課件十二酶的提純和分離純化的方法(二)

1、模塊三、酶的分離純化模塊三、酶的分離純化酶制劑生產(chǎn)技術(shù)酶制劑生產(chǎn)技術(shù)生物化工學(xué)院生物化工學(xué)院 楊芳楊芳引入引入 是指將酶從細(xì)胞或培養(yǎng)基中取出，再與雜質(zhì)分開，而是指將酶從細(xì)胞或培養(yǎng)基中取出，再與雜質(zhì)分開，而獲得與使用目的相適應(yīng)的有一定純度的酶產(chǎn)品的過程。獲得與使用目的相適應(yīng)的有一定純度的酶產(chǎn)品的過程。學(xué)習(xí)情境十二學(xué)習(xí)情境十二 酶的提取與純化酶的提取與純化工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法沉淀分離沉淀分離離心分離離心分離過濾與膜分離過濾與膜分離層析分離層析分離電泳分離電泳分離萃取分離萃取分離工作任務(wù)（二）工作任務(wù)（二） 酶的分離純化方法酶的分離純化方法初步純化（初步純化（

2、rough fractionationrough fractionation） （提取）：除去與目的產(chǎn)物性質(zhì)差異（提?。撼ヅc目的產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì)。很大的雜質(zhì)。使用各種柱層析法。使用各種柱層析法。高度純化（高度純化（fine fractionationfine fractionation） （精制）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜（精制）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。質(zhì)。可用制備式電泳或可用制備式電泳或HPLCHPLC。 層析分離層析分離 層析法也稱色譜法，是層析法也稱色譜法，是19031903年俄國(guó)植物學(xué)家年俄國(guó)植物學(xué)家Michael TswettMichael Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。將植

3、物色素發(fā)現(xiàn)并命名的。將植物色素溶液通過裝有溶液通過裝有CaCOCaCO3 3 吸附劑的柱子，然后用吸附劑的柱子，然后用石油醚淋洗，各種色素以不同的速率流動(dòng)后石油醚淋洗，各種色素以不同的速率流動(dòng)后形成不同的色帶而被分開。形成不同的色帶而被分開。工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法色譜起源色譜起源色譜色譜組分色素石油醚石油醚碳酸鈣顆粒 用色彩（用色彩（chromachroma）和圖譜（）和圖譜（graphsgraphs）組）組成色譜一詞（成色譜一詞（Chromatography) Chromatography) 。工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法

4、 原理原理 利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在流動(dòng)相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移動(dòng)流動(dòng)相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移動(dòng)而達(dá)到分離的目的。而達(dá)到分離的目的。：攜帶樣品流過整個(gè)系統(tǒng)的流體：攜帶樣品流過整個(gè)系統(tǒng)的流體：靜止不動(dòng)的一相：靜止不動(dòng)的一相 層析中兩相為流動(dòng)相和固定相，當(dāng)流動(dòng)相流經(jīng)固定相時(shí)，層析中兩相為流動(dòng)相和固定相，當(dāng)流動(dòng)相流經(jīng)固定相時(shí)，各組分的移動(dòng)速度不同，從而使不同的組分分離純化各組分的移動(dòng)速度

5、不同，從而使不同的組分分離純化 。層析分離層析分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法 分類分類 按流動(dòng)相分類，有液相層析和氣相層析；按流動(dòng)相分類，有液相層析和氣相層析； 按固定相的形式分類，有柱層析、薄層層析等按固定相的形式分類，有柱層析、薄層層析等 按分離過程物理化學(xué)原理：分配、吸附。按分離過程物理化學(xué)原理：分配、吸附。層析分離層析分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法 流動(dòng)相有兩種狀態(tài)：流動(dòng)相有兩種狀態(tài)： * *液體作為流動(dòng)相液體作為流動(dòng)相 * *氣體作為流動(dòng)相氣體作為流動(dòng)相 固定相也有兩種狀態(tài)：固定相也有兩種狀態(tài)： * *固體吸附劑作為

6、固定相固體吸附劑作為固定相 * *以吸附在固體上的液體作為固定相以吸附在固體上的液體作為固定相 按兩相所處的狀態(tài)分類：按兩相所處的狀態(tài)分類： 液相層析液相層析 液液- -固層析固層析 液液- -液層析液層析 氣相層析氣相層析 氣氣- -固層析固層析 氣氣- -液層析液層析層析分離層析分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法 按層析過程的機(jī)理分類：按層析過程的機(jī)理分類：吸附層析吸附層析：利用吸附劑表面對(duì)不同組分吸附性能的差異。：利用吸附劑表面對(duì)不同組分吸附性能的差異。分配層析分配層析：利用不同組分在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)：利用不同組分在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)的

7、不同。的不同。離子交換層析離子交換層析：利用不同組分對(duì)離子交換劑親和力的不同。：利用不同組分對(duì)離子交換劑親和力的不同。凝膠層析凝膠層析：利用某些凝膠對(duì)于不同分子大小的組分阻滯作用：利用某些凝膠對(duì)于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。的不同。層析分離層析分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法 按操作形式不同分類：按操作形式不同分類：柱層析柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個(gè)方向移動(dòng)而達(dá)到分：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個(gè)方向移動(dòng)而達(dá)到分離。離。紙層析紙層析：用濾紙做液體的載體，點(diǎn)樣后，用流動(dòng)相展開，以達(dá)：用濾紙做液體的載體，點(diǎn)樣后，用流動(dòng)相展開，以達(dá)到分離鑒定的目的。到

8、分離鑒定的目的。薄層層析薄層層析：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離和鑒定。法進(jìn)行物質(zhì)的分離和鑒定。層析分離層析分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法吸附層析吸附層析（adsorption chromatographyadsorption chromatography） 利用固定相的固體吸附劑表面對(duì)不同組分吸附力的大利用固定相的固體吸附劑表面對(duì)不同組分吸附力的大小及洗脫液對(duì)它小及洗脫液對(duì)它的溶解作用（解的溶解作用（解吸作用）的差異吸作用）的差異進(jìn)行分離。進(jìn)行分離。吸吸附附層層析析層析分離層析分離工

9、作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法吸吸附附層層析析工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法吸吸附附層層析析層析分離層析分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法 吸附作用的強(qiáng)弱主要與吸附劑和被吸附物質(zhì)的性吸附作用的強(qiáng)弱主要與吸附劑和被吸附物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)。質(zhì)有關(guān)。 吸附層析的關(guān)鍵是吸附劑和洗脫劑的選擇。吸附層析的關(guān)鍵是吸附劑和洗脫劑的選擇。吸吸附附層層析析層析分離層析分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法吸附劑吸附劑 吸附劑通過范德華力、靜電引力、疏水作用吸附劑通過范德華力、靜電引力、疏水作用等與待分離物

10、質(zhì)的極性官能團(tuán)作用。等與待分離物質(zhì)的極性官能團(tuán)作用。吸附劑的選擇：吸附劑的選擇： 根據(jù)吸附能力強(qiáng)弱分為：根據(jù)吸附能力強(qiáng)弱分為： 弱吸附劑：蔗糖、淀粉弱吸附劑：蔗糖、淀粉 中等吸附劑：碳酸鈣、磷酸鈣、硅膠等中等吸附劑：碳酸鈣、磷酸鈣、硅膠等 強(qiáng)吸附劑：氧化鋁、活性炭強(qiáng)吸附劑：氧化鋁、活性炭吸吸附附層層析析層析分離層析分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法 吸附劑的性質(zhì)：吸附劑的性質(zhì)： 活性炭：活性炭：常用的吸附介質(zhì)。常用的吸附介質(zhì)。 硅膠：硅膠：常用的極性吸附介質(zhì)。常用的極性吸附介質(zhì)。 羥基磷灰石羥基磷灰石 （HAHA） Ca10(PO4)6.(OH)2Ca10(PO4

11、)6.(OH)2 : : 微晶型的磷酸鈣制品，表面有微晶型的磷酸鈣制品，表面有Ca2+Ca2+和和PO43-PO43-兩兩種帶電基團(tuán)；種帶電基團(tuán)； 吸附原理是溶質(zhì)分子中的酸性基團(tuán)與洗脫液吸附原理是溶質(zhì)分子中的酸性基團(tuán)與洗脫液中的磷酸根離子對(duì)中的磷酸根離子對(duì)HAHA 中的鈣離子有競(jìng)爭(zhēng)作用。中的鈣離子有競(jìng)爭(zhēng)作用。吸吸附附層層析析層析分離層析分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法 洗脫劑洗脫劑 要求：要求： 粘度小，純度高，穩(wěn)定性好，完全洗脫下所要粘度小，純度高，穩(wěn)定性好，完全洗脫下所要分離的成分分離的成分, ,易與目標(biāo)分子分離。易與目標(biāo)分子分離。 選擇：選擇： 具有較高洗

12、脫能力的洗脫劑作為流動(dòng)相。具有較高洗脫能力的洗脫劑作為流動(dòng)相。 生物大分子一般選擇中性鹽溶液為洗脫劑。生物大分子一般選擇中性鹽溶液為洗脫劑。吸吸附附層層析析層析分離層析分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法凝凝膠膠過過濾濾層層析析層析分離層析分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法凝凝膠膠過過濾濾層層析析 凝膠具有孔，大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆凝膠具有孔，大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動(dòng)，并最先被洗脫出來；粒之間的空隙向下移動(dòng)，并最先被洗脫出來； 小分子物質(zhì)可自由出入凝膠孔，流程長(zhǎng)而后流出層析柱。小分子物質(zhì)可自

13、由出入凝膠孔，流程長(zhǎng)而后流出層析柱。 當(dāng)混合溶液通過層析柱時(shí)，樣品中的各種分子按其分子當(dāng)混合溶液通過層析柱時(shí)，樣品中的各種分子按其分子大小不同而分離大小不同而分離. . 層析分離層析分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法凝凝膠膠過過濾濾層層析析工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法凝凝膠膠過過濾濾層層析析層析分離層析分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法凝膠的種類和性質(zhì)凝膠的種類和性質(zhì) 1)1)交聯(lián)葡聚糖凝膠（交聯(lián)葡聚糖凝膠（dextran gel)dextran gel) 商品名商品名:Sephadex :Sephad

14、ex 型號(hào)型號(hào) Sephadex GSephadex G1010至至G-200G-200 G G 后的數(shù)字為凝膠吸水值的后的數(shù)字為凝膠吸水值的1010倍。數(shù)字越大，交聯(lián)倍。數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，孔徑越大，分離范圍越廣。度越小，孔徑越大，分離范圍越廣。 2 2）瓊脂糖凝膠（）瓊脂糖凝膠（agarose gel)agarose gel) 商品名商品名:Sepharose :Sepharose （瑞典）（瑞典）; Bio-Gel A (; Bio-Gel A (美國(guó)）美國(guó)） 它是它是D D半乳糖和半乳糖和3 3，6 6脫水脫水L L半乳糖相間重復(fù)結(jié)合半乳糖相間重復(fù)結(jié)合而成的鏈狀化合物。依靠糖鏈之間的

15、次級(jí)鍵維持網(wǎng)狀結(jié)而成的鏈狀化合物。依靠糖鏈之間的次級(jí)鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。凝凝膠膠過過濾濾層層析析層析分離層析分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法凝膠的種類和性質(zhì)凝膠的種類和性質(zhì)3 3）聚丙烯酰胺凝膠）聚丙烯酰胺凝膠 （polyacrylamide gelpolyacrylamide gel） 商品名為商品名為Bio-Gel,Bio-Gel, 以丙烯酰胺為單體，以甲叉雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑以丙烯酰胺為單體，以甲叉雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑聚合成的高分子聚合物。聚合成的高分子聚合物。凝凝膠膠過過濾濾層層析析層析分離層析

16、分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法操作：操作：1 1）凝膠的選擇和處理）凝膠的選擇和處理 根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量范圍選擇相應(yīng)型號(hào)的凝膠介質(zhì)。根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量范圍選擇相應(yīng)型號(hào)的凝膠介質(zhì)。 將干膠懸浮于將干膠懸浮于510510倍的蒸餾水中倍的蒸餾水中 ，充分溶脹，抽氣，充分溶脹，抽氣，裝柱。裝柱。2 2）柱的選擇）柱的選擇 采用采用L/DL/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影響流速。比值高的柱子，可提高分辨率，但影響流速。凝凝膠膠過過濾濾層層析析層析分離層析分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法3 3）加樣：）加樣：體積不能過多，不超過床體積的體積

17、不能過多，不超過床體積的5 5，脫鹽，脫鹽時(shí)可在時(shí)可在1010左右。左右。4 4）洗脫）洗脫 洗脫液與平衡時(shí)用的洗脫液與平衡時(shí)用的bufferbuffer一致。一致。 洗速不可過快，保持恒速。洗速不可過快，保持恒速。5 5）膠的保存：）膠的保存：洗脫完畢后，凝膠柱已恢復(fù)到上柱前的洗脫完畢后，凝膠柱已恢復(fù)到上柱前的狀態(tài)，不必再生處理。狀態(tài)，不必再生處理。 用用0.02%Na0.02%Na3 3N N防腐。防腐。凝凝膠膠過過濾濾層層析析層析分離層析分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法離子交換層析（離子交換層析（ion exchange chromatographyion

18、 exchange chromatography，IECIEC） 是重要而廣泛應(yīng)用的層析方法。以離子交換劑為固定是重要而廣泛應(yīng)用的層析方法。以離子交換劑為固定相，液體為流動(dòng)相的系統(tǒng)中進(jìn)行的。相，液體為流動(dòng)相的系統(tǒng)中進(jìn)行的。根據(jù)待分離物質(zhì)帶電性質(zhì)不同的分離純化方法。根據(jù)待分離物質(zhì)帶電性質(zhì)不同的分離純化方法。離離子子交交換換層層析析層析分離層析分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法基本原理：是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離上的平衡離子進(jìn)行可逆交

19、換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。的一種層析方法。 離子交換劑在水中呈不溶解狀態(tài)，能釋放出反離子，同時(shí)與溶離子交換劑在水中呈不溶解狀態(tài)，能釋放出反離子，同時(shí)與溶液中的其它離子或離子化合物相互結(jié)合，結(jié)合后本身理化性質(zhì)液中的其它離子或離子化合物相互結(jié)合，結(jié)合后本身理化性質(zhì)保持不變。保持不變。離離子子交交換換層層析析層析分離層析分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法離子交換劑：離子交換劑： 離子交換劑由載體、電荷基團(tuán)和反離子構(gòu)成。離子交換劑由載體、電荷基團(tuán)和反離子構(gòu)成。 如羧甲基纖維素離子交換劑組成如羧甲基纖維素離子交換劑組成 纖維素纖維素O OCHCH2 2

20、COOCOO- -NaNa+ + 載體載體 電荷基團(tuán)電荷基團(tuán) 反離子反離子離離子子交交換換層層析析層析分離層析分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法 化學(xué)原料合成化學(xué)原料合成 ：樹脂類物質(zhì)：樹脂類物質(zhì) 載體載體 天然材料制成：天然材料制成： cellulose sephadex sepharosecellulose sephadex sepharose 陽離子交換劑陽離子交換劑: : 電荷基團(tuán)（）電荷基團(tuán)（）, , 反離子（）反離子（）電荷基團(tuán)電荷基團(tuán) 陰離子交換劑陰離子交換劑: : 電荷基團(tuán)（）電荷基團(tuán)（）, , 反離子（）反離子（） 如：如：DEAE-DEAE-纖

21、維素，纖維素， CM-SepharoseCM-Sepharose層析分離層析分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法l陰離子交換劑：陰離子交換劑：l常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-2-羥丙基羥丙基l DEAE DEAE C2H4N+(C2H5)2HC2H4N+(C2H5)2H QAE QAE C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3l陽離子交換劑：陽離子交換劑：l常用羧甲基常用羧甲基 CM CM CHCH2 2COOCOO l磺丙基磺丙基 SP SP C C3 3H H6 6SO

22、SO3 3離離子子交交換換層層析析層析分離層析分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法 離子交換劑的選擇離子交換劑的選擇 a. a. 強(qiáng)、弱離子交換劑的選擇：強(qiáng)、弱離子交換劑的選擇： 強(qiáng)型：適用的強(qiáng)型：適用的pHpH范圍廣，制備無離子水范圍廣，制備無離子水 弱型：適用的弱型：適用的pHpH范圍窄，分離生物大分子物質(zhì)范圍窄，分離生物大分子物質(zhì) b. b. 陰、陽離子交換劑的選擇：陰、陽離子交換劑的選擇：酶的穩(wěn)定性酶的穩(wěn)定性 若若pIpIpI穩(wěn)定，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，用陰離子交換劑穩(wěn)定，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，用陰離子交換劑離離子子交交換換層層析析層析分離層析分離工作任務(wù)（二）酶的分離

23、純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法 離子交換層析同樣可以用于蛋白質(zhì)的分離純化。由于蛋白離子交換層析同樣可以用于蛋白質(zhì)的分離純化。由于蛋白質(zhì)也有等電點(diǎn)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的質(zhì)也有等電點(diǎn)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pHpH條件下，其帶電狀條件下，其帶電狀況也不同。況也不同。 陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，所以這類蛋白陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，所以這類蛋白質(zhì)被留在柱子上，然后通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，質(zhì)被留在柱子上，然后通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質(zhì)洗脫下來。結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首將吸附在柱子上的蛋白質(zhì)洗脫下來。結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。反之陽離子交換基

24、質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋先被洗脫下來。反之陽離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì)，結(jié)合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或白質(zhì)，結(jié)合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的是提高洗脫液的pHpH值洗脫下來。值洗脫下來。 陰離子交換劑陰離子交換劑: 電荷基團(tuán)（）電荷基團(tuán)（）, 反離子（）反離子（）層析分離層析分離陰離子交換劑分離蛋白質(zhì)陰離子交換劑分離蛋白質(zhì)的的過程過程+平衡平衡吸附吸附去吸附去吸附分離結(jié)束分離結(jié)束再生再生低鹽低鹽高鹽高鹽利用不同利用不同鹽濃度將鹽濃度將不同蛋白不同蛋白質(zhì)質(zhì)洗洗脫下脫下來來Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl

25、-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法操作操作 平衡平衡 上樣上樣 平衡平衡 洗脫洗脫 再生再生1 1）上樣：）上樣：上樣體積不十分嚴(yán)格。上樣體積不十分嚴(yán)格。2 2）洗脫）洗脫: : 增加溶液的離子強(qiáng)度增加溶液的離子強(qiáng)度 梯度洗脫法梯度洗脫法 改變?nèi)芤旱母淖內(nèi)芤旱膒HpH值值 3 3）再生：）再生：用用0.5mol/LNaOH0.5mol/LNaOH和和0.5mol/L NaCl0.5mol/L NaCl混合溶液或混合溶液或0.5mol/L HCl0.5mol/L HCl處理。處理。層析分離層析分離離離子子交交換換層層析析工作任務(wù)（二

26、）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法原理原理: : 親和層析法是據(jù)生物分子間某種特有的親和力親和層析法是據(jù)生物分子間某種特有的親和力而建立的一種新型純化方法。而建立的一種新型純化方法。如：抗原和抗體；如：抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體；RNARNA和和其互補(bǔ)的其互補(bǔ)的DNADNA等。等。親親和和層層析析層析分離層析分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法 將待純化物質(zhì)的特異配體通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共將待純化物質(zhì)的特異配體通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價(jià)的連接到載體上，待純化的物質(zhì)可被配體吸附，價(jià)的連接到載體上，待純化的

27、物質(zhì)可被配體吸附，雜質(zhì)則不被吸附，從層析柱流出，變換洗脫條件，雜質(zhì)則不被吸附，從層析柱流出，變換洗脫條件，即可將欲分離的物質(zhì)洗脫下來，實(shí)現(xiàn)分離提純。即可將欲分離的物質(zhì)洗脫下來，實(shí)現(xiàn)分離提純。親親和和層層析析層析分離層析分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法+CCC配基配基蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)1.配基固相化配基固相化2.親和吸附親和吸附固體載體固體載體3.解吸附解吸附工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法 基質(zhì)（載體）的選擇基質(zhì)（載體）的選擇 理想的基質(zhì)應(yīng)滿足以下要求：理想的基質(zhì)應(yīng)滿足以下要求： 高度的親水性。高度的親水性。 極低的非特異性吸附性（惰性）。極低的非特異性吸附性（惰性）。 具有足夠的化學(xué)基團(tuán)。具有足夠的化學(xué)基團(tuán)。 適當(dāng)?shù)亩嗫仔?。適當(dāng)?shù)亩嗫仔浴?較好的理化穩(wěn)定性。較好的理化穩(wěn)定性。 可被應(yīng)用的基質(zhì)（載體）可被應(yīng)用的基質(zhì)（載體）：（：（按性能優(yōu)劣排序）按性能優(yōu)劣排序） 瓊脂糖凝膠、聚丙稀酰胺凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素。瓊脂糖凝膠、聚丙稀酰胺凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素。 最常用的是瓊脂糖，最常用的是瓊脂糖，親親和和層層析析層析分離層析分離工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法工作任務(wù)（二）酶的分離純化方法 配體的選擇配體的選擇 一對(duì)可逆結(jié)合的生物分子中與載體相偶聯(lián)的一方一對(duì)