高中生物選修一2017-課題2多聚酶鏈式反應擴增DNA片段(39ppt)

1、課題2多聚酶鏈式反應擴增DNA片段一、一、PCRPCR的原理及反應過程的原理及反應過程1.1.生物體內(nèi)生物體內(nèi)DNADNA復制的條件復制的條件: :(1)(1)原料原料:_:_。(2)(2)模板模板: :解旋后的每一條解旋后的每一條_。(3)(3)酶酶: :打開打開DNADNA雙鏈的雙鏈的_和合成和合成DNADNA單鏈的單鏈的_。(4)(4)引物引物: :為為DNADNA聚合酶的起始提供聚合酶的起始提供_末端。末端。4 4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸DNADNA母鏈母鏈解旋酶解旋酶DNADNA聚合酶聚合酶332.PCR2.PCR的概念和原理的概念和原理: :(1)(1)概念概念:PCR:PCR即多

2、聚酶鏈式反應即多聚酶鏈式反應, ,是一種體外是一種體外_的技術。它能以極少量的的技術。它能以極少量的DNADNA為模板為模板, ,在幾小時內(nèi)復制出上百萬在幾小時內(nèi)復制出上百萬份的份的DNADNA拷貝?？截悺Ｑ杆贁U增迅速擴增DNADNA片段片段(2)(2)原理原理: :DNADNA變性變性: :在在_的溫度范圍內(nèi)的溫度范圍內(nèi),DNA,DNA的的_結(jié)構結(jié)構將解體將解體, ,雙鏈分開雙鏈分開, ,這個過程稱為變性。這個過程稱為變性。DNADNA復性復性: :當溫度緩慢降低后當溫度緩慢降低后, ,兩條彼此分離的兩條彼此分離的DNADNA鏈又會重新鏈又會重新_,_,這個過程稱為復性。這個過程稱為復性。D

3、NADNA合成合成:DNA:DNA聚合酶從引物聚合酶從引物_端開始延伸端開始延伸DNADNA鏈鏈,DNA,DNA的合成的合成方向總是從子鏈的方向總是從子鏈的_端向端向_端延伸。端延伸。8080100100雙螺旋雙螺旋結(jié)合成雙鏈結(jié)合成雙鏈335533(3)(3)條件條件: :原料原料:_:_。模板模板: :熱變性解旋后的兩條熱變性解旋后的兩條_。酶酶:_:_。引物引物: :能分別與能分別與_兩端互補配對的兩種引物兩端互補配對的兩種引物, ,為為DNADNA聚合酶提供聚合酶提供33末端。末端。其他條件其他條件: :需要穩(wěn)定的需要穩(wěn)定的_和能自動調(diào)節(jié)溫度的溫控設和能自動調(diào)節(jié)溫度的溫控設備。備。四種脫

4、氧核苷酸四種脫氧核苷酸DNADNA母鏈母鏈耐熱的耐熱的DNADNA聚合酶聚合酶兩條模板鏈兩條模板鏈緩沖溶液緩沖溶液3.PCR3.PCR的反應過程的反應過程: :變性變性: :當溫度上升到當溫度上升到_以上時以上時, ,雙鏈雙鏈DNADNA解旋解旋, ,氫鍵斷裂氫鍵斷裂, ,變?yōu)樽優(yōu)?單鏈單鏈復性復性: :當溫度下降到當溫度下降到_左右左右, ,兩種引物通過兩種引物通過_ 分別與兩條單鏈分別與兩條單鏈DNADNA結(jié)合結(jié)合延伸延伸: :當溫度上升到當溫度上升到_左右左右, ,溶液中的四種脫氧核苷酸溶液中的四種脫氧核苷酸 (A,T,G,C)(A,T,G,C)在在_的作用下的作用下, ,根據(jù)根據(jù)_ 原

5、則合成新的原則合成新的DNADNA鏈鏈90905050堿基互補配對堿基互補配對7272DNADNA聚合酶聚合酶堿基互補配對堿基互補配對二、二、PCRPCR的實驗操作的實驗操作1.1.實驗用具實驗用具: :(1)PCR(1)PCR儀儀: :該儀器能自動調(diào)控該儀器能自動調(diào)控_,_,實現(xiàn)實現(xiàn)DNADNA的擴增。如果沒有的擴增。如果沒有PCRPCR儀儀, ,可用可用3 3個個_水浴鍋代替水浴鍋代替, ,操作時按程序在操作時按程序在3 3個水浴鍋中個水浴鍋中來回轉(zhuǎn)移來回轉(zhuǎn)移PCRPCR反應的微量離心管。反應的微量離心管。(2)(2)微量離心管微量離心管: :總?cè)莘e為總?cè)莘e為_mL,_mL,實際上是進行實

6、際上是進行PCRPCR反應的場反應的場所。所。(3)(3)微量移液器微量移液器: :用于向微量離心管中轉(zhuǎn)移用于向微量離心管中轉(zhuǎn)移PCRPCR配方中的液體配方中的液體, ,每每吸取一種試劑后其上的一次性吸液槍頭都必須更換。吸取一種試劑后其上的一次性吸液槍頭都必須更換。溫度溫度恒溫恒溫0.50.52.2.實驗步驟實驗步驟: :準備準備: :按照按照PCRPCR反應需要的物質(zhì)和條件反應需要的物質(zhì)和條件, ,將需要的試劑和儀器準將需要的試劑和儀器準 備好備好移液移液: :用用_按照配方在微量離心管中依次加入各試劑按照配方在微量離心管中依次加入各試劑混合混合: :蓋嚴離心管口的蓋子蓋嚴離心管口的蓋子,

7、,用手指輕彈用手指輕彈_,_,使反應液混使反應液混 合均勻合均勻離心離心: :將離心管放在離心機上將離心管放在離心機上, ,離心約離心約10s,10s,使反應液集中在使反應液集中在 _反應反應: :將離心管放入將離心管放入_中進行反應中進行反應微量移液器微量移液器管的側(cè)壁管的側(cè)壁離心管底部離心管底部PCRPCR儀儀3.DNA3.DNA含量的測定含量的測定: :(1)(1)原理原理: :利用利用DNADNA在在_的紫外線波段有一強烈的吸收峰。的紫外線波段有一強烈的吸收峰。(2)(2)計算公式計算公式: :DNADNA含量含量(g/mL)=_(g/mL)=_稀釋倍數(shù)。稀釋倍數(shù)。260 nm260

8、nm5050(260 nm(260 nm的讀數(shù)的讀數(shù)) )【思考辨析】【思考辨析】1.1.判斷正誤判斷正誤(1)PCR(1)PCR過程中過程中, ,需要解旋酶打開氫鍵需要解旋酶打開氫鍵, ,使使DNADNA雙鏈解旋為單雙鏈解旋為單鏈。鏈。( ( ) )【分析】【分析】PCRPCR的解旋過程是用熱變性的原理打開氫鍵的解旋過程是用熱變性的原理打開氫鍵, ,未用到未用到DNADNA解旋酶。解旋酶。(2)PCR(2)PCR的引物是一段與的引物是一段與DNADNA相配對的相配對的RNARNA片段。片段。( ( ) )【分析】【分析】PCRPCR的引物可以是的引物可以是RNARNA片段片段, ,也可以是也

9、可以是DNADNA片段。片段。(3)(3)復性過程中復性過程中,DNA,DNA母鏈與新合成的子鏈形成雙螺旋。母鏈與新合成的子鏈形成雙螺旋。( ( ) )【分析】【分析】復性過程是讓解旋后的母鏈通過堿基互補配對與引物復性過程是讓解旋后的母鏈通過堿基互補配對與引物結(jié)合。結(jié)合。(4)(4)耐熱的耐熱的DNADNA聚合酶可以從生活在熱泉的細菌中提取。聚合酶可以從生活在熱泉的細菌中提取。( )( )2.2.問題思考問題思考(1)PCR(1)PCR反應過程中的溫度控制為什么要先高溫后低溫然后再適反應過程中的溫度控制為什么要先高溫后低溫然后再適當升溫當升溫? ?請分析原因。請分析原因。提示：提示：PCRPC

10、R過程中先高溫解旋過程中先高溫解旋, ,后低溫使引物與模板結(jié)合后低溫使引物與模板結(jié)合, ,然后然后再適當升溫盡量達到再適當升溫盡量達到TaqDNATaqDNA聚合酶的最適溫度聚合酶的最適溫度, ,加快反應速度。加快反應速度。(2)PCR(2)PCR過程中過程中, ,經(jīng)過經(jīng)過3030次循環(huán)次循環(huán), ,一個一個DNADNA分子會擴增成多少個分子會擴增成多少個? ?提示：提示：每循環(huán)每循環(huán)1 1次次,DNA,DNA分子數(shù)會變?yōu)樵瓉淼姆肿訑?shù)會變?yōu)樵瓉淼? 2倍倍, ,因此經(jīng)過因此經(jīng)過3030次次循環(huán)循環(huán), ,會擴增成會擴增成2 23030個個DNADNA分子。分子。一、生物體內(nèi)的一、生物體內(nèi)的DNAD

11、NA復制與復制與PCRPCR反應的比較反應的比較體內(nèi)體內(nèi)DNADNA復制復制PCRPCR反應反應不不同同點點時期時期細胞有絲分裂間期和減數(shù)第細胞有絲分裂間期和減數(shù)第一次分裂前的間期一次分裂前的間期體外隨時進行體外隨時進行場所場所活細胞內(nèi)活細胞內(nèi)細胞外細胞外酶酶解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶聚合酶耐高溫的耐高溫的DNADNA聚合酶聚合酶(TaqDNA(TaqDNA聚合酶聚合酶) )特點特點邊解旋邊復制邊解旋邊復制, ,半保留復制半保留復制體外迅速擴增體外迅速擴增是否需是否需緩沖液緩沖液不需緩沖液不需緩沖液嚴格配制嚴格配制1010倍濃縮倍濃縮擴增緩沖液擴增緩沖液設備設備無無嚴格控制溫度變化嚴格

12、控制溫度變化的溫控設備的溫控設備體內(nèi)體內(nèi)DNADNA復制復制PCRPCR反應反應相相同同點點原料原料4 4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸(A(A、G G、C C、T)T)復制原理復制原理嚴格遵循堿基互補配對原則嚴格遵循堿基互補配對原則, ,半保留復制半保留復制模板模板以以DNADNA母鏈為模板母鏈為模板引物引物都需要分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物都需要分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物【易錯提醒】【易錯提醒】(1)(1)解旋酶的作用是使解旋酶的作用是使DNADNA兩條鏈的氫鍵斷開兩條鏈的氫鍵斷開, ,而而DNADNA聚合酶與聚合酶與DNADNA連接酶的作用都是催化形成磷酸二酯鍵。連接酶的作用都是催化

13、形成磷酸二酯鍵。(2)DNA(2)DNA聚合酶是將單個核苷酸加到已有的單鏈片段的聚合酶是將單個核苷酸加到已有的單鏈片段的33端上端上, ,需要模板需要模板; ;而而DNADNA連接酶連接的是兩條連接酶連接的是兩條DNADNA片段的缺口片段的缺口, ,不需要模不需要模板。板?！镜淅柧殹镜淅柧? 1】PCRPCR過程與細胞內(nèi)的過程與細胞內(nèi)的DNADNA復制過程相比復制過程相比, ,主要有兩主要有兩點不同點不同, ,它們是它們是( () )PCRPCR過程需要的引物是人工合成的單鏈過程需要的引物是人工合成的單鏈DNADNA或或RNARNAPCRPCR過程不需要過程不需要DNADNA聚合酶聚合酶P

14、CRPCR過程中過程中DNADNA的解旋不依靠解旋酶的解旋不依靠解旋酶, ,而是通過對反應溫度的而是通過對反應溫度的控制來實現(xiàn)的控制來實現(xiàn)的PCRPCR過程中過程中,DNA,DNA不需要解旋不需要解旋, ,直接以雙鏈直接以雙鏈DNADNA為模板進行復制為模板進行復制A.A. B.B. C.C. D.D.【解題關鍵】【解題關鍵】解答本題的關鍵是解答本題的關鍵是: :明確明確PCRPCR過程需要人工合成的過程需要人工合成的引物引物, ,利用熱變性的原理打開利用熱變性的原理打開DNADNA的雙鏈。的雙鏈。【解析】【解析】選選C C。PCRPCR過程與細胞內(nèi)的過程與細胞內(nèi)的DNADNA復制過程相比較復

15、制過程相比較, ,主要有主要有兩點不同兩點不同:(1)PCR:(1)PCR過程需要的引物是人工合成的單鏈過程需要的引物是人工合成的單鏈DNADNA或或RNA,RNA,長度通常為長度通常為20203030個核苷酸。個核苷酸。(2)PCR(2)PCR過程中過程中,DNA,DNA解旋不依賴解解旋不依賴解旋酶旋酶, ,而是通過對反應溫度的控制來實現(xiàn)的。而是通過對反應溫度的控制來實現(xiàn)的。【誤區(qū)警示】【誤區(qū)警示】無論無論DNADNA是在細胞內(nèi)還是在體外復制的過程都需是在細胞內(nèi)還是在體外復制的過程都需要解旋要解旋, ,因為只有解旋使堿基暴露因為只有解旋使堿基暴露, ,母鏈才能和子鏈配對母鏈才能和子鏈配對,

16、,進行進行半保留復制。但在細胞內(nèi)半保留復制。但在細胞內(nèi), ,解旋通過解旋酶完成。生物體外解旋通過解旋酶完成。生物體外, ,利利用用DNADNA的熱變性原理的熱變性原理:80:80100100時時DNADNA的雙螺旋結(jié)構將解體的雙螺旋結(jié)構將解體, ,雙雙鏈分開。其結(jié)果相同鏈分開。其結(jié)果相同, ,但過程不同。但過程不同。二、二、PCRPCR操作操作1.PCR1.PCR解旋與復旋的原理解旋與復旋的原理: :DNADNA熱變性與復性：熱變性與復性：(80100 )DNADNA 變性復性 溫度緩慢降低雙鏈單鏈()2.PCR2.PCR的反應過程的反應過程( (如圖如圖):):3.PCR3.PCR擴增的計算

17、與擴增的計算與DNADNA含量的測定含量的測定: :(1)(1)理論上理論上DNADNA呈指數(shù)方式擴增。若開始只有一個呈指數(shù)方式擴增。若開始只有一個DNADNA提供模板提供模板, ,則循環(huán)則循環(huán)n n次后有次后有2 2n n個個DNA;DNA;若開始有若開始有N N0 0個個DNADNA提供模板提供模板, ,則循環(huán)則循環(huán)n n次次后獲得的子代后獲得的子代DNADNA數(shù)目為數(shù)目為N N0 022n n個。個。(2)DNA(2)DNA含量的測定含量的測定: :DNADNA在在260 nm260 nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰的紫外線波段有一強烈的吸收峰, ,峰值的大小與峰值的大小與DNADNA含

18、量有關?？梢岳煤坑嘘P?？梢岳肈NADNA的這一特點進行的這一特點進行DNADNA含量的測定含量的測定, ,具具體方法如下體方法如下: :【易錯提醒】【易錯提醒】(1)PCR(1)PCR過程中無解旋酶過程中無解旋酶, ,需要升高溫度才能打開需要升高溫度才能打開氫鍵氫鍵, ,但此時的溫度還不能破壞磷酸二酯鍵但此時的溫度還不能破壞磷酸二酯鍵, ,因此因此, ,熱變性后是熱變性后是DNADNA單鏈單鏈, ,并未分解成單體。并未分解成單體。(2)(2)復性時只是在引物和復性時只是在引物和DNADNA單鏈之間形成氫鍵單鏈之間形成氫鍵, ,兩條單鏈之間兩條單鏈之間并未形成氫鍵并未形成氫鍵, ,因此復性

19、后因此復性后, ,無雙鏈無雙鏈DNADNA分子形成。分子形成?！镜淅柧殹镜淅柧? 2】PCR(PCR(多聚酶鏈式反應多聚酶鏈式反應) )技術是一項在生物體外復技術是一項在生物體外復制特定制特定DNADNA片段的核酸合成技術片段的核酸合成技術, ,下圖表示合成過程下圖表示合成過程, ,請據(jù)圖分請據(jù)圖分析回答析回答: :(1)A(1)A過程高溫使過程高溫使DNADNA變性解旋變性解旋, ,對該過程的原理敘述對該過程的原理敘述, ,正確的是正確的是 ( () )A.A.該過程用到耐高溫的解旋酶破壞氫鍵該過程用到耐高溫的解旋酶破壞氫鍵B.B.該過程用到限制酶破壞磷酸二酯鍵該過程用到限制酶破壞磷酸二

20、酯鍵C.C.該過程不需要解旋酶的作用該過程不需要解旋酶的作用D.D.該過程與人體細胞的過程完全相同該過程與人體細胞的過程完全相同(2)C(2)C過程要用到的酶是過程要用到的酶是。這種酶在高溫下仍。這種酶在高溫下仍保持活性保持活性, ,因此在因此在PCRPCR擴增時可以擴增時可以加入。加入。PCRPCR反應除提反應除提供酶外供酶外, ,還需要滿足的基本條件有還需要滿足的基本條件有:_:_。(3)(3)如果把模板如果把模板DNADNA的兩條鏈用的兩條鏈用1515N N標記標記, ,游離的脫氧核苷酸不做游離的脫氧核苷酸不做標記標記, ,控制控制“9595555572”72”溫度循環(huán)溫度循環(huán)3 3次次

21、, ,則在形成的子則在形成的子代代DNADNA中含有中含有1515N N標記的標記的DNADNA占占。(4)(4)如果模板如果模板DNADNA分子共有分子共有a a個堿基對個堿基對, ,其中含有胞嘧啶其中含有胞嘧啶m m個個, ,則該則該DNADNA復制復制1010次次, ,需要加入胸腺嘧啶脫氧核苷酸需要加入胸腺嘧啶脫氧核苷酸個。個。(5)PCR(5)PCR中由堿基錯配引起的變異屬于中由堿基錯配引起的變異屬于。假。假設對一個設對一個DNADNA進行擴增進行擴增, ,第一次循環(huán)時某一條模板鏈上發(fā)生堿基第一次循環(huán)時某一條模板鏈上發(fā)生堿基錯配錯配, ,則擴增若干次后檢測所有則擴增若干次后檢測所有DN

22、ADNA的擴增片段的擴增片段, ,與原與原DNADNA相應片相應片段相同的占段相同的占。【解題關鍵】【解題關鍵】首先要明確首先要明確DNADNA復制的特點復制的特點: :半保留復制半保留復制, ,其次掌其次掌握握DNADNA的復制是呈的復制是呈“指數(shù)指數(shù)”增長的。此外還要理解增長的。此外還要理解DNADNA復制原則復制原則: :堿基互補配對原則。堿基互補配對原則?！窘馕觥俊窘馕觥?1)(1)高溫所起的作用類似于解旋酶高溫所起的作用類似于解旋酶, ,使雙鏈使雙鏈DNADNA解聚為解聚為單鏈。單鏈。(2)C(2)C過程為過程為PCRPCR技術的延伸階段技術的延伸階段, ,當系統(tǒng)溫度上升至當系統(tǒng)溫度

23、上升至7272左右時左右時, ,溶液中的四種脫氧核苷酸在溶液中的四種脫氧核苷酸在TaqDNATaqDNA聚合酶的作用下合聚合酶的作用下合成新的成新的DNADNA鏈。鏈。TaqDNATaqDNA聚合酶是耐熱的聚合酶是耐熱的, ,高溫下不變性高溫下不變性, ,所以一所以一次性加入即可。次性加入即可。PCRPCR即為體外即為體外DNADNA復制復制, ,所需條件與體內(nèi)所需條件與體內(nèi)DNADNA復制復制基本相同基本相同, ,都需要模板、原料、能量、酶都需要模板、原料、能量、酶, ,只不過為了便于控制只不過為了便于控制DNADNA復制過程復制過程, ,通過設置高溫解旋代替了解旋酶的作用通過設置高溫解旋代

24、替了解旋酶的作用, ,省掉了省掉了解旋酶作用過程中所需能量的供應解旋酶作用過程中所需能量的供應, ,同時同時, ,加入了與模板鏈相結(jié)加入了與模板鏈相結(jié)合的引物作為子鏈延伸的起點合的引物作為子鏈延伸的起點, ,省掉了切除引物的過程省掉了切除引物的過程, ,使使PCRPCR過程更簡潔。過程更簡潔。(3)PCR(3)PCR技術遵循半保留復制的特點。經(jīng)過技術遵循半保留復制的特點。經(jīng)過3 3次次循環(huán)循環(huán), ,共產(chǎn)生共產(chǎn)生2 23 3個個DNADNA分子分子, ,其中有其中有2 2個個DNADNA分子含有分子含有1515N N標記。標記。(4)(4)在一個雙鏈在一個雙鏈DNADNA分子中分子中,(C+T)

25、,(C+T)占堿基總數(shù)的一半占堿基總數(shù)的一半, ,故故T T的數(shù)的數(shù)目為目為a-m,a-m,復制復制1010次次, ,相當于新增加了相當于新增加了(2(21010-1)-1)個個DNADNA分子分子, ,故需故需補充補充T T的數(shù)目為的數(shù)目為(2(21010-1)(a-m)-1)(a-m)。(5)(5)基因中的堿基對改變屬于基因中的堿基對改變屬于基因突變。對一個基因突變。對一個DNADNA進行擴增進行擴增, ,第一次循環(huán)時某一條模板鏈第一次循環(huán)時某一條模板鏈上發(fā)生堿基錯配上發(fā)生堿基錯配, ,以后按正常配對方式進行擴增以后按正常配對方式進行擴增, ,錯配鏈作模錯配鏈作模板擴增的都是錯誤的板擴增的都是錯誤的DNADNA分子分子, ,原正常鏈擴增得到的原正常