非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識(全文)

1、世界衛(wèi)生組織下屬的國際癌癥研究機構（IARC）于2013年12月12日非小細胞肺癌血液 EGFR 基因突變檢測中國專家共識(最全版)近年來，表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growthfactor receptor -yros ine kin asein hibitors, EGFR -TKIs)等靶向藥物已經成為晚期非小細胞肺癌 (NSCLC) 重要的治療方式之一。在 EGFR 基因突 變的晚期NSCLC患者，系列國際國內多中心臨床研究已證實EGFR靶向治療能顯著降低疾病進展或死亡風險、改善患者生活質量。而在EGFR 基因未發(fā)生突變的肺癌患者中，臨床研究證據(jù)提示不宜使

2、用靶向藥物。這些 臨床研究和系統(tǒng)分析均指出 EGFR 基因突變檢測是晚期肺癌患者使用 EGFRTKIs治療的先決條件。鑒于多種原因，臨床實踐中EGFR基因突變的肺癌組織受檢率并不高， 導致基于驅動基因變異靶點的個體化治療策略難以實施。多項回顧性和前 瞻性研究表明， 當腫瘤組織難以獲取時， 血液循環(huán)游離或腫瘤 DNA(cf/ctDNA) 檢測是突變分析合適的替代選擇。中國國家食品藥品監(jiān)督管理總局 (CFDA) 在 2015 年 2 月已批準吉非替 尼說明書更新，在推薦所有 NSCLC患者的腫瘤組織都應進行 EGFR基因 突變檢測基礎上，如果腫瘤標本不可評估，則可使用從血液(血漿 )標本中獲得的

3、ctDNA 進行評估。目前我國尚無規(guī)范化的血液 EGFR 基因突變基因檢測的標準或指南。 因此，為了規(guī)范中國肺癌患者血液 EGFR 基因突變的檢測，特組織全國肺 癌和病理學領域的知名專家共同制定本專家共識。一、肺癌的流行病學公布了 2012 年全球癌癥流行病學最新數(shù)據(jù) （GLOBOCAN 2012） ：肺癌是 世界范圍內發(fā)病率 （新發(fā)肺癌患者 182 萬，占所有新發(fā)腫瘤病例的 13%） 和死亡率 （死亡肺癌患者 160 萬，占所有死亡腫瘤病例的 19.4%） 最高的惡 性腫瘤 1。在中國，肺癌的發(fā)病率和死亡率均位居所有惡性腫瘤的首位。2012 年中國新發(fā)肺癌患者約 65.3 萬，死亡患者約 5

4、9.7 萬2。根據(jù)肺癌生物學特征，NSCLC占所有肺癌的80%85%，肺腺癌的發(fā)病率已超過 肺鱗癌 3。二、EGFR 基因突變和 EGFR 靶向治療EGFR 是一種跨膜酪氨酸激酶受體，該受體激酶域的激活對癌細胞增殖、生長的相關信號傳遞具有重要意義。EGFR基因兩種主要的突變?yōu)?9外顯子缺失 （約占 45%）和 21 外顯子 L858R 突變（約占 40%） 3,4，二者均 可導致酪氨酸激酶結構域活化，且均為EGFRKIs的敏感性突變。肺腺癌患者EGFR基因敏感突變陽性率在高加索人群約為10% ,在亞裔人群和我國均為 50%左右5。在過去十多年間，EGFR訐KIs已逐漸成為 EGFR基因突變的晚

5、期NSCLC患者的一線標準治療。具有里程碑意義的隨機、對照、大樣本川期 IPASS 臨床試驗首次顯示吉非替尼一線治療 EGFR 基因突變晚期NSCLC 患者的無進展生存時間、腫瘤緩解率和生活質量均優(yōu)于標準化療，并且具有良好的安全性5 o隨后，基于EGFR基因突變陽性患者進行的前瞻性川期臨床試驗（NEJ002、WJOG3405、OPTIMAL、EURTAC 及 LUX -Lung3 /LUX -Lung6），通過與標準化療比較，充分驗證了 EGFR基因突變是一線EGFR-TKIs治療的重要靶點和關鍵性預測標志物3,5。另一方面，CTONG0806等臨床研究和薈萃分析顯示，在EGFR基因未發(fā)生突變

6、 的肺癌患者，因不能降低疾病進展或死亡風險，不宜使用EGFR靶向治療6,7。因此，以組織和細胞學標本進行 EGFR 基因突變檢測用于指導 NSCLC患者EGFR-TKIs治療已在全球形成共識，成為標準的臨床實踐4。三、EGFR基因突變組織檢測的指南推薦美國國立綜合癌癥網絡 (NCCN) 指南建議： 腺癌、 大細胞癌及組織學類 型無法確定等 NSCLC 應進行 EGFR 基因突變檢測；非吸煙、小活檢標本 或混合型組織學類型的鱗癌患者也可考慮進行EGFR基因突變檢測；可采用多種方法進行檢測 3。歐洲臨床腫瘤協(xié)會 (ESMO) 指南建議：晚期非鱗癌的 NSCLC 患者應進 行EGFR突變檢測；除了從

7、不吸煙或者很少吸煙 (每年15包)的鱗癌患者 外，已確診鱗癌患者不推薦進行 EGFR基因突變檢測8 o美國臨床腫瘤學會(ASCO)于2014年簽署了一項美國病理學家聯(lián)合學 會(CAP)/國際肺癌研究協(xié)會(IASLC)/分子病理學協(xié)會(AMP)關于肺癌患者 選擇治療靶點分子檢測的臨床實踐指南，該指南明確指出：所有肺腺癌或 者混合腺癌成分的肺癌患者，不考慮性別、種族和吸煙情況的特征，均應 進行 EGFR 基因突變檢測 9o我國NSCLC患者EGFR基因突變檢測專家共識指出： 所有NSCLC患 者，不限組織學類型， 只要條件許可， 均應嘗試進行基于腫瘤組織的 EGFR 基因突變檢測 10o四、EGF

8、R 基因突變組織檢測現(xiàn)狀來自腫瘤部位的手術組織、活檢組織以及細胞學標本，新鮮或甲醛固定石蠟包埋等處理的組織或細胞學標本，均可用于EGFR基因突變檢測。臨床取材方法主要包括纖維支氣管鏡下活檢、經皮肺穿刺活檢、胸水、手 術、胸腔鏡、淋巴結穿刺活檢、 支氣管內超聲引導細針穿刺活檢 (EBUS FNA) 等3,8,9,10 o2015年歐洲肺癌大會(ELCC)上公布了一項全球10個國家562位腫瘤 專家參與的關于晚期 NSCLC 患者 EGFR 基因突變檢測和治療策略選擇的 調查研究結果：19%的晚期NSCLC患者未進行EGFR基因突變檢測，即 使進行檢測，仍有 26% 的歐洲患者在結果出來前就開始接

9、受治療 11。未 進行檢測最常見的主要原因是病理組織學類型的限制(如鱗癌)；其次是缺乏足夠的腫瘤組織。檢測周期過長亦是未行EGFR基因突變的另一原因。在部分檢測中心， 檢測周期甚至可達數(shù)周 11。此外，部分患者腫瘤內 EGFR 基因突變的異質性使基于基因檢測的靶向治療決策變得更加困難12。我國的 EGFR 基因突變檢測在肺癌患者中的受檢率相對偏低， Xue 等 13報道2012年我國肺癌EGFR基因突變受檢率為 20%30%，明顯低 于發(fā)達國家或地區(qū)的水平14。如何在我國提高 EGFR等基因變異受檢率 是提升我國肺癌精準診治的關鍵因素之一。我國的肺癌EGFR基因突變受檢率低也是與臨床組織獲取受

10、限、 經濟原因、 醫(yī)師與患者的精準診治意識、 藥物昂貴及獲得不易等多因素相關。針對臨床實踐中腫瘤組織檢測的種種局限，探尋作為其補充或替代的 其他生物標本進行 EGFR 基因突變檢測具有重要臨床意義，有助于提高臨 床患者的總體EGFR基因受檢率五、EGFR 基因突變的血液檢測研究顯示，大部分 (并非全部 )晚期 NSCLC 患者的血液中存在循環(huán)游離DNA(cfDNA, cell free DNA) 15,16,17o cfDNA 主要來源于凋亡或壞死 的細胞，包括正常細胞和腫瘤細胞，如果來自腫瘤細胞稱為循環(huán)腫瘤 DNA(ctDNA)。但血液游離 DNA片段通常較短，在晚期癌癥患者血液中 濃度極低

11、，平均約為17/L 18,19 o既往系列研究已經在 NSCLC 患者的血漿或血清樣本 ctDNA 中發(fā)現(xiàn) EGFR基因突變，初步顯示外周血 ctDNA EGFR基因突變檢測及對 EGFR TKIs療效預測的可行性16,20,21o IPASS研究通過擴增阻滯突變系統(tǒng) (amplification refractory mutation system, ARMS)方法檢測日本亞組人群血清游離 DNA 的 EGFR 基因突變狀況與臨床療效的研究數(shù)據(jù)顯示， 血清游離 DNA EGFR 基因突變陽性患者接受吉非替尼治療較標準化療患 者疾病無進展生存期(PFS)顯著延長15o IFUM研究也提供了在高

12、加索人 群中基于血漿游離 DNA檢測(ARMS檢測)發(fā)現(xiàn)的EGFR基因突變陽性患 者接受吉非替尼治療 NSCLC 的療效證據(jù)， 在腫瘤組織陽性 (此組包括血漿 陽性與陰性患者 )、腫瘤組織和血漿標本均陽性及腫瘤組織陽性而血漿標本 陰性三組中，其客觀緩解率分別為 70%、76.9%和59.5% 22。在FASTACT -U研究中，血漿EGFR基因突變患者接受厄洛替尼與化療聯(lián)合治療的客 觀緩解率 (74.6% 與 19.7%) 和無進展生存期均優(yōu)于單獨化療組 23。而 230 例中國晚期 NSCLC 組織與血漿游離 DNA 配對分析等研究同樣顯示血液 標本 EGFR 基因突變對于預測靶向藥物治療的

13、臨床獲益與組織突變者高度致20與腫瘤組織相比，ctDNA 中EGFR基因突變檢測具有高度特異性（IPASS、IFUM和IGNITE研究中的特異度分別為 100% >99.8%和97.2%）， 但敏感度相對較低（分別為43.1%、65.7%和49.6%）;這可能與腫瘤分期、 血液標本的處理、檢測方法差異等相關12,15,22,24。這些特定技術下的血液EGFR基因突變檢測的低敏感度提示在臨床實踐中應高度關注單一血 液檢測結果的假陰性情況。歐洲藥品管理局2014年9月已批準當難以獲取腫瘤組織樣本時，可 采用外周血ctDNA作為補充標本評估 EGFR基因突變狀態(tài)，以明確最可 能從吉非替尼治療中

14、受益的 NSCLC患者25oCFDA在2015年2月已批 準吉非替尼說明書進行更新，在推薦所有NSCLC患者的腫瘤組織都應進行EGFR基因突變檢測基礎上，補充了如果腫瘤標本不可評估，則可使用 從血液（血漿）標本中獲得的ctDNA進行評估，以盡最大可能明確最可能從 吉非替尼治療中受益的 NSCLC患者。1 .血液EGFR基因突變檢測的標本采集及處理：全血中血漿和血清均能分離出 ctDNA，但通過和相匹配的血清樣本比 較，血漿中ctDNA有更高的檢出率26。血漿cfDNA通常片段較短，且 在血液中濃度非常低27,28o抽血后延遲血漿分離會導致血細胞裂解，釋放出基因組DNA（gDNA）至血漿中；大量

15、增加的 gDNA 會稀釋腫瘤來源 的ctDNA，使得突變難以檢出29。因此在標本的采集、運輸及儲存過程 中，防止游離DNA的降解是首要考慮的因素；其次，也應防止血液中白 細胞的裂解，避免因野生型DNA背景的增加導致ctDNA中的EGFR基因 突變無法檢測為了采集到最佳血漿標本用于后續(xù)提取游離DNA進行EGFR基因突變檢測，建議使用如下兩種方法之一采集10 ml全血并進一步分離血漿：（1）用含有游離DNA保護劑及防細胞裂解保護劑的專用常溫采血管采集全血 后輕搖混勻，常溫（630 C）放置不超過57 d ;以足夠的離心力將全血 充分離心兩次，分離出不含細胞成分的血漿， 放置于-70 C凍存直至DN

16、A 抽提，或直接進入DNA抽提步驟。（2）用常規(guī)EDTA抗凝管（嚴禁使用肝 素抗凝管）采集全血后，兩小時內以足夠的離心力將全血充分低溫離心兩次 30,31，分離出不含細胞成分的血漿，放置于-70 C凍存直至DNA抽提， 或直接進入DNA抽提步驟?？紤]到臨床實踐的方便性，建議盡量采用第一種方案采集 10 ml全血。 血漿分離過程中應注意避免吸入白細胞。2 .血液EGFR基因突變檢測的外周血游離 DNA提取：因ctDNA含量低，為提高EGFR基因突變檢出率，在臨床允許的情況 下增加血漿用量，建議使用 10 ml全血分離出的血漿（45 ml）。外周血 游離DNA的提取有很多方法，建議采用國家藥監(jiān)部門

17、批準的、大容量血 漿游離DNA分離試劑盒。3 .血液EGFR基因突變檢測的方法：為了最小化獲得假陰性結果的可能性，推薦使用高敏感度的檢測方法用于ctDNA 樣本的EGFR基因突變檢測32。目前，檢測基因突變最常用的方法是擴增阻遏突變系統(tǒng)（ARMS法），歐盟批準用于指導吉非替尼治療的血液檢測方法也是ARMS檢測方法12,15,18。檢測必須在具有資質的檢測中心進行。檢測方法必須進行嚴 格的驗證及質控。檢測試劑須使用經 CFDA 批準的檢測試劑盒。本共識專家組也推薦 EGFR 基因突變檢測應在具有資質的檢測中心進 行，檢測方法必須進行嚴格的驗證及質控，檢測試劑須使用經 CFDA 批準 的檢測試劑盒

18、。六、EGFR 基因突變檢測報告及周期基因突變檢測的報告內容應包括檢測結果 (建議包括明確的病理診斷 及專業(yè)的書寫 )及對結果的詮釋， 且能夠被腫瘤科醫(yī)師或其他非病理專業(yè)的 醫(yī)師理解。其他內容應涵蓋患者及標本基本信息、 DNA 質量、檢測方法、 檢測試劑及儀器、相關臨床意義以及在檢測過程中出現(xiàn)的狀況及不確定結 果和因素，以供臨床醫(yī)師全面參考。檢測報告模板見附件 1 。所有專業(yè)化 EGFR 基因突變分子檢測實驗室，通過建立高效率的分子 檢測平臺，優(yōu)化流程，從接收標本到發(fā)出報告周期，建議不超過 35 個 工作日，以及時滿足臨床的需求。七、血液 EGFR 基因突變檢測發(fā)展與展望如前所述，血液檢測EG

19、FR基因突變用于篩選 EGFRTKIs適治患者是 對組織檢測的重要補充。血液檢測還可以動態(tài)監(jiān)測靶向治療過程中腫瘤標 志物變化，特別是可用于發(fā)現(xiàn)新出現(xiàn)的耐藥相關基因變異32。血液檢測用于診斷晚期 NSCLC 有望實現(xiàn)， 但診斷早期 NSCLC 有待檢 測技術不斷的發(fā)展和進步。已有很多血液EGFR基因突變檢測的方法的報道，如高分辨熔點曲線分析法 (HRM) 、變性高效液相色譜技術 (DHPLC) 、 突變擴增阻滯系統(tǒng) (ARMS) 法、二代測序、 數(shù)字 PCR 方法等 17,32,33,34。不同血漿游離核酸 EGFR 基因突變檢測方法各有優(yōu)勢和劣勢，但目前成熟且最常用的檢測血液 EGFR 基因突

20、變的方法是 ARMS 法，相較腫瘤組織 EGFR基因突變檢測，該方法檢測血漿EGFR敏感型基因突變的敏感度在65%75%，特異度在 98%100% 12,15,18。數(shù)字PCR在血漿EGFR 基因突變檢測上具有較高的靈敏度和特異度 35,36，但目前報道的該方法 檢測 EGFR 基因突變位點相對有限 (19 外顯子缺失， 21 號外顯子 L858R 突變以及 20 號外顯子 T790M 突變)，仍處在摸索、累積經驗階段；其對 操作人員和環(huán)境均有較高的要求，未來應用于臨床尚需大規(guī)模臨床數(shù)據(jù)驗 證。以二代測序技術(NGS)為代表的新技術拓展了基因突變檢測的深度和 廣度37,38，但其臨床轉化應用需

21、要更多的數(shù)據(jù)積累。未來，期待通過多元化基因檢測平臺及技術的不斷發(fā)展與成熟，血液 驅動基因突變檢測可實現(xiàn)從定性到定量檢測、從靜態(tài)至動態(tài)檢測、從單基 因到多基因、基因組 /外顯子組檢測的轉變，從而推動 NSCLC 精準靶向治 療的不斷進步。八、總結當腫瘤組織難以獲取時，血液是 EGFR 基因突變檢測合適的替代生物 材料，也是對可疑組織檢測結果的補充；血液EGFR基因突變檢測可用于對肺癌分子分型、療效預測和疾病監(jiān)測；目前成熟且最常用的血液EGFR基因突變檢測方法是 ARMS 法；但是當腫瘤組織可以獲取時， 腫瘤組織仍 應是優(yōu)先選擇的生物樣本用于基因狀態(tài)分析。隨著檢測技術的不斷發(fā)展， 期望在保證現(xiàn)有的檢測特異性和預測準確性的基礎上，不斷提高血液EGFR 基EGFR 基因突變檢測的靈敏度，有助于整體上提高我國肺癌患者廣東省醫(yī)學科學院、廣東省肺癌研究所）；周彩存（同濟大學附屬上海市肺圖1非小細胞肺癌患者EGFR基因突變檢測流程本共識制訂專家組成員本共識制訂專家組成員（按姓名漢語拼音字母順序排序）：程穎（吉林省 腫瘤醫(yī)院腫瘤內科）；韓寶惠（上海交通大學附屬胸科醫(yī)院肺內科 ）；黃誠（福 建省腫瘤醫(yī)