奶牛常見傳染病的生物學(xué)基礎(chǔ)和診斷方法

1、奶牛常見傳染病的生物學(xué)基礎(chǔ)和診斷方法中圖分類號：S856.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A李艷華 劉振君 叢慧敏北京奶牛中心，北京 100192 我國是奶牛養(yǎng)殖大國，2010年全國奶牛優(yōu)勢區(qū)域的奶牛存欄數(shù)已達(dá)到1400萬頭，奶產(chǎn)量居世界第三，但單產(chǎn)水平僅排在世界第十五位，除品種和飼養(yǎng)管理等因素外，奶牛疾病也是制約我國奶業(yè)發(fā)展的重要因素之一。在奶牛各種傳染性疾病中，口蹄疫、布病(布魯氏菌病)與結(jié)核病危害最為嚴(yán)重，均為人畜共患病。近年來，這些傳染病的流行呈明顯上升趨勢，嚴(yán)重威脅著奶業(yè)生產(chǎn)和人類自身安全健康，研究奶牛傳染病的發(fā)病機(jī)制和診斷方法具有重要意義，本文就以下幾種奶牛常見傳染病的生物學(xué)特點(diǎn)、遺傳機(jī)制以及實(shí)驗(yàn)

2、室診斷方法等進(jìn)行綜述。1 口蹄疫(Foot and Mouth Disease，F(xiàn)MD)口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起偶蹄類動(dòng)物感染的一種急性、烈性、接觸性傳染病，主要危害豬、牛、羊等70種家畜和野生動(dòng)物，人也易感，對畜牧業(yè)危害極大（丁耀忠 等，2009）?？谔阋卟《荆‵MDV）被認(rèn)為是最重要的經(jīng)濟(jì)獸醫(yī)病原，是因?yàn)槠涓叨葌魅拘缘男再|(zhì)和該病毒已對養(yǎng)殖業(yè)造成的破壞性影響。根據(jù)它的特點(diǎn)，口蹄疫被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)定為一類傳染病，我國農(nóng)業(yè)部也將其列為一類傳染病。FMDV粒子呈球形，正20面體立體對稱，無囊膜，完整病毒含有單股正鏈RNA及衣殼蛋白，并含有少量裝配過程中夾帶的非結(jié)構(gòu)蛋白和宿主

3、肌動(dòng)蛋白(殷震 等，1997)。病毒衣殼由4種結(jié)構(gòu)蛋白即VP1、VP2、VP3和VP4各60個(gè)拷貝組成，其中VP1和VP3是主要免疫性抗原?？谔阋卟《竟灿?個(gè)血清型：A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3、Asia1 型，各型間無交叉反應(yīng)，每個(gè)型又可以進(jìn)一步分為不同的亞型（張亮 等，2009）。FMDV基因組全長約8.5kb，由5端非編碼區(qū)(5-U TR) 、開放閱讀框(ORF) 和3-UTR 及Poly (A) 尾巴組成。ORF由L基因、P1結(jié)構(gòu)蛋白基因、P2和P3非結(jié)構(gòu)蛋白基因以及起始密碼子和終止密碼子組成，長約6.5 kb，編碼一個(gè)大的聚合蛋白（劉慶軍 等，2005）。由于該病毒亞型多

4、、抗原變異性強(qiáng)、宿主范圍廣等原因，所以為奶牛疫病的診斷和防控增加了難度。根據(jù)臨床癥狀即可對FMD作出初步診斷，但FMD與其它水泡性疾病特別是豬水泡病( SVD)、水泡性口炎( VS)、水泡性疹(VES)在臨床癥狀上極為相似，因此必須進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷以確診。口蹄疫的實(shí)驗(yàn)室診斷主要包括病原學(xué)檢查、血清學(xué)診斷技術(shù)與分子生物學(xué)診斷技術(shù)。在病原學(xué)檢查方面，對口蹄疫的診斷主要依靠動(dòng)物試驗(yàn)、細(xì)胞培養(yǎng)。血清學(xué)診斷技術(shù)包括病毒中和試驗(yàn)（VN）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、凝集試驗(yàn)、免疫擴(kuò)散、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)( ELISA)等，其中，VN是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織推薦的檢測FMDV抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法，這一方法必須使用活病毒，非普通實(shí)驗(yàn)室所能

5、操作，而且不能區(qū)分自然免疫和人工免疫。ELISA 試驗(yàn)檢測口蹄疫具有特異、敏感、快速、簡便、可靠性好等特點(diǎn)，已成為國際上檢測FMD的常規(guī)方法之一。3ABC-ELISA方法能區(qū)分自然免疫和人工免疫，在實(shí)驗(yàn)室診斷中廣泛應(yīng)用。對未見水泡只有疑似斑痕殘留，或無明顯癥狀的亞臨床感染及康復(fù)動(dòng)物是否帶毒情況用傳統(tǒng)方法很難準(zhǔn)確判斷。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對口蹄疫的診斷從細(xì)胞水平發(fā)展到分子水平，國內(nèi)外相繼建立了口蹄疫核酸雜交、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、核酸序列分析等分子生物學(xué)診斷技術(shù)，這些方法比傳統(tǒng)診斷方法具有更高的敏感性和特異性，有效彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法的不足，但由于臨床采集的樣本成分復(fù)雜，可能含有與目

6、的片段相似的序列，這樣就產(chǎn)生假陽性擴(kuò)增產(chǎn)物。生物傳感器作為一種高新技術(shù)檢測手段已被列為重點(diǎn)研究和發(fā)展的新技術(shù)，可應(yīng)用于口蹄疫、禽流感等重大傳染病的檢測和快速診斷?；蛐酒强焖?、高效、高通量和自動(dòng)化的核酸分析手段，可測出10 pg/L的樣品，能對上百個(gè)基因片段或多種病毒進(jìn)行同步檢測并且得到樣品中的生物學(xué)信息，但成本高，廣泛推廣顯然是不可能的（Liang et al.，2005）。目前，雖已建立和應(yīng)用于口蹄疫的診斷方法很多，但對FMD的診斷仍然依賴于傳統(tǒng)的流行病學(xué)并結(jié)合新的生物診斷技術(shù)。能否發(fā)展一種集生物學(xué)試驗(yàn)、生物傳感器和基因芯片技術(shù)的優(yōu)勢，具有良好的通用性、敏感性和穩(wěn)定性的診斷方法，是目前學(xué)

7、者探索的問題和挑戰(zhàn)。2 牛布氏桿菌病（bovine brucellosis）奶牛布氏桿菌病是由布氏桿菌（Brucella）引起的一種人畜共患傳染病，屬于我國規(guī)定的二類動(dòng)物疫病。布魯氏菌屬于兼性胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性球桿菌，無孢子和莢膜，不運(yùn)動(dòng)，但是除了趨化系統(tǒng)外它們卻帶有所有的與鞭毛合成相關(guān)的基因( Fretin 等，2005)。根據(jù)宿主范圍及致病特點(diǎn)的不同，布魯氏菌屬主要分為6個(gè)種（species）19個(gè)生物型（biovar）：牛種布魯氏菌（B.abortus）、羊種布魯氏菌（B.melitensis）、豬種布魯氏菌（B.suis）、沙林鼠種布魯氏菌（B.neotomae）、綿羊附睪種布魯氏菌

8、（B.ovis）和犬種布魯氏菌（B.canis），前3個(gè)種被稱為經(jīng)典的布魯氏菌種，其中牛種布魯氏菌包括八個(gè)生物型，即1、2、3、4、5、6、7、9型，牛種布魯氏菌主要引起牛的流產(chǎn)和不孕（汪舟佳，2008）。布魯氏菌菌株的命名主要依據(jù)其優(yōu)先感染的宿主動(dòng)物。目前5個(gè)布魯氏菌種的基因組序列已經(jīng)完成測序并可用，大約還有25布魯氏菌菌株正在被測序。所有布魯氏菌種的基因組大小和組成都十分相似，基因組的平均長度約為3.39 Mb，并由2個(gè)環(huán)形的染色體組成，染色體約2.11Mb，G+C含量為57.2%；染色體約1.18 Mb，G+C含量為57.3%(Ranganathan 等, 2009)。布魯氏菌沒有經(jīng)典的

9、編碼莢膜、質(zhì)粒、菌毛、或內(nèi)毒素的基因。牛布氏桿菌病實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要包括病原學(xué)診斷、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷等方法，病原學(xué)診斷技術(shù)較可靠、準(zhǔn)確，且可以鑒定布魯氏桿菌的各種生物型，但其所需時(shí)間較長，且要求實(shí)驗(yàn)室條件也比較高，一般在P2級實(shí)驗(yàn)室的條件下進(jìn)行操作，所以在做布病快速診斷及控制方面不便推廣。血清學(xué)診斷技術(shù)主要包括各種凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)、試紙?jiān)囼?yàn)以及高靈敏度的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等。試管凝集反應(yīng)(SAT)是我國布病法定診斷方法，但單獨(dú)使用時(shí)特異性較差，也不能區(qū)分人工免疫和自然感染，且部分感染動(dòng)物的抗體滴度達(dá)不到診斷水平，因而也易造成誤診和漏診，平板凝集試驗(yàn)不能用于

10、確診病畜。ELISA 比所有其他血清學(xué)反應(yīng)具有高得多的敏感性和特異性。競爭性ELISA(CELISA)可鑒別布氏桿菌病的自然感染和人工免疫。該 ELISA試劑盒操作簡便，既能用于大面積普查，又能用于確診試驗(yàn)，可以用于布病的快速診斷。布氏桿菌病的分子生物學(xué)診斷方法主要以PCR為基礎(chǔ)的試驗(yàn)，如多重PCR技術(shù)（杜昕穎 等，2008）和以BSP31基因?yàn)榘谢虻臒晒舛縋CR技術(shù)（曹琛福 等，2009），PCR方法快速敏感，但是目前還沒有一個(gè)明確的實(shí)驗(yàn)室檢測標(biāo)準(zhǔn)。布氏桿菌病的根除和監(jiān)測通常使用免疫學(xué)檢測方法，但作為診斷的依據(jù)，每一個(gè)國家對布氏桿菌病都有不同的診斷標(biāo)準(zhǔn)，在美國2個(gè)首要的檢測牛布病的方法是

11、布魯氏菌乳環(huán)試驗(yàn)和血液檢測( Glynn 等，2008)。目前還沒有一種單一方法能適于任何情況下的布氏桿菌病檢疫，各種診斷技術(shù)也不能相互取代法定的檢測手段仍以細(xì)菌學(xué)和免疫學(xué)檢測為主，PCR技術(shù)雖在國內(nèi)外報(bào)道有限，但其因敏感、快速的特點(diǎn)，將成為將來布氏桿菌病診斷的又一種重要方法。3 牛結(jié)核病（Bovine Tuberculosis）結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium)引起的人、畜、禽共患的一種慢性傳染病，嚴(yán)重威脅著牧業(yè)生產(chǎn)和人類的身心健康。結(jié)核病由人結(jié)核分枝桿菌(MTB)、牛分枝桿菌(MB)、禽型分枝桿菌(M.avium)、非洲分枝桿菌（M.africanum）以及田鼠分枝桿菌（

12、M. microti）所引起，統(tǒng)稱這些病原為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。結(jié)核分枝桿菌按其致病力可分為3種型，即人型、牛型和禽型，三者有交叉感染現(xiàn)象。牛結(jié)核病被OIE定為B類傳染病，我國將其列入二類動(dòng)物疫病。牛結(jié)核主要由牛分枝桿菌引起，牛分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株AF2212/97分離自肺部和支氣管縱隔淋巴結(jié)發(fā)生干酪樣病變的母牛，具有完全的毒力，該菌株基因組全長為4.34Mb，包含3952個(gè)編碼蛋白基因，分布于一單環(huán)染色體中，平均G+C含量為65.63%。結(jié)核分枝桿菌基因組全長為4.41Mb，包括4411個(gè)基因，具有潛在編碼能力的基因約有3977個(gè)，約占90.2%；有3924個(gè)開放閱讀框，其中約40%有功能，44%

13、可能有功能，16%稱為孤兒序列，與其它微生物的序列無相似性。在核苷酸水平上，牛分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌基因組相比，其同源性大于99.95%，表現(xiàn)出共線性，沒有廣泛的置換、復(fù)制或倒置現(xiàn)象。MPB70、MPB83、CFP10和ESAT-6是牛分枝桿菌特異性抗原，許多研究已經(jīng)證實(shí)是非常有前景的鑒別診斷候選抗原。牛結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法大體上可分為3類: 第一類是病原學(xué)檢驗(yàn)方法，如涂片鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)和動(dòng)物接種等；第二類是采用免疫學(xué)方法檢測結(jié)核菌的特異性抗體，如皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、ELISA 和數(shù)點(diǎn)法等；第三類是采用分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法，如PCR-RFLP、PCR-SSCP、PCR-核酸探針、PCR-核酸測序、多

14、重PCR等。病原學(xué)檢查是最可靠的方法之一，但所需周期長，且有10%20%的病例結(jié)核菌培養(yǎng)失敗（LaBombardi，2002；何萍 等，2004），陽性率不高，在實(shí)際診斷中很少采用。目前對于牛結(jié)核病的檢測，OIE唯一推薦的方法是牛型結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)(TST)，但仍然存在著非特異性反應(yīng)，檢出率不能達(dá)到100%。目前，國內(nèi)主要應(yīng)用TST試驗(yàn)來檢測牛結(jié)核病，雖然有用ELISA 進(jìn)行檢測的報(bào)道，但并未推廣應(yīng)用。隨著結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌和多種非典型分支桿菌的序列測定完成，工作重點(diǎn)開始趨向比較基因組研究，目前常用的基因鑒定技術(shù)主要包括PCR法、DNA核酸探針檢測法、多重PCR法、實(shí)時(shí)定量PCR

15、技術(shù)檢測法等，這些方法具有快速、簡便、分辨率高的特點(diǎn), 可進(jìn)行多相分類鑒定, 能按照種系進(jìn)化的關(guān)系確定精確的位置和定種（Linda等，2002；Richard等，2003）。目前最常用的分子生物學(xué)診斷方法是可以區(qū)分多種結(jié)核分枝桿菌群的多重PCR方法，如Richard等（2003）建立的多重PCR方法可以同時(shí)區(qū)分牛分支桿菌、人分支桿菌等多種結(jié)核分支桿菌群和非典型分支桿菌。實(shí)時(shí)定量PCR法是新近發(fā)展起來的檢測技術(shù)，Parra等(2008)利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對牛的生物樣本進(jìn)行快速檢測，可以區(qū)別不同的結(jié)核分支桿菌及非典型結(jié)核分支桿菌等，其敏感性和特異性都很高。目前，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)已用于結(jié)核

16、分支桿菌的檢測，并且其檢測結(jié)果在結(jié)核病的臨床診治中是一項(xiàng)非常重要的參考指標(biāo)，但該診斷技術(shù)所需設(shè)備昂貴，技術(shù)復(fù)雜，對實(shí)驗(yàn)室和操作人員的要求較高等原因，使其在常規(guī)牛結(jié)核病普查中難以運(yùn)用。對奶牛常見傳染病的診斷方法主要包括病原學(xué)方法、免疫學(xué)方法及分子生物學(xué)方法。任何一種診斷方法都無法完成對某一特定傳染病的準(zhǔn)確診斷，要保障奶牛業(yè)穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)、健康發(fā)展，就必須對奶牛疫病實(shí)施綜合防控措施，控制牛常見傳染病的主要措施仍是定期對牛場進(jìn)行消毒，定期對牛群進(jìn)行免疫、檢疫監(jiān)控，結(jié)合臨床特點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果，逐步排除患病牛，以達(dá)到根除病牛的目的，從而實(shí)現(xiàn)牛群的凈化。參考文獻(xiàn)：1曹琛福，劉學(xué)武，花群義 等.實(shí)時(shí)熒光定量P

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19、ideJ. J Clin Microbiol，2002，40: 2238-2239.8Liang Ruping, Qiu Jianding, Cai Peixiang. A novel amper-ometric immunosensor based on three-dimensional solgel network and nanoparticle self-assemble techniqueJ.Analytica Chimica Acta，2005，(534):223-229.9Linda M Parsons, Roland Brosch, Stew art T Cole, et a

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