)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，能產(chǎn)生和分泌蛋白質(zhì)，不致業(yè)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，能產(chǎn)生和分泌蛋白質(zhì)，不致病，無毒性，能安全生產(chǎn)，符合國家衛(wèi)生病，無毒性，能安全生產(chǎn)，符合國家衛(wèi)生部門有關(guān)規(guī)定，產(chǎn)品有特異性，發(fā)酵液粘部門有關(guān)規(guī)定，產(chǎn)品有特異性，發(fā)酵液粘度小。度小。二二 反應(yīng)器設(shè)計(jì)反應(yīng)器設(shè)計(jì)三三 發(fā)酵培養(yǎng)基組成發(fā)酵培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基組成及作用：培養(yǎng)基組成及作用：n 提供化學(xué)元素提供化學(xué)元素n 提供特殊營養(yǎng)源提供特殊營養(yǎng)源n 提供能源提供能源n 控制代謝控制代謝四四 工藝最佳化與參數(shù)監(jiān)測控制工藝最佳化與參數(shù)監(jiān)測控制1.1.工藝最佳化工藝最佳化 是指最快周期，最高產(chǎn)

13、量，最好質(zhì)量，最低消耗，是指最快周期，最高產(chǎn)量，最好質(zhì)量，最低消耗，最大安全性，最周全的服務(wù)處理效果，最佳化速最大安全性，最周全的服務(wù)處理效果，最佳化速度與最低失敗率等的綜合指標(biāo)度與最低失敗率等的綜合指標(biāo)2.2.參數(shù)監(jiān)測控制參數(shù)監(jiān)測控制 需監(jiān)測與控制的需監(jiān)測與控制的4 4種參數(shù)：種參數(shù)：A A，主要參數(shù)：，主要參數(shù)：pH,pH,溫溫度，溶氧。度，溶氧。B B，生物量：渾濁度，細(xì)胞組分，總氮，生物量：渾濁度，細(xì)胞組分，總氮量及菌絲干重。量及菌絲干重。C C，碳源：糖，有機(jī)酸，淀粉。，碳源：糖，有機(jī)酸，淀粉。D D，產(chǎn)品。產(chǎn)品。五 計(jì)算機(jī)的應(yīng)用第八節(jié) 重組工程菌的培養(yǎng) 基因工程菌的培養(yǎng)過程包括:

14、通過搖瓶操作基因工程菌生長的基礎(chǔ)條件,如溫度、pH、培養(yǎng)基各種組分、碳氧比，分析表達(dá)產(chǎn)物的合成、積累對受體細(xì)胞的影響; 通過培養(yǎng)罐操作確定培養(yǎng)參數(shù)和控制方案以及順序。菌種菌種 一級種子搖瓶一級種子搖瓶 二級種子罐培養(yǎng)二級種子罐培養(yǎng) 擴(kuò)大培養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng) 原料原料 發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng) 滅菌滅菌 發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵生產(chǎn) 代謝產(chǎn)物分離代謝產(chǎn)物分離 基配制基配制 微生物工業(yè)發(fā)酵過程簡圖微生物工業(yè)發(fā)酵過程簡圖 一 基因工程菌的培養(yǎng)方式1. 分批培養(yǎng)2. 補(bǔ)料分批培養(yǎng)3. 連續(xù)培養(yǎng)4. 透析培養(yǎng)5. 固定化培養(yǎng) 2. 2.補(bǔ)料分批培養(yǎng)補(bǔ)料分批培養(yǎng) 補(bǔ)料分批培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵補(bǔ)料分批培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行培

15、養(yǎng)反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng), ,經(jīng)過一段時(shí)間后間經(jīng)過一段時(shí)間后間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長的方法。進(jìn)一步生長的方法。二、基因工程菌的培養(yǎng)工藝二、基因工程菌的培養(yǎng)工藝 基因工程菌的發(fā)酵與傳統(tǒng)的微生基因工程菌的發(fā)酵與傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵不同物發(fā)酵不同, ,基因工程菌帶外源基因基因工程菌帶外源基因, ,發(fā)酵的目的是使外源基因高效表達(dá)。發(fā)酵的目的是使外源基因高效表達(dá)。它不僅涉及宿主載體和克隆基因之它不僅涉及宿主載體和克隆基因之間的相互關(guān)系還和環(huán)境有關(guān)。間的相互關(guān)系還和環(huán)境有關(guān)。 工藝要求：外源基因既高效表達(dá)，工藝要求：外源基因既高效表達(dá)，又有利于產(chǎn)品分離純化。對發(fā)酵

16、影又有利于產(chǎn)品分離純化。對發(fā)酵影響較大的幾個(gè)因素有：響較大的幾個(gè)因素有：1. 培養(yǎng)基的影響2. 接種量的影響3. 溫度的影響4. 溶氧量的影響5. 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響6. 誘導(dǎo)表達(dá)程序的影響7. pH的影響 培養(yǎng)基的影響培養(yǎng)基的影響 培養(yǎng)基的組成既要提高工程菌的生長培養(yǎng)基的組成既要提高工程菌的生長速率，又要保持工程菌的穩(wěn)定性，使外源速率，又要保持工程菌的穩(wěn)定性，使外源基因高效表達(dá)。常用的碳源有：葡萄糖、基因高效表達(dá)。常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿、氨水、

17、硫酸銨、氯化銨等。物、玉米漿、氨水、硫酸銨、氯化銨等。還有無機(jī)鹽、維生素等。還有無機(jī)鹽、維生素等。 不同的碳源對菌體的生長和外源基不同的碳源對菌體的生長和外源基因表達(dá)有較大的影響。使用葡萄糖和甘因表達(dá)有較大的影響。使用葡萄糖和甘油對菌體比生長速率及呼吸強(qiáng)度相差不油對菌體比生長速率及呼吸強(qiáng)度相差不大。但使用甘油菌體得率較大，而使用大。但使用甘油菌體得率較大，而使用葡萄糖菌體產(chǎn)生的副產(chǎn)品較多。葡萄糖葡萄糖菌體產(chǎn)生的副產(chǎn)品較多。葡萄糖對對laclac啟動(dòng)子有阻遏作用。乳糖對啟動(dòng)子有阻遏作用。乳糖對laclac啟啟動(dòng)子有利動(dòng)子有利。 在氮源中，酪蛋白水解物有利在氮源中，酪蛋白水解物有利于產(chǎn)物的合成與分

18、泌。色氨酸對于產(chǎn)物的合成與分泌。色氨酸對trptrp啟動(dòng)子控制的基因有影響。啟動(dòng)子控制的基因有影響。 無機(jī)磷在許多代謝反應(yīng)中是一無機(jī)磷在許多代謝反應(yīng)中是一個(gè)效應(yīng)因子，磷濃度不同，影響個(gè)效應(yīng)因子，磷濃度不同，影響菌體生長。菌體生長。接種量的影響接種量的影響 接種量是指移入的種子液體積和培養(yǎng)液體接種量是指移入的種子液體積和培養(yǎng)液體積的比例。積的比例。 接種量的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期。接種量的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期。 接種量小，菌體延遲期較長，使菌齡老化，接種量小，菌體延遲期較長，使菌齡老化，不利于外源基因表達(dá)。不利于外源基因表達(dá)。 接種量大，可縮短生長延遲期，菌體接種量大，可縮短生長延

19、遲期，菌體迅速繁衍，很快進(jìn)入對數(shù)生長期，適迅速繁衍，很快進(jìn)入對數(shù)生長期，適于表達(dá)外源基因。于表達(dá)外源基因。 接種量過高，使菌體生長過快，代接種量過高，使菌體生長過快，代謝物積累過多，反而會(huì)抑制后期菌體謝物積累過多，反而會(huì)抑制后期菌體的生長的生長。 溫度的影響溫度的影響 溫毒對基因表達(dá)的調(diào)控作用發(fā)生在溫毒對基因表達(dá)的調(diào)控作用發(fā)生在復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯和小分子調(diào)節(jié)分子的合成復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯和小分子調(diào)節(jié)分子的合成等水平上。等水平上。 溫度對發(fā)酵過程的影響是多方面的。溫度對發(fā)酵過程的影響是多方面的。它影響各種酶的反應(yīng)速度，改變菌體代它影響各種酶的反應(yīng)速度，改變菌體代謝產(chǎn)物的反應(yīng)方向，影響代謝調(diào)控機(jī)制。謝產(chǎn)物的反應(yīng)

20、方向，影響代謝調(diào)控機(jī)制。 適宜的發(fā)酵溫度是既適合菌體的生適宜的發(fā)酵溫度是既適合菌體的生長，又適合代謝產(chǎn)物合成的溫度。高溫長，又適合代謝產(chǎn)物合成的溫度。高溫或低溫都會(huì)使發(fā)酵異常，影響終產(chǎn)物的或低溫都會(huì)使發(fā)酵異常，影響終產(chǎn)物的形成并導(dǎo)致減產(chǎn)。形成并導(dǎo)致減產(chǎn)。 溫度還影響蛋白質(zhì)的活性和包含體溫度還影響蛋白質(zhì)的活性和包含體的形成。的形成。 溶解氧的影響溶解氧的影響 對于好氧發(fā)酵對于好氧發(fā)酵, ,溶解氧濃度是重要的溶解氧濃度是重要的參數(shù)。參數(shù)。 好氧微生物利用溶解于培養(yǎng)液中的好氧微生物利用溶解于培養(yǎng)液中的氧氣進(jìn)行呼吸。氧氣進(jìn)行呼吸。 若能提高溶氧速度和氧的利用率，若能提高溶氧速度和氧的利用率，則能提高發(fā)

21、酵產(chǎn)率。則能提高發(fā)酵產(chǎn)率。 發(fā)酵時(shí)，隨發(fā)酵時(shí)，隨DODO2 2濃度的下降，細(xì)胞生長減濃度的下降，細(xì)胞生長減慢，慢，STST值下降，發(fā)酵后期下降幅度更大。值下降，發(fā)酵后期下降幅度更大。 外源基因的高效表達(dá)需要大量的能量，外源基因的高效表達(dá)需要大量的能量，促進(jìn)細(xì)胞的呼吸作用，提高對氧的需求。促進(jìn)細(xì)胞的呼吸作用，提高對氧的需求。 維持較高的維持較高的DODO2 2值，才能提高工程菌的生值，才能提高工程菌的生長，利于外源蛋白產(chǎn)物的形成。長，利于外源蛋白產(chǎn)物的形成。 采用調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速的方法采用調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速的方法, ,可改變培養(yǎng)過可改變培養(yǎng)過程中的氧供給，提高活菌產(chǎn)量。程中的氧供給，提高活菌產(chǎn)量。 誘導(dǎo)時(shí)

22、機(jī)的影響誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響 對于對于PP啟動(dòng)子型的工程菌，使用啟動(dòng)子型的工程菌，使用cIcI阻阻遏蛋白的溫度敏感型突變株（遏蛋白的溫度敏感型突變株（clts857clts857），在），在282830 30 0 0C C下培養(yǎng)時(shí)，該突變體能合成有活性下培養(yǎng)時(shí)，該突變體能合成有活性的阻遏蛋白阻遏的阻遏蛋白阻遏PLPL啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄；啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄； 當(dāng)溫度升高當(dāng)溫度升高42 42 0 0C C時(shí)，該阻遏蛋白失活，時(shí)，該阻遏蛋白失活，使啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，提高目的基因的表達(dá)效使啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，提高目的基因的表達(dá)效率。一般在對數(shù)生長期或?qū)?shù)生長后期升溫率。一般在對數(shù)生長期或?qū)?shù)生長后期升溫誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)。

23、在對數(shù)生長期，細(xì)胞快速繁殖，直在對數(shù)生長期，細(xì)胞快速繁殖，直到細(xì)胞密度達(dá)到到細(xì)胞密度達(dá)到10109 9/ /個(gè)為止，這時(shí)個(gè)為止，這時(shí)菌體數(shù)目倍增，對營養(yǎng)和氧需求量菌體數(shù)目倍增，對營養(yǎng)和氧需求量急增，急增，營養(yǎng)和氧營養(yǎng)和氧成了菌群旺盛代謝成了菌群旺盛代謝的限制因素。的限制因素。7 pH7 pH的影響的影響 pH pH對細(xì)胞的正常生長和外源蛋白對細(xì)胞的正常生長和外源蛋白的高效表達(dá)都有影響，所以應(yīng)根的高效表達(dá)都有影響，所以應(yīng)根據(jù)工程菌的生長和代謝情況，對據(jù)工程菌的生長和代謝情況，對pHpH進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)。進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)。 如采取兩段培養(yǎng)工藝，培養(yǎng)前期如采取兩段培養(yǎng)工藝，培養(yǎng)前期重點(diǎn)是優(yōu)化工程菌的生長

24、條件，重點(diǎn)是優(yōu)化工程菌的生長條件，其最佳其最佳pHpH在在6.86.87.47.4左右左右; ;培養(yǎng)培養(yǎng)后期重點(diǎn)是優(yōu)化外源蛋白的表達(dá)后期重點(diǎn)是優(yōu)化外源蛋白的表達(dá)條件條件, ,其最佳其最佳pHpH為為6.06.06.56.5。 總之總之, ,最佳化的工藝是獲得最佳化的工藝是獲得: : 最快周期、最高產(chǎn)量、最好質(zhì)最快周期、最高產(chǎn)量、最好質(zhì) 量、量、最低消耗、最大安全性、最周全的最低消耗、最大安全性、最周全的廢物處理效果、最佳速度和最低失廢物處理效果、最佳速度和最低失敗率等。敗率等。三、基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備三、基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備 應(yīng)用發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)基因工程菌。應(yīng)用發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)基因工程菌。它不

25、同于微生物發(fā)酵，微生物發(fā)酵目它不同于微生物發(fā)酵，微生物發(fā)酵目的是為了獲得初級或次級代謝產(chǎn)物，的是為了獲得初級或次級代謝產(chǎn)物，細(xì)胞生長并非主要目標(biāo)，而基因工程細(xì)胞生長并非主要目標(biāo)，而基因工程發(fā)酵是為了獲得最大量的基因表達(dá)產(chǎn)發(fā)酵是為了獲得最大量的基因表達(dá)產(chǎn)物。物。 發(fā)酵罐的組成有：發(fā)酵罐的組成有： 發(fā)酵罐體、保證高傳質(zhì)作用的攪發(fā)酵罐體、保證高傳質(zhì)作用的攪拌器、精細(xì)的溫度控制和滅菌系拌器、精細(xì)的溫度控制和滅菌系統(tǒng)、空氣無菌過濾裝置、殘留氣統(tǒng)、空氣無菌過濾裝置、殘留氣體處理裝置、參數(shù)測量與控制系體處理裝置、參數(shù)測量與控制系統(tǒng)、培養(yǎng)液配制和連續(xù)操作系統(tǒng)。統(tǒng)、培養(yǎng)液配制和連續(xù)操作系統(tǒng)。 對發(fā)酵罐要求：對發(fā)

26、酵罐要求： 提供菌體生長最適生長條件，提供菌體生長最適生長條件， 培養(yǎng)過程不得污染，培養(yǎng)過程不得污染， 保證純菌培養(yǎng)，保證純菌培養(yǎng)， 培養(yǎng)及消毒過程不得游離異物，培養(yǎng)及消毒過程不得游離異物，不能干擾細(xì)菌代謝活動(dòng)等不能干擾細(xì)菌代謝活動(dòng)等。第九節(jié) 高密度發(fā)酵 利用大腸桿菌表達(dá)重組基因產(chǎn)物與傳統(tǒng)發(fā)酵培養(yǎng)不同，重組菌培養(yǎng)有自身的特點(diǎn)，即目的基因克隆自啊質(zhì)粒上，存在分裂不穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性；隨著培養(yǎng)環(huán)境的改變，質(zhì)粒拷貝數(shù)會(huì)有增有減，基因劑量也會(huì)相應(yīng)變化；大多數(shù)克隆基因的表達(dá)是已知啟動(dòng)子控制的，因而易通過改變環(huán)境條件來調(diào)節(jié)。v高密度發(fā)酵是一個(gè)相對概念，一般指培養(yǎng)基中工程菌的菌體濃度在50gDCW/L以上

27、，理論上的最高值可達(dá)200gDCW/L一 影響高密度發(fā)酵的因素v1.培養(yǎng)基v2.溶氧濃度v3.pHv4.溫度v5.代謝副產(chǎn)物二二 實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵的方法實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵的方法v1.1.發(fā)酵條件的改進(jìn)發(fā)酵條件的改進(jìn)（1 1）培養(yǎng)基的選擇）培養(yǎng)基的選擇（2 2）建立流加式培養(yǎng)的方式）建立流加式培養(yǎng)的方式（3 3）提高供氧能力）提高供氧能力v2.2.構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌（1 1）阻斷乙酸產(chǎn)生的主要途徑）阻斷乙酸產(chǎn)生的主要途徑（2 2）對碳代謝流進(jìn)行分流）對碳代謝流進(jìn)行分流（3 3）限制進(jìn)入糖酵解途徑的碳代謝流）限制進(jìn)入糖酵解途徑的碳代謝流（4 4）引入血紅蛋白

28、基因）引入血紅蛋白基因v3.3.構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌第十節(jié)第十節(jié) 基因工程藥物的分離純化基因工程藥物的分離純化 基因工程藥物的分離、純化非?；蚬こ趟幬锏姆蛛x、純化非常重要。表達(dá)的產(chǎn)物都是多肽或蛋白重要。表達(dá)的產(chǎn)物都是多肽或蛋白質(zhì)質(zhì) 。它的制得具有以下特點(diǎn)：。它的制得具有以下特點(diǎn)：表達(dá)產(chǎn)物在初始料中含量較低；表達(dá)產(chǎn)物在初始料中含量較低；含有大量細(xì)胞及代謝產(chǎn)物；含有大量細(xì)胞及代謝產(chǎn)物；表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性差，易失活變表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性差，易失活變性；性；表達(dá)產(chǎn)物的種類繁多、結(jié)構(gòu)不表達(dá)產(chǎn)物的種類繁多、結(jié)構(gòu)不一、活性各異；一、活性各異；對其質(zhì)量要求純度高、無菌、

29、對其質(zhì)量要求純度高、無菌、無熱原。無熱原。一、建立分離純化工藝的根據(jù)一、建立分離純化工藝的根據(jù) 含目的產(chǎn)物的起始料的特點(diǎn)含目的產(chǎn)物的起始料的特點(diǎn) 基因工程菌的發(fā)酵產(chǎn)物其上游過程的基因工程菌的發(fā)酵產(chǎn)物其上游過程的各種因素對分離、純化工藝有影響。包各種因素對分離、純化工藝有影響。包括：括：菌種的類型及其代謝特性。菌種的類型及其代謝特性。原材料培養(yǎng)基的來源及其質(zhì)量。原材料培養(yǎng)基的來源及其質(zhì)量。生產(chǎn)工藝及條件。生產(chǎn)工藝及條件。 物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)。物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)。目的產(chǎn)物特性。目的產(chǎn)物特性。產(chǎn)品質(zhì)量的要求產(chǎn)品質(zhì)量的要求二二 、分離純化的基本過程、分離純化的基本過程 發(fā)酵液發(fā)酵液 細(xì)胞分離細(xì)

30、胞分離胞內(nèi)產(chǎn)物胞內(nèi)產(chǎn)物 胞外產(chǎn)物胞外產(chǎn)物 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎 固液分離固液分離 濃縮濃縮 初步分離初步分離 高度純化高度純化 制劑制劑 產(chǎn)品產(chǎn)品包含體包含體 細(xì)胞碎片分離細(xì)胞碎片分離 變性變性 復(fù)性復(fù)性三、分離純化的技術(shù)三、分離純化的技術(shù)分離純化的技術(shù)要求：分離純化的技術(shù)要求：技術(shù)條件溫和能保持產(chǎn)物生物技術(shù)條件溫和能保持產(chǎn)物生物活性?；钚?。選擇性好，能從復(fù)雜的混合物選擇性好，能從復(fù)雜的混合物中有效的將目的產(chǎn)物分離，達(dá)中有效的將目的產(chǎn)物分離，達(dá)到較高的純化倍數(shù)。到較高的純化倍數(shù)。 收率要高。收率要高。兩個(gè)技數(shù)間能直接銜接，兩個(gè)技數(shù)間能直接銜接， 不需要對物料加以處理。不需要對物料加以處理。純化過程

31、要快，滿足高純化過程要快，滿足高 生產(chǎn)率的要求。生產(chǎn)率的要求。細(xì)胞破碎與固液分離細(xì)胞破碎與固液分離 細(xì)胞收集：細(xì)胞收集： 離心法、膜分離法。離心法、膜分離法。 細(xì)胞破碎：機(jī)械破碎法、非機(jī)細(xì)胞破碎：機(jī)械破碎法、非機(jī)械破碎法。械破碎法。 固液分離固液分離目的產(chǎn)物的分離純化目的產(chǎn)物的分離純化 目的產(chǎn)物含有大量雜質(zhì)必須進(jìn)行分離純化。目的產(chǎn)物含有大量雜質(zhì)必須進(jìn)行分離純化。 蛋白質(zhì)分離純化方法的設(shè)計(jì)根據(jù)其分子的理化性質(zhì)和蛋白質(zhì)分離純化方法的設(shè)計(jì)根據(jù)其分子的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性來決定。生物學(xué)特性來決定。產(chǎn)產(chǎn) 物物 特特 性性 作作 用用 等電點(diǎn)等電點(diǎn) 決定離子交換種類及條件決定離子交換種類及條件相對分子量相

32、對分子量 選擇不同孔徑的介質(zhì)選擇不同孔徑的介質(zhì)疏水性疏水性 與疏水、反相介質(zhì)結(jié)合的程度與疏水、反相介質(zhì)結(jié)合的程度生物特異性生物特異性 決定親和配基決定親和配基溶解性溶解性 決定分離體系及蛋白濃度決定分離體系及蛋白濃度穩(wěn)定性穩(wěn)定性 決定工藝采用溫度及流程時(shí)間決定工藝采用溫度及流程時(shí)間目的產(chǎn)物的分離純化目的產(chǎn)物的分離純化 目的產(chǎn)物含有大量雜質(zhì)必須進(jìn)目的產(chǎn)物含有大量雜質(zhì)必須進(jìn)行分離純化。行分離純化。 蛋白質(zhì)分離純化方法的設(shè)計(jì)根蛋白質(zhì)分離純化方法的設(shè)計(jì)根據(jù)其分子的理化性質(zhì)和生物學(xué)特?fù)?jù)其分子的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性來決定。性來決定。 產(chǎn)產(chǎn) 物物 特特 性性 作作 用用 等電點(diǎn)等電點(diǎn) 決定離子交換種類及條件

33、決定離子交換種類及條件相對分子量相對分子量 選擇不同孔徑的介質(zhì)選擇不同孔徑的介質(zhì)疏水性疏水性 與疏水、反相介質(zhì)結(jié)合的程度與疏水、反相介質(zhì)結(jié)合的程度生物特異性生物特異性 決定親和配基決定親和配基溶解性溶解性 決定分離體系及蛋白濃度決定分離體系及蛋白濃度穩(wěn)定性穩(wěn)定性 決定工藝采用溫度及流程時(shí)間決定工藝采用溫度及流程時(shí)間 產(chǎn)物的特性在分離純化中的作用產(chǎn)物的特性在分離純化中的作用分離純化的方法依賴色譜分離方法分離純化的方法依賴色譜分離方法 離子交換層析（離子交換層析（ ion exchange ion exchange chromatography IECchromatography IEC） 離子交

34、換層析的基本原理是通過帶電離子交換層析的基本原理是通過帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離子進(jìn)行交換，從而達(dá)到分離的目的。子進(jìn)行交換，從而達(dá)到分離的目的。 它具有分辨率高容量大操作容易，該它具有分辨率高容量大操作容易，該法已成為多肽蛋白質(zhì)核酸分離純化的重法已成為多肽蛋白質(zhì)核酸分離純化的重要方法。要方法。 反相色譜反相色譜（reversed phase chromatographyreversed phase chromatography，RPCRPC）和和 疏水色譜疏水色譜（hydrophobic interaction chromatographyhydr

35、ophobic interaction chromatography，HICHIC） 反相色譜和疏水色譜是根據(jù)蛋白質(zhì)反相色譜和疏水色譜是根據(jù)蛋白質(zhì)疏水性的差異來分離純化的。疏水性的差異來分離純化的。 反相色譜是利用溶質(zhì)分子中非反相色譜是利用溶質(zhì)分子中非極性基團(tuán)與非極性固定相之間相互作極性基團(tuán)與非極性固定相之間相互作用力的大小以及溶質(zhì)分子中極性基團(tuán)用力的大小以及溶質(zhì)分子中極性基團(tuán)與流動(dòng)相中極性分子之間在相反方向與流動(dòng)相中極性分子之間在相反方向作用力的大小差異進(jìn)行分離的。作用力的大小差異進(jìn)行分離的。 常用固定相為硅膠烷基鍵合相。常用固定相為硅膠烷基鍵合相。 流動(dòng)相為低離子強(qiáng)度的酸性水溶液，流動(dòng)相為

36、低離子強(qiáng)度的酸性水溶液，加入能與水互溶的乙腈、甲醇、異加入能與水互溶的乙腈、甲醇、異丙醇等有機(jī)溶劑。丙醇等有機(jī)溶劑。 由于固定相骨架疏水性強(qiáng)，吸附的由于固定相骨架疏水性強(qiáng)，吸附的蛋白質(zhì)需用有機(jī)溶劑才能洗脫下來。蛋白質(zhì)需用有機(jī)溶劑才能洗脫下來。 疏水色譜的原理與反相色譜的原理疏水色譜的原理與反相色譜的原理相似，主要是利用蛋白質(zhì)分子表面上相似，主要是利用蛋白質(zhì)分子表面上的疏水區(qū)域和介質(zhì)中的疏水基團(tuán)之間的疏水區(qū)域和介質(zhì)中的疏水基團(tuán)之間的相互作用，無機(jī)鹽的存在能使相互的相互作用，無機(jī)鹽的存在能使相互作用力增強(qiáng)。作用力增強(qiáng)。 固定相介質(zhì)表面的疏水性比反相色固定相介質(zhì)表面的疏水性比反相色譜介質(zhì)表面的疏水性

37、弱。為有機(jī)聚合譜介質(zhì)表面的疏水性弱。為有機(jī)聚合物鍵合相或大孔硅膠鍵合相。物鍵合相或大孔硅膠鍵合相。 流動(dòng)相為流動(dòng)相為pH6pH68 8鹽水溶液。鹽水溶液。 在高鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)分子中疏水在高鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)分子中疏水性部分與介子的疏水基團(tuán)產(chǎn)生疏水性性部分與介子的疏水基團(tuán)產(chǎn)生疏水性作用而被吸附；鹽濃度降低時(shí)蛋白質(zhì)作用而被吸附；鹽濃度降低時(shí)蛋白質(zhì)疏水性作用減弱，目的蛋白質(zhì)被逐步疏水性作用減弱，目的蛋白質(zhì)被逐步洗脫下來，蛋白質(zhì)疏水性越強(qiáng)，洗脫洗脫下來，蛋白質(zhì)疏水性越強(qiáng)，洗脫時(shí)間越長。時(shí)間越長。 與反相色譜相比，疏水色譜回收率與反相色譜相比，疏水色譜回收率較高，蛋白質(zhì)變性可能性小。較高，蛋白質(zhì)變性可能

38、性小。親和層析（親和層析（affinity affinity chromatographychromatography，ACAC） 親和層析是利用固定化配基與目親和層析是利用固定化配基與目的蛋白質(zhì)之間特異的生物親和力的蛋白質(zhì)之間特異的生物親和力進(jìn)行吸附，如抗體與抗原、受體進(jìn)行吸附，如抗體與抗原、受體與激素、酶與底物之間的作用與激素、酶與底物之間的作用。 配基：在親和層析中起可逆性結(jié)合的配基：在親和層析中起可逆性結(jié)合的特異性物質(zhì)。特異性物質(zhì)。 載體：與配基結(jié)合的支撐物。載體：與配基結(jié)合的支撐物。 親和層析大體可分三步：親和層析大體可分三步：配基固定化配基固定化吸附目的物吸附目的物樣品解吸樣品解吸

39、凝膠過濾凝膠過濾 凝膠過濾是以具有大小一定的多孔凝膠過濾是以具有大小一定的多孔性凝膠作為分離介質(zhì)，小分子能進(jìn)性凝膠作為分離介質(zhì)，小分子能進(jìn)入孔內(nèi)，在柱中緩慢移動(dòng)，而大分入孔內(nèi)，在柱中緩慢移動(dòng)，而大分子不能進(jìn)入孔內(nèi)，快速移動(dòng)，利用子不能進(jìn)入孔內(nèi)，快速移動(dòng)，利用這種移動(dòng)差別可使大分子與小分子這種移動(dòng)差別可使大分子與小分子分開。分開。 根據(jù)蛋白質(zhì)的相對分子量和蛋白質(zhì)分子根據(jù)蛋白質(zhì)的相對分子量和蛋白質(zhì)分子的動(dòng)力學(xué)體積的大小差異，可以利用的動(dòng)力學(xué)體積的大小差異，可以利用凝膠過濾來分離純化目的蛋白。凝膠過濾來分離純化目的蛋白。 主要應(yīng)用兩個(gè)方面：主要應(yīng)用兩個(gè)方面： 脫鹽和更換緩沖液脫鹽和更換緩沖液 蛋白質(zhì)

40、分子的分級分離。蛋白質(zhì)分子的分級分離。在產(chǎn)品的形成階段前用于除去產(chǎn)物的在產(chǎn)品的形成階段前用于除去產(chǎn)物的多聚體及降解產(chǎn)物。多聚體及降解產(chǎn)物。非蛋白質(zhì)雜質(zhì)的去除非蛋白質(zhì)雜質(zhì)的去除 DNA DNA、熱原質(zhì)和病毒的純化方法：、熱原質(zhì)和病毒的純化方法： DNA DNA的去除的去除 DNADNA在在pH4.0pH4.0以上呈陰離子，蛋白質(zhì)的以上呈陰離子，蛋白質(zhì)的pIpI在在6.06.0以以上上, ,可用陰離子交換劑吸附除去。如蛋白質(zhì)為強(qiáng)酸性，可選可用陰離子交換劑吸附除去。如蛋白質(zhì)為強(qiáng)酸性，可選擇條件使其吸附在陽離子交換劑上，而擇條件使其吸附在陽離子交換劑上，而DNADNA不吸附。親和層不吸附。親和層析和疏

41、水層析也有效。析和疏水層析也有效。熱原質(zhì)的去除熱原質(zhì)的去除 熱原質(zhì)是腸桿菌科產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素（脂多熱原質(zhì)是腸桿菌科產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素（脂多糖）去除困難。分子量小的多肽或蛋白質(zhì)中的熱原可用超濾糖）去除困難。分子量小的多肽或蛋白質(zhì)中的熱原可用超濾或反滲透，脂多糖是陰離子可用陰離子交換層析除去，脂多或反滲透，脂多糖是陰離子可用陰離子交換層析除去，脂多糖是疏水性可用疏水層析法。糖是疏水性可用疏水層析法。病毒的去除病毒的去除 層析或過濾可將病毒去除。層析或過濾可將病毒去除。 非蛋白質(zhì)雜質(zhì)的去除非蛋白質(zhì)雜質(zhì)的去除 DNA DNA、熱原質(zhì)和病毒的純化方法：、熱原質(zhì)和病毒的純化方法： DNA DNA的去除的去除

42、 DNADNA在在pH4.0pH4.0以上呈陰離以上呈陰離子，蛋白質(zhì)的子，蛋白質(zhì)的pIpI在在6.06.0以上以上, ,可用陰離子可用陰離子交換劑吸附除去。如蛋白質(zhì)為強(qiáng)酸性，交換劑吸附除去。如蛋白質(zhì)為強(qiáng)酸性，可選擇條件使其吸附在陽離子交換劑上，可選擇條件使其吸附在陽離子交換劑上，而而DNADNA不吸附。親和層析和疏水層析也不吸附。親和層析和疏水層析也有效。有效。熱原質(zhì)的去除熱原質(zhì)的去除 熱原質(zhì)是腸桿菌科產(chǎn)生熱原質(zhì)是腸桿菌科產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素（脂多糖）去除困難。的細(xì)菌內(nèi)毒素（脂多糖）去除困難。分子量小的多肽或蛋白質(zhì)中的熱原可分子量小的多肽或蛋白質(zhì)中的熱原可用超濾或反滲透，脂多糖是陰離子可用超濾或反

43、滲透，脂多糖是陰離子可用陰離子交換層析除去，脂多糖是疏用陰離子交換層析除去，脂多糖是疏水性可用疏水層析法。水性可用疏水層析法。病毒的去除病毒的去除 層析或過濾可將病毒去除。層析或過濾可將病毒去除。 四、選擇分離純化方法的依據(jù)四、選擇分離純化方法的依據(jù) 根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來選擇根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來選擇 分泌型表達(dá)產(chǎn)物的發(fā)酵液體積很分泌型表達(dá)產(chǎn)物的發(fā)酵液體積很大但濃度較低純化前必須濃縮可用大但濃度較低純化前必須濃縮可用沉淀和超濾法。沉淀和超濾法。 產(chǎn)物在周質(zhì)表達(dá)是介于細(xì)胞內(nèi)可溶性產(chǎn)物在周質(zhì)表達(dá)是介于細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)和分泌表達(dá)的一種形式表達(dá)和分泌表達(dá)的一種形式,它可以它可以避開可溶性表達(dá)蛋白和培養(yǎng)基中蛋

44、白避開可溶性表達(dá)蛋白和培養(yǎng)基中蛋白類雜質(zhì)類雜質(zhì),在一定程度上有利于在一定程度上有利于分離純分離純化化. .為了獲得周質(zhì)蛋白為了獲得周質(zhì)蛋白 經(jīng)低濃度溶菌酶處理后經(jīng)低濃度溶菌酶處理后, ,可采用滲透可采用滲透壓休克的方法來獲得。壓休克的方法來獲得。 可溶性表達(dá)產(chǎn)物破菌后的細(xì)胞可溶性表達(dá)產(chǎn)物破菌后的細(xì)胞上清，首選親和分離方法，或離上清，首選親和分離方法，或離子交換層析。子交換層析。根據(jù)分離單元之間的銜接選擇根據(jù)分離單元之間的銜接選擇 應(yīng)選擇不同機(jī)制的分離單元組成一套應(yīng)選擇不同機(jī)制的分離單元組成一套分離工藝，盡早采用高效的分離手段。分離工藝，盡早采用高效的分離手段。 先將最多的雜質(zhì)去除，將費(fèi)用最高、

45、先將最多的雜質(zhì)去除，將費(fèi)用最高、最費(fèi)時(shí)的分離單元放在最后階段，即最費(fèi)時(shí)的分離單元放在最后階段，即通常先運(yùn)用非特異、低分辨的操作單通常先運(yùn)用非特異、低分辨的操作單元（如沉淀超濾和吸附等），以盡快元（如沉淀超濾和吸附等），以盡快縮小樣品體積，提高產(chǎn)物濃度，去除縮小樣品體積，提高產(chǎn)物濃度，去除最主要雜質(zhì)（包括非蛋白類雜質(zhì)）。最主要雜質(zhì)（包括非蛋白類雜質(zhì)）。 隨后采用高分辨率的操作單元隨后采用高分辨率的操作單元（離子交換層析和親和層析）凝膠（離子交換層析和親和層析）凝膠過濾放在最后，這樣可以提高分離過濾放在最后，這樣可以提高分離效果。效果。 層析分離次序的選擇同樣重要，層析分離次序的選擇同樣重要，合理

46、的組合能提高分辨效率，并有合理的組合能提高分辨效率，并有利于各步驟間的過渡。如離子交換利于各步驟間的過渡。如離子交換層析、親和層析、凝膠過濾。層析、親和層析、凝膠過濾。根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇 分離純化工藝應(yīng)遵循以下原則：分離純化工藝應(yīng)遵循以下原則： 具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性 盡可能減少組成工藝的步驟盡可能減少組成工藝的步驟 各技術(shù)步驟間要相互適應(yīng)和協(xié)調(diào)各技術(shù)步驟間要相互適應(yīng)和協(xié)調(diào) 工藝過程中盡可能少用試劑工藝過程中盡可能少用試劑 工藝所用時(shí)間要短工藝所用時(shí)間要短 工藝和技術(shù)必須高效收率高工藝和技術(shù)必須高效收率高易操作能耗低易操作能耗低

47、具有較高的安全性具有較高的安全性第十一節(jié)第十一節(jié) 變性蛋白的復(fù)性變性蛋白的復(fù)性v外源基因在大腸桿菌中的高表達(dá)常常導(dǎo)致包外源基因在大腸桿菌中的高表達(dá)常常導(dǎo)致包涵體的形成，雖然包涵體具有富集目標(biāo)蛋白涵體的形成，雖然包涵體具有富集目標(biāo)蛋白質(zhì)、抗蛋白酶、對宿主毒性小等優(yōu)點(diǎn)，但包質(zhì)、抗蛋白酶、對宿主毒性小等優(yōu)點(diǎn)，但包涵體蛋白質(zhì)的復(fù)性率一般都很低涵體蛋白質(zhì)的復(fù)性率一般都很低 。一一. .包涵體的特性與形成包涵體的特性與形成v1.1.包涵體的定義、組成與特性：包涵體的定義、組成與特性： 包涵體是指細(xì)菌表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成無包涵體是指細(xì)菌表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成無活性的固體顆粒。活性的固體顆粒。

48、一般含有一般含有50%50%以上的重組蛋白，以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、其余為核糖體元件、RNARNA聚合酶、內(nèi)毒素、外膜蛋聚合酶、內(nèi)毒素、外膜蛋白白o(hù)mpCompC、ompFompF和和ompAompA等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNADNA，以及脂體、脂多糖等，大小為以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um0.5-1um，具有很高，具有很高的密度（約的密度（約1.3mg/ml1.3mg/ml），無定形，呈非水溶性，只），無定形，呈非水溶性，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。NMRNMR等新技術(shù)的應(yīng)等新技術(shù)的應(yīng)用表明包涵體具有一定量的二級結(jié)構(gòu)，他們可

49、能在用表明包涵體具有一定量的二級結(jié)構(gòu)，他們可能在復(fù)性的啟動(dòng)階段中具有一定的作用。復(fù)性的啟動(dòng)階段中具有一定的作用。v2 2包涵體的形成：包涵體的形成： 主要因?yàn)樵谥亟M蛋白的表達(dá)過程中缺主要因?yàn)樵谥亟M蛋白的表達(dá)過程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，或環(huán)境不乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，或環(huán)境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的。適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的。v 2.12.1、基因工程菌的表達(dá)產(chǎn)率過高，超、基因工程菌的表達(dá)產(chǎn)率過高，超過了細(xì)菌正常的代謝水平，由于細(xì)菌的過了細(xì)菌正常的代謝水平，由于細(xì)菌的因子的蛋白水解能力達(dá)到飽和，使之表達(dá)因子的蛋白水解能力達(dá)到飽和，使之表達(dá)產(chǎn)物積累起來。研究發(fā)現(xiàn)

50、在低表達(dá)時(shí)很少產(chǎn)物積累起來。研究發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體，表達(dá)量越高越容易形成包涵形成包涵體，表達(dá)量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒體。原因可能是合成速度太快，以至于沒有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確的配對，過多的蛋白間的非特異性結(jié)合，的配對，過多的蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度等。蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度等。v2.22.2、重組蛋白的氨基酸組成：一般說含硫、重組蛋白的氨基酸組成：一般說含硫氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關(guān)。含量明顯與包涵體

51、的形成呈正相關(guān)。v2.32.3、重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或、重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)胞內(nèi)pHpH接近蛋白的等電點(diǎn)時(shí)容易形成包涵接近蛋白的等電點(diǎn)時(shí)容易形成包涵體。體。v2.42.4、重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由、重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類和于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類和輔助因子，如折疊酶和分子伴侶等，致使輔助因子，如折疊酶和分子伴侶等，致使中間體中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。大量積累，容易形成包涵體沉淀。v2.52.5、蛋白質(zhì)在合成之后，于中性、蛋白質(zhì)在合成之后，于中性pHpH或接近或接近中性中性pHpH的環(huán)境下，其本身固

52、有的溶解度對的環(huán)境下，其本身固有的溶解度對于包涵體的形成比較關(guān)鍵，即是說，有的于包涵體的形成比較關(guān)鍵，即是說，有的表達(dá)產(chǎn)率很高，如表達(dá)產(chǎn)率很高，如AspartaseAspartase和和Cyanase,Cyanase,表表達(dá)產(chǎn)率達(dá)菌體蛋白的達(dá)產(chǎn)率達(dá)菌體蛋白的30%,30%,也不形成包涵體，也不形成包涵體，而以可溶形式出現(xiàn)。而以可溶形式出現(xiàn)。v2.62.6、在細(xì)菌分泌的某個(gè)階段，蛋白質(zhì)分子、在細(xì)菌分泌的某個(gè)階段，蛋白質(zhì)分子間的離子鍵、疏水鍵或共價(jià)鍵等化學(xué)作用間的離子鍵、疏水鍵或共價(jià)鍵等化學(xué)作用導(dǎo)致了包涵體的形成。導(dǎo)致了包涵體的形成。二二. .包涵體的分離和溶解包涵體的分離和溶解v1基因工程菌發(fā)酵

53、液，經(jīng)離心濃縮后，可用：機(jī)械基因工程菌發(fā)酵液，經(jīng)離心濃縮后，可用：機(jī)械破碎、超聲破碎：單純超聲破碎，在小規(guī)模下且破碎、超聲破碎：單純超聲破碎，在小規(guī)模下且菌量較少的情況下效果較好，由于能量傳遞和局菌量較少的情況下效果較好，由于能量傳遞和局部產(chǎn)熱等原因，很難用于大體積細(xì)胞懸液的破碎，部產(chǎn)熱等原因，很難用于大體積細(xì)胞懸液的破碎，這樣部分未破碎細(xì)胞與包涵體混在一起，給后期這樣部分未破碎細(xì)胞與包涵體混在一起，給后期純化帶來困難。因此，在較大規(guī)模純化時(shí)先用溶純化帶來困難。因此，在較大規(guī)模純化時(shí)先用溶菌酶破碎細(xì)菌的細(xì)胞膜，再結(jié)合超聲破碎方法，菌酶破碎細(xì)菌的細(xì)胞膜，再結(jié)合超聲破碎方法，可顯著提高包涵體的純度

54、和回收率。以及化學(xué)方可顯著提高包涵體的純度和回收率。以及化學(xué)方法破碎使細(xì)菌裂解法破碎使細(xì)菌裂解, ,然后以然后以5000-20000g 15min5000-20000g 15min離離心，可使大多數(shù)包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離。心，可使大多數(shù)包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離。 v2 2洗滌：為了除去包涵體上粘附的雜質(zhì)，如洗滌：為了除去包涵體上粘附的雜質(zhì)，如膜蛋白或核酸，應(yīng)用洗滌液洗滌包涵體，膜蛋白或核酸，應(yīng)用洗滌液洗滌包涵體，通常用低濃度的變性劑通常用低濃度的變性劑, ,過高濃度的尿素或過高濃度的尿素或鹽酸胍會(huì)使包涵體溶解，如鹽酸胍會(huì)使包涵體溶解，如2M2M尿素在尿素在50mM 50mM Tris

55、 pH7.0-8.5Tris pH7.0-8.5左右左右,1mM EDTA,1mM EDTA中洗滌。此中洗滌。此外可以用溫和去垢劑外可以用溫和去垢劑TritonX-100TritonX-100洗滌去除洗滌去除膜碎片和膜蛋白。膜碎片和膜蛋白。v3 3溶解：一般用強(qiáng)的變性劑如尿素（溶解：一般用強(qiáng)的變性劑如尿素（6-8M6-8M）、）、鹽酸胍（鹽酸胍（GdnHCl 6MGdnHCl 6M），通過離子間的相互作），通過離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種用，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽伸展，一般來講，鹽酸胍優(yōu)于化學(xué)鍵，使多肽伸展，一般來講，鹽酸胍優(yōu)于尿素，因?yàn)辂}

56、酸胍是較尿素強(qiáng)的變性劑，它能尿素，因?yàn)辂}酸胍是較尿素強(qiáng)的變性劑，它能使尿素不能溶解的包涵體溶解，而且尿素分解使尿素不能溶解的包涵體溶解，而且尿素分解的異氰酸鹽能導(dǎo)致多肽鏈的自由氨基甲?；?，的異氰酸鹽能導(dǎo)致多肽鏈的自由氨基甲?；貏e是在堿性特別是在堿性pHpH值下長期保溫時(shí)。或用去垢劑，值下長期保溫時(shí)?；蛴萌ス竸?，如如SDSSDS、正十六烷基三甲基銨氯化物、正十六烷基三甲基銨氯化物、SarkosylSarkosyl等，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，也可等，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，也可溶解一些包涵體蛋白質(zhì)。溶解一些包涵體蛋白質(zhì)。Kandula SunthaKandula Suntha等等人用人用Tri

57、tonX-100TritonX-100來溶解來溶解Zymononas mobilis Zymononas mobilis levansucraselevansucrase包涵體蛋白。包涵體蛋白。 v另外，對于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，分離的包涵另外，對于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵。還需加入還原劑，如巰基乙醇、二活性二硫鍵。還需加入還原劑，如巰基乙醇、二硫基蘇糖醇（硫基蘇糖醇（DTTDTT）、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸。）、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸。還原劑的使用濃度一般是還原劑的使用濃度一般是50-100m

58、M 2-BME50-100mM 2-BME或或DTTDTT，也有文獻(xiàn)使用也有文獻(xiàn)使用5mM5mM濃度。在較粗放的條件下，可以濃度。在較粗放的條件下，可以使用使用5ml/l5ml/l的濃度。還原劑的使用濃度與蛋白二硫的濃度。還原劑的使用濃度與蛋白二硫鍵的數(shù)目無關(guān)，而有些沒有二硫鍵的蛋白加不加鍵的數(shù)目無關(guān)，而有些沒有二硫鍵的蛋白加不加還原劑無影響，如牛生長激素包涵體的增溶。對還原劑無影響，如牛生長激素包涵體的增溶。對于目標(biāo)蛋白沒有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時(shí)于目標(biāo)蛋白沒有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時(shí)還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵

59、體的溶解。雜蛋白影響了包涵體的溶解。 三三. .包含體蛋白復(fù)性方法包含體蛋白復(fù)性方法v1 1包涵體蛋白復(fù)性方法包涵體蛋白復(fù)性方法 1.1 1.1 稀釋復(fù)性和透析復(fù)性：直接加入水或緩稀釋復(fù)性和透析復(fù)性：直接加入水或緩沖液，放置過夜，缺點(diǎn)是體積增加較大，沖液，放置過夜，缺點(diǎn)是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制。目前稀變性劑稀釋速度太快，不易控制。目前稀釋法主要有一次稀釋、分段稀釋和連續(xù)稀釋法主要有一次稀釋、分段稀釋和連續(xù)稀釋三種方式。釋三種方式。 透析復(fù)性：好處是不增加體積，通過逐漸透析復(fù)性：好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，

60、有人稱易形成無活性蛋白質(zhì)聚體，且不適有人稱易形成無活性蛋白質(zhì)聚體，且不適合大規(guī)模操作，無法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模。合大規(guī)模操作，無法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模。v1.2 1.2 含二硫鍵的蛋白的復(fù)性含二硫鍵的蛋白的復(fù)性v1.31.3封閉蛋白的疏水蔟促進(jìn)復(fù)性封閉蛋白的疏水蔟促進(jìn)復(fù)性v1.41.4凝膠過濾層析復(fù)性凝膠過濾層析復(fù)性v1.5 1.5 小分子添加劑促進(jìn)的復(fù)性小分子添加劑促進(jìn)的復(fù)性v1.61.6分子伴侶或折疊酶促進(jìn)的復(fù)性分子伴侶或折疊酶促進(jìn)的復(fù)性v1.71.7人工分子伴侶的復(fù)性人工分子伴侶的復(fù)性v2 2包涵體蛋白復(fù)性效率包涵體蛋白復(fù)性效率v復(fù)性是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，除與蛋白質(zhì)復(fù)性的復(fù)性是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，除