RNAi和siRNA轉(zhuǎn)染

1、RNAI和SIRNA轉(zhuǎn)染內(nèi) 容第一部分第一部分 RNAi實(shí)驗(yàn)基本概念實(shí)驗(yàn)基本概念第二部分第二部分 RNAi實(shí)驗(yàn)具體設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)具體設(shè)計(jì)第三部分第三部分 siRNA轉(zhuǎn)染過(guò)程相關(guān)問(wèn)題及解答轉(zhuǎn)染過(guò)程相關(guān)問(wèn)題及解答第一部分RNAI實(shí)驗(yàn)基本概念主要內(nèi)容1.RNAi的概念的概念2.RNAi的啟動(dòng)途徑的啟動(dòng)途徑3.非哺乳動(dòng)物系統(tǒng)的非哺乳動(dòng)物系統(tǒng)的RNAi實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)4.哺乳動(dòng)物系統(tǒng)的哺乳動(dòng)物系統(tǒng)的RNAi實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)5.RNAi效應(yīng)表現(xiàn)效應(yīng)表現(xiàn)1.RNAI的概念RNA干擾干擾(RNA interference)是雙鏈?zhǔn)请p鏈RNA（dsRNA)特異性地結(jié)合到與之序列互補(bǔ)的特異性地結(jié)合到與之序列互補(bǔ)的mRNA上，導(dǎo)致上，導(dǎo)

2、致mRNA降解，從而介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄降解，從而介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平基因表達(dá)抑制。水平基因表達(dá)抑制。2006年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)共同授予安德年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)共同授予安德魯魯菲爾和克雷格菲爾和克雷格梅洛梅洛，他們，他們發(fā)現(xiàn)了發(fā)現(xiàn)了“RNA干擾機(jī)干擾機(jī)制制雙鏈雙鏈RNA沉默基因沉默基因”。2.RNAI的啟動(dòng)途徑(1) dsRNA途徑途徑(2) siRNA途徑途徑(3) shRNA表達(dá)載體途徑表達(dá)載體途徑(1) DSRNA途徑dsRNA:在非哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中，大于在非哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中，大于30bp的長(zhǎng)的長(zhǎng)雙鏈雙鏈RNA(dsRNA)進(jìn)入細(xì)胞后，經(jīng)過(guò)胞質(zhì)內(nèi)雙進(jìn)入細(xì)胞后，經(jīng)過(guò)胞質(zhì)內(nèi)雙鏈特異性核酸酶鏈特異性核酸

3、酶Dicer水解成水解成21-23bp的的siRNA，進(jìn)一步導(dǎo)致進(jìn)一步導(dǎo)致RNAi的發(fā)生。的發(fā)生。但在絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中，超過(guò)但在絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中，超過(guò)30bp的的dsRNA會(huì)引起細(xì)胞潛在的抗病毒機(jī)制（干擾素會(huì)引起細(xì)胞潛在的抗病毒機(jī)制（干擾素效應(yīng)效應(yīng)）降解）降解dsRNA。(2) SIRNA途徑小干擾小干擾RNA，長(zhǎng)，長(zhǎng)21-23bp，雙鏈。，雙鏈。作用機(jī)制：雙鏈的作用機(jī)制：雙鏈的siRNA解鏈并裝配入解鏈并裝配入RNA介介導(dǎo)導(dǎo)的的沉沉默默復(fù)合物復(fù)合物(RISC)，siRNA的反義鏈引導(dǎo)的反義鏈引導(dǎo)RISC與與mRNA分子互補(bǔ)結(jié)合，并降解分子互補(bǔ)結(jié)合，并降解mRNA，最終導(dǎo)致特定基因

4、表達(dá)的抑制。最終導(dǎo)致特定基因表達(dá)的抑制。(3) SHRNA表達(dá)載體途徑shRNA（short hairpin RNA）表達(dá)載體）表達(dá)載體在細(xì)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)胞內(nèi)表達(dá)shRNA后，在后，在Dicer作用下形成作用下形成siRNA分子，導(dǎo)致分子，導(dǎo)致RNAi的發(fā)生的發(fā)生?？赡芫哂屑?xì)胞毒性?？赡芫哂屑?xì)胞毒性。shRNA可能通過(guò)可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)競(jìng)爭(zhēng)Exportin-5造成致命毒性造成致命毒性3.非哺乳動(dòng)物系統(tǒng)的RNAI實(shí)驗(yàn)如線蟲(chóng)、果蠅如線蟲(chóng)、果蠅等不涉及抗病毒免疫應(yīng)答反應(yīng)，等不涉及抗病毒免疫應(yīng)答反應(yīng)，可可通過(guò)與靶基因序列互補(bǔ)的長(zhǎng)鏈通過(guò)與靶基因序列互補(bǔ)的長(zhǎng)鏈dsRNA（通常（通常200bp）介導(dǎo)）介導(dǎo)RNAi的

5、發(fā)生的發(fā)生 。長(zhǎng)鏈長(zhǎng)鏈dsRNA通?？梢酝ㄟ^(guò)體外轉(zhuǎn)錄獲得。通常可以通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄獲得。長(zhǎng)鏈長(zhǎng)鏈dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后可被進(jìn)入細(xì)胞后可被Dicer酶水解為多個(gè)酶水解為多個(gè)混合的混合的siRNA，敲除效果更好。，敲除效果更好。4.哺乳動(dòng)物系統(tǒng)的RNAI實(shí)驗(yàn)通過(guò)轉(zhuǎn)染通過(guò)轉(zhuǎn)染siRNA：通常在：通常在3-7天可以維持較高的基天可以維持較高的基因表達(dá)抑制效應(yīng)，效應(yīng)期的長(zhǎng)短主要取決于因表達(dá)抑制效應(yīng)，效應(yīng)期的長(zhǎng)短主要取決于細(xì)胞細(xì)胞的增殖速度的增殖速度和和siRNA的有效性的有效性。大部分。大部分RNAi實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)可以在此時(shí)間段獲得結(jié)果，而且可以通過(guò)再次轉(zhuǎn)可以在此時(shí)間段獲得結(jié)果，而且可以通過(guò)再次轉(zhuǎn)染獲得超過(guò)染獲得超

6、過(guò)1周的基因表達(dá)抑制時(shí)間。周的基因表達(dá)抑制時(shí)間。通過(guò)轉(zhuǎn)染通過(guò)轉(zhuǎn)染shRNA表達(dá)載體，可以獲得超過(guò)表達(dá)載體，可以獲得超過(guò)2周的周的基因表達(dá)抑制時(shí)間，在長(zhǎng)效基因表達(dá)抑制時(shí)間，在長(zhǎng)效RNAi實(shí)驗(yàn)時(shí)，選擇實(shí)驗(yàn)時(shí)，選擇shRNA表達(dá)載體較為合適。表達(dá)載體較為合適。5.RNAI效應(yīng)表現(xiàn)RNAi效應(yīng)導(dǎo)致的靶基因下調(diào)可在效應(yīng)導(dǎo)致的靶基因下調(diào)可在mRNA水平和水平和蛋白水平表現(xiàn)，也可能會(huì)在細(xì)胞形態(tài)等生理學(xué)蛋白水平表現(xiàn)，也可能會(huì)在細(xì)胞形態(tài)等生理學(xué)方面表現(xiàn)。方面表現(xiàn)。第二部分哺乳動(dòng)物系統(tǒng)的RNAI實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)主要內(nèi)容1. 需要短期抑制還是長(zhǎng)效抑制需要短期抑制還是長(zhǎng)效抑制?2. 采用采用siRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的途徑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的

7、途徑3. 構(gòu)建構(gòu)建shRNA表達(dá)載體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)表達(dá)載體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)4. siRNA設(shè)計(jì)需要注意的問(wèn)題設(shè)計(jì)需要注意的問(wèn)題5. 脫靶效應(yīng)脫靶效應(yīng)6. 轉(zhuǎn)染是轉(zhuǎn)染是RNAi實(shí)驗(yàn)的瓶頸實(shí)驗(yàn)的瓶頸1.需要短期抑制還是長(zhǎng)效抑制?1周以內(nèi)，采用周以內(nèi)，采用siRNA較好，無(wú)需構(gòu)建載體，節(jié)省較好，無(wú)需構(gòu)建載體，節(jié)省時(shí)間，還可以采用時(shí)間，還可以采用2次轉(zhuǎn)染的方法，延長(zhǎng)次轉(zhuǎn)染的方法，延長(zhǎng)RNAi作作用的時(shí)間到用的時(shí)間到2周周。2周以上長(zhǎng)效周以上長(zhǎng)效RNAi實(shí)驗(yàn)，采用實(shí)驗(yàn)，采用shRNA表達(dá)載體較表達(dá)載體較好，效應(yīng)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。好，效應(yīng)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。2. 采用SIRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的途徑(1) 化學(xué)化學(xué)合成：首選的合成：首選的s

8、iRNA制備方法，最快、最制備方法，最快、最方便，成本高，適用于長(zhǎng)期使用特定方便，成本高，適用于長(zhǎng)期使用特定siRNA(2) 體外轉(zhuǎn)錄：費(fèi)時(shí)，成本低，所需有效濃度低，體外轉(zhuǎn)錄：費(fèi)時(shí)，成本低，所需有效濃度低，適用于大量篩選適用于大量篩選siRNASilencer siRNA Construction Kit（ThermoFisher）(3) Dicer/RNase酶解非哺乳動(dòng)物系統(tǒng)的酶解非哺乳動(dòng)物系統(tǒng)的RNAi三三種方法均可做熒光標(biāo)記，可及時(shí)得知轉(zhuǎn)染效率種方法均可做熒光標(biāo)記，可及時(shí)得知轉(zhuǎn)染效率3.構(gòu)建SHRNA表達(dá)載體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)需要構(gòu)建相關(guān)質(zhì)粒需要構(gòu)建相關(guān)質(zhì)?？衫幂d體上的抗生素等標(biāo)記篩選，做長(zhǎng)效

9、表可利用載體上的抗生素等標(biāo)記篩選，做長(zhǎng)效表達(dá)達(dá)不能做熒光標(biāo)記，無(wú)法直觀知道轉(zhuǎn)染效率不能做熒光標(biāo)記，無(wú)法直觀知道轉(zhuǎn)染效率4.SIRNA設(shè)計(jì)需要注意的問(wèn)題(1) siRNA序列設(shè)計(jì)序列設(shè)計(jì)(2) 陰性對(duì)照的作用陰性對(duì)照的作用(3) 陽(yáng)性對(duì)照的重要性陽(yáng)性對(duì)照的重要性(4) siRNA熒光標(biāo)記的問(wèn)題熒光標(biāo)記的問(wèn)題(1) SIRNA的設(shè)計(jì)理想的理想的siRNA序列是特異性強(qiáng)，抑制效率高。序列是特異性強(qiáng)，抑制效率高?？赏ㄟ^(guò)檢索相關(guān)基因的文獻(xiàn)報(bào)道序列，或者通過(guò)可通過(guò)檢索相關(guān)基因的文獻(xiàn)報(bào)道序列，或者通過(guò)在線設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行，一些技術(shù)力量較強(qiáng)的化學(xué)合在線設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行，一些技術(shù)力量較強(qiáng)的化學(xué)合成公司可提供免費(fèi)設(shè)計(jì)。成

10、公司可提供免費(fèi)設(shè)計(jì)。如果有可能，多設(shè)計(jì)幾條如果有可能，多設(shè)計(jì)幾條siRNA 序列，以篩選最序列，以篩選最特異、最有效的特異、最有效的siRNA序列。序列。(2) 陰性對(duì)照SIRNA的作用陰性對(duì)照陰性對(duì)照siRNA通常在進(jìn)入細(xì)胞后不會(huì)引起任通常在進(jìn)入細(xì)胞后不會(huì)引起任何基因表達(dá)的改變，從而反映出小分子何基因表達(dá)的改變，從而反映出小分子RNA片片段進(jìn)入細(xì)胞后對(duì)基因表達(dá)的段進(jìn)入細(xì)胞后對(duì)基因表達(dá)的非特異影響非特異影響。(3) 陽(yáng)性對(duì)照SIRNA的重要性陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照siRNA采用確認(rèn)有效的采用確認(rèn)有效的siRNA，針對(duì)，針對(duì)某些較容易檢測(cè)基因，如甘油醛某些較容易檢測(cè)基因，如甘油醛3-磷酸脫氫磷酸脫氫酶

11、（酶（GAPDH）基因；）基因；用于確認(rèn)用于確認(rèn)RNAi實(shí)驗(yàn)過(guò)程的有效性實(shí)驗(yàn)過(guò)程的有效性，包括轉(zhuǎn)染條，包括轉(zhuǎn)染條件、檢測(cè)方法是否可行等；件、檢測(cè)方法是否可行等；陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照siRNA在在RNAi實(shí)驗(yàn)初期或在新的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)初期或在新的轉(zhuǎn)染體系進(jìn)行體系進(jìn)行RNAi實(shí)驗(yàn)時(shí)很重要，容易被忽視，缺實(shí)驗(yàn)時(shí)很重要，容易被忽視，缺乏陽(yáng)性對(duì)照乏陽(yáng)性對(duì)照siRNA，實(shí)驗(yàn)出問(wèn)題無(wú)法找原因，實(shí)驗(yàn)出問(wèn)題無(wú)法找原因，耽誤時(shí)間。耽誤時(shí)間。(4) SIRNA熒光標(biāo)記的問(wèn)題采用熒光標(biāo)記的采用熒光標(biāo)記的siRNA可以用來(lái)確定轉(zhuǎn)染效率可以用來(lái)確定轉(zhuǎn)染效率和優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，這種方法操作快速，實(shí)驗(yàn)費(fèi)和優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，這種方法操作快速，實(shí)

12、驗(yàn)費(fèi)用也不高，但由于熒光標(biāo)記的用也不高，但由于熒光標(biāo)記的siRNA攝入與攝入與siRNA導(dǎo)致的抑制效果時(shí)常會(huì)出現(xiàn)不相關(guān)性，導(dǎo)致的抑制效果時(shí)常會(huì)出現(xiàn)不相關(guān)性，這種情況在某些細(xì)胞系和應(yīng)用某些轉(zhuǎn)染試劑時(shí)，這種情況在某些細(xì)胞系和應(yīng)用某些轉(zhuǎn)染試劑時(shí)，如脂質(zhì)體時(shí)更為嚴(yán)重。因此在應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染如脂質(zhì)體時(shí)更為嚴(yán)重。因此在應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件時(shí)，不推薦使用熒光標(biāo)記的試劑優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件時(shí)，不推薦使用熒光標(biāo)記的siRNA。5.RNAI OFF-TARGET(脫靶效應(yīng))(1) 什么是什么是RNAi Off-target(脫靶效應(yīng)脫靶效應(yīng))?(2) 脫靶效應(yīng)如何檢測(cè)？脫靶效應(yīng)如何檢測(cè)？(3) siRNA濃度是否

13、和脫靶效應(yīng)相關(guān)？濃度是否和脫靶效應(yīng)相關(guān)？(4) 轉(zhuǎn)染試劑是否也會(huì)造成脫靶效應(yīng)？轉(zhuǎn)染試劑是否也會(huì)造成脫靶效應(yīng)？(5) 如何避免脫靶效應(yīng)？如何避免脫靶效應(yīng)？(1) RNAI OFF-TARGET(脫靶效應(yīng))是什么？RNAi Off-target(脫靶效應(yīng)脫靶效應(yīng))：簡(jiǎn)單地說(shuō)，就是：簡(jiǎn)單地說(shuō)，就是siRNA轉(zhuǎn)染中的非特異反應(yīng)轉(zhuǎn)染中的非特異反應(yīng)，這不僅包括，這不僅包括siRNA序列，還包括轉(zhuǎn)染試劑本身或其他相關(guān)序列，還包括轉(zhuǎn)染試劑本身或其他相關(guān)因素對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的其他相關(guān)基因發(fā)生非特異性因素對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的其他相關(guān)基因發(fā)生非特異性的表達(dá)變化，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性和假陰性。目前的表達(dá)變化，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性和假陰性。目前

14、已廣泛引起研究者重視。已廣泛引起研究者重視。(2) 脫靶效應(yīng)如何檢測(cè)？多種方法可以用于預(yù)測(cè)和檢測(cè)脫靶效應(yīng)，最常多種方法可以用于預(yù)測(cè)和檢測(cè)脫靶效應(yīng)，最常見(jiàn)的方法是基因表達(dá)譜芯片的方法。見(jiàn)的方法是基因表達(dá)譜芯片的方法。(3) SIRNA濃度是否和脫靶效應(yīng)相關(guān)？以前認(rèn)為高濃度會(huì)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，實(shí)際上低濃以前認(rèn)為高濃度會(huì)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，實(shí)際上低濃度同樣會(huì)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。度同樣會(huì)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。(4) 轉(zhuǎn)染試劑是否也會(huì)造成脫靶效應(yīng)？有人采用基因芯片檢測(cè)對(duì)轉(zhuǎn)染試劑造成的細(xì)胞有人采用基因芯片檢測(cè)對(duì)轉(zhuǎn)染試劑造成的細(xì)胞基因表達(dá)影響發(fā)現(xiàn)，某脂質(zhì)體基因表達(dá)影響發(fā)現(xiàn)，某脂質(zhì)體L2K可以引發(fā)可以引發(fā)1908個(gè)基因的表達(dá)變化，既

15、包括下調(diào)，也包括個(gè)基因的表達(dá)變化，既包括下調(diào)，也包括上調(diào)。上調(diào)。如果恰好轉(zhuǎn)染試劑本身會(huì)導(dǎo)致某基因表如果恰好轉(zhuǎn)染試劑本身會(huì)導(dǎo)致某基因表達(dá)上調(diào)，可能出現(xiàn)轉(zhuǎn)染達(dá)上調(diào)，可能出現(xiàn)轉(zhuǎn)染siRNA后該基因可能會(huì)后該基因可能會(huì)出現(xiàn)表達(dá)不變甚至增強(qiáng)的現(xiàn)象出現(xiàn)表達(dá)不變甚至增強(qiáng)的現(xiàn)象，從而出現(xiàn)假陰，從而出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象，如果恰好轉(zhuǎn)染試劑本身會(huì)導(dǎo)致某基因性現(xiàn)象，如果恰好轉(zhuǎn)染試劑本身會(huì)導(dǎo)致某基因表達(dá)下調(diào)，則會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象。表達(dá)下調(diào)，則會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象。(5) 如何避免脫靶效應(yīng)？脫靶效應(yīng)并不能絕對(duì)避免，但可以采取措施減脫靶效應(yīng)并不能絕對(duì)避免，但可以采取措施減少脫靶效應(yīng)的發(fā)生，如針對(duì)同一靶基因設(shè)計(jì)少脫靶效應(yīng)的發(fā)生，如針對(duì)同

16、一靶基因設(shè)計(jì)2條條以上抑制效率在以上抑制效率在70以上的以上的不同不同siRNA序列，序列，分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可避免，可避免siRNA造成的脫靶效應(yīng)；造成的脫靶效應(yīng)；采用采用不同轉(zhuǎn)染試劑不同轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)可避免轉(zhuǎn)染試劑造進(jìn)行實(shí)驗(yàn)可避免轉(zhuǎn)染試劑造成的脫靶效應(yīng)等。成的脫靶效應(yīng)等。6.轉(zhuǎn)染是RNAI實(shí)驗(yàn)的瓶頸轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染是是siRNA實(shí)驗(yàn)的瓶頸，轉(zhuǎn)染質(zhì)量的好壞直實(shí)驗(yàn)的瓶頸，轉(zhuǎn)染質(zhì)量的好壞直接關(guān)系接關(guān)系RNAi實(shí)驗(yàn)的成敗。實(shí)驗(yàn)的成敗。(1) 選擇轉(zhuǎn)染方法的原則選擇轉(zhuǎn)染方法的原則(2) siRNA轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染的方法(3) siRNA轉(zhuǎn)染試劑的主要種類(lèi)轉(zhuǎn)染試劑的主要種類(lèi)(4) 脂質(zhì)體脂質(zhì)體(5)

17、非脂質(zhì)體聚合物類(lèi)非脂質(zhì)體聚合物類(lèi)(1) 選擇轉(zhuǎn)染方法的原則高轉(zhuǎn)染效率高轉(zhuǎn)染效率：較高的轉(zhuǎn)染效率可以取得更好的抑制效果，：較高的轉(zhuǎn)染效率可以取得更好的抑制效果，更有利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察；更有利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察；低細(xì)胞毒性低細(xì)胞毒性：因?yàn)椋阂驗(yàn)镽NAi是抑制性實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染試劑的毒性是抑制性實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染試劑的毒性多導(dǎo)致細(xì)胞凋亡等結(jié)果，這種結(jié)果是對(duì)細(xì)胞正常生理功能多導(dǎo)致細(xì)胞凋亡等結(jié)果，這種結(jié)果是對(duì)細(xì)胞正常生理功能?chē)?yán)重干擾（主要表現(xiàn)為抑制），細(xì)胞無(wú)法進(jìn)行正常轉(zhuǎn)錄表嚴(yán)重干擾（主要表現(xiàn)為抑制），細(xì)胞無(wú)法進(jìn)行正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)而出現(xiàn)凋亡。轉(zhuǎn)染試劑的毒性不僅干擾細(xì)胞正常的生理達(dá)而出現(xiàn)凋亡。轉(zhuǎn)染試劑的毒性不僅干擾細(xì)胞正常的生

18、理狀態(tài)，甚至還可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；狀態(tài)，甚至還可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；方法簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)單方法簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)單：越簡(jiǎn)單，操作越少的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，自：越簡(jiǎn)單，操作越少的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，自然出錯(cuò)的機(jī)會(huì)就少，重復(fù)性就好，工作量也少；然出錯(cuò)的機(jī)會(huì)就少，重復(fù)性就好，工作量也少；成本較低成本較低：由于：由于siRNA轉(zhuǎn)染需要篩選有效的轉(zhuǎn)染需要篩選有效的siRNA，有效，有效siRNA后續(xù)大量研究還需要不斷進(jìn)行后續(xù)大量研究還需要不斷進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染，siRNA轉(zhuǎn)染的成本尤其是轉(zhuǎn)染試劑的成本在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之初就需要轉(zhuǎn)染的成本尤其是轉(zhuǎn)染試劑的成本在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之初就需要充分考慮。充分考慮。(2) SIRNA轉(zhuǎn)染的方法到目前為止，轉(zhuǎn)染

19、的方法主要采用化學(xué)方法，到目前為止，轉(zhuǎn)染的方法主要采用化學(xué)方法，化學(xué)方法不能轉(zhuǎn)染的采用電轉(zhuǎn)化等物理方法?；瘜W(xué)方法不能轉(zhuǎn)染的采用電轉(zhuǎn)化等物理方法。(3) SIRNA轉(zhuǎn)染試劑的主要種類(lèi)脂質(zhì)體類(lèi)脂質(zhì)體類(lèi)非脂質(zhì)體聚合物類(lèi)非脂質(zhì)體聚合物類(lèi)(4) 脂質(zhì)體開(kāi)發(fā)較早，主要針對(duì)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒開(kāi)發(fā)較早，主要針對(duì)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA等大分子開(kāi)發(fā)，等大分子開(kāi)發(fā)，現(xiàn)在也被改良用于現(xiàn)在也被改良用于siRNA的轉(zhuǎn)染；的轉(zhuǎn)染；適合適合siRNA與質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)以及一些對(duì)毒性要求不與質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)以及一些對(duì)毒性要求不高的高的siRNA轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染；代表產(chǎn)品有代表產(chǎn)品有invitrogen公司的公司的lipofectamineTM 2000/3000

20、和和RNAiMAX。(5) 非脂質(zhì)體聚合物類(lèi)為克服脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的毒性，并提高轉(zhuǎn)染為克服脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的毒性，并提高轉(zhuǎn)染效率，效率，現(xiàn)在已從現(xiàn)在已從高分子聚合物高分子聚合物類(lèi)轉(zhuǎn)染試劑發(fā)展類(lèi)轉(zhuǎn)染試劑發(fā)展到納米到納米聚合物類(lèi)轉(zhuǎn)染試劑。聚合物類(lèi)轉(zhuǎn)染試劑。代表產(chǎn)品有：代表產(chǎn)品有：Merck公司的公司的NanoJuice Transfection Kit（Caco-2）；）；Qiagen公司的公司的HiperFect；Clontech公司的公司的XfectTM；Micropoly公司的公司的Micropoly-transfecterTM cell reagent；Engreen Biosystem公司公

21、司的的EntransterTM-R等。等。第三部分SIRNA轉(zhuǎn)染過(guò)程相關(guān)問(wèn)題及解答1.siRNA轉(zhuǎn)染過(guò)程相關(guān)問(wèn)題轉(zhuǎn)染過(guò)程相關(guān)問(wèn)題2.siRNA轉(zhuǎn)染疑問(wèn)解答轉(zhuǎn)染疑問(wèn)解答1.SIRNA轉(zhuǎn)染過(guò)程相關(guān)問(wèn)題(1) 轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)量的問(wèn)題轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)量的問(wèn)題(2) 轉(zhuǎn)染時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)siRNA工作濃度工作濃度(3) 轉(zhuǎn)染時(shí)血清的問(wèn)題轉(zhuǎn)染時(shí)血清的問(wèn)題(4) 轉(zhuǎn)染時(shí)抗生素的問(wèn)題轉(zhuǎn)染時(shí)抗生素的問(wèn)題(5) 轉(zhuǎn)染過(guò)程轉(zhuǎn)染過(guò)程(6) 轉(zhuǎn)染后換液的問(wèn)題轉(zhuǎn)染后換液的問(wèn)題(7) 轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化的問(wèn)題轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化的問(wèn)題(8) RNAi效應(yīng)檢測(cè)方法效應(yīng)檢測(cè)方法(1) 轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)量的問(wèn)題細(xì)胞數(shù)量：以轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞的匯合度在細(xì)胞數(shù)量：以轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)

22、胞的匯合度在20-40為宜，這個(gè)匯合度比通常為宜，這個(gè)匯合度比通常DNA轉(zhuǎn)染的匯合度要小，轉(zhuǎn)染的匯合度要小，這是因?yàn)檗D(zhuǎn)染后需要培養(yǎng)的時(shí)間通常比這是因?yàn)檗D(zhuǎn)染后需要培養(yǎng)的時(shí)間通常比DNA轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染的時(shí)間要長(zhǎng)，同時(shí)較低的細(xì)胞數(shù)量也有利于提高的時(shí)間要長(zhǎng)，同時(shí)較低的細(xì)胞數(shù)量也有利于提高抑制效率。抑制效率。需要注意的是：轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的匯合度（細(xì)胞數(shù)量）需要注意的是：轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的匯合度（細(xì)胞數(shù)量）會(huì)對(duì)會(huì)對(duì)RNAi結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。一些轉(zhuǎn)染試劑，結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。一些轉(zhuǎn)染試劑，如脂質(zhì)體，需要的匯合度會(huì)高一些，這是為了減如脂質(zhì)體，需要的匯合度會(huì)高一些，這是為了減輕轉(zhuǎn)染試劑的毒性，一般來(lái)說(shuō)，輕轉(zhuǎn)染試劑的毒性，一般

23、來(lái)說(shuō)，細(xì)胞數(shù)量較少更細(xì)胞數(shù)量較少更能提高抑制效率能提高抑制效率。(2) 轉(zhuǎn)染時(shí)SIRNA工作濃度siRNA濃度：需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)的優(yōu)化。過(guò)低濃度：需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)的優(yōu)化。過(guò)低的的siRNA濃度達(dá)不到相應(yīng)的抑制效果，過(guò)高的濃度達(dá)不到相應(yīng)的抑制效果，過(guò)高的siRNA濃度濃度可能會(huì)引起一些非特異的改變。需要注意的是這里可能會(huì)引起一些非特異的改變。需要注意的是這里siRNA濃度指濃度指siRNA在反應(yīng)時(shí)的終濃度，也就是以轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的在反應(yīng)時(shí)的終濃度，也就是以轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的總體積來(lái)計(jì)算的?？傮w積來(lái)計(jì)算的。一般一般siRNA的有效反應(yīng)濃度在的有效反應(yīng)濃度在10nM-200nM，選擇最低有

24、效濃度，選擇最低有效濃度。需要注意的是：需要注意的是：siRNA的分子量，對(duì)的分子量，對(duì)21nt雙鏈雙鏈siRNA oligo來(lái)說(shuō)，平均分子量約為來(lái)說(shuō)，平均分子量約為13300g/mol，合成，合成siRNA其其OD值和值和nmol換算關(guān)系由于換算關(guān)系由于OD值受產(chǎn)物中其他成分影響，值受產(chǎn)物中其他成分影響，如熒光標(biāo)記、純度等，具體請(qǐng)?jiān)儐?wèn)合成公司，一般如熒光標(biāo)記、純度等，具體請(qǐng)?jiān)儐?wèn)合成公司，一般1OD duplex2.5-5 nmols33-66 ug。 (3) 轉(zhuǎn)染時(shí)血清的問(wèn)題一些轉(zhuǎn)染試劑要求在轉(zhuǎn)染前換無(wú)血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)一些轉(zhuǎn)染試劑要求在轉(zhuǎn)染前換無(wú)血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后染后4-6h再更換成有血清培養(yǎng)

25、基，這其實(shí)是為了再更換成有血清培養(yǎng)基，這其實(shí)是為了減輕轉(zhuǎn)染造成的細(xì)胞毒性減輕轉(zhuǎn)染造成的細(xì)胞毒性?，F(xiàn)在較好。現(xiàn)在較好的轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染試劑試劑也能在血清存在下轉(zhuǎn)染。也能在血清存在下轉(zhuǎn)染。(4) 轉(zhuǎn)染時(shí)抗生素的問(wèn)題一些轉(zhuǎn)染試劑，如脂質(zhì)體，需要在轉(zhuǎn)染時(shí)采用無(wú)一些轉(zhuǎn)染試劑，如脂質(zhì)體，需要在轉(zhuǎn)染時(shí)采用無(wú)抗生素培養(yǎng)基，這是由于抗生素培養(yǎng)基，這是由于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染會(huì)同時(shí)將培脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染會(huì)同時(shí)將培養(yǎng)基的一些成份包括抗生素也帶進(jìn)細(xì)胞，造成細(xì)養(yǎng)基的一些成份包括抗生素也帶進(jìn)細(xì)胞，造成細(xì)胞毒性胞毒性?，F(xiàn)在。現(xiàn)在較好較好的轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染試劑也不要求去除抗生試劑也不要求去除抗生素。素。(5) 轉(zhuǎn)染過(guò)程轉(zhuǎn)染過(guò)程：轉(zhuǎn)染的過(guò)程其實(shí)很簡(jiǎn)單。一般是分轉(zhuǎn)染過(guò)程：轉(zhuǎn)染的過(guò)程其實(shí)很簡(jiǎn)單。一般是分別稀釋轉(zhuǎn)染試劑和別稀釋轉(zhuǎn)染試劑和siRNA，然后二者混合，滴，然后二者混合，滴加到細(xì)胞表面，然后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。這點(diǎn)根據(jù)加到細(xì)胞表面，然后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。這點(diǎn)根據(jù)不同轉(zhuǎn)染試劑的不同轉(zhuǎn)染試劑的Protocol操作即可。操作即可。(6) 轉(zhuǎn)染后換液的問(wèn)題一些轉(zhuǎn)染試劑要求在轉(zhuǎn)染后一些轉(zhuǎn)染試劑要求在轉(zhuǎn)染后4-6h換液，其目的就換液，其