生化實驗論文

1、小鼠肝臟過氧化氫酶的制備與測定 小組成員：李 朋武 浩2021級一大班法醫(yī)2021年1月3日小鼠肝臟過氧化氫酶的制備與測定過氧化氫酶(Catalase) 是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的氧化復原酶，尤其在動物的肝臟、腎臟、紅細胞中含量較多，其生物學功能是催化細胞內(nèi)H2O2分解，防止過多H2O2 對細胞的危害。人工制備的過氧化氫酶可廣泛應(yīng)用于食品與乳制品業(yè)，造紙與印染業(yè)，農(nóng)業(yè)與環(huán)保業(yè)，以及醫(yī)療衛(wèi)生業(yè)等多領(lǐng)域。小鼠肝臟過氧化氫酶分子量約為238KD，結(jié)構(gòu)上由4個具有相同多肽鏈的亞基組成，是以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶，在407nm波長下有特征性的吸收。溶于水,幾乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有機試劑，酸性環(huán)境下溶

2、解度低易析出，最適溫度為37，最適pH值約為7.8。本實驗以小鼠肝臟為原料，根據(jù)過氧化氫酶溶解性和大分子等特性，通過組織勻漿、鹽析、透析、分子篩層析等步驟，提取純化過氧化氫酶，并對制備的過氧化氫酶進行蛋白濃度、分子量、米氏常數(shù)等測定。?小鼠肝臟過氧化氫酶的制備與測定?實驗方案實驗目的熟悉并掌握生化四大技術(shù)離心、層析、比色、電泳。熟悉并掌握別離純化小鼠過氧化氫酶和測定其含量的技術(shù)和方法。實驗原理勻漿原理：別離純化某一種蛋白質(zhì)時，首先要把蛋白質(zhì)從組織或細胞中釋放出來并保持原來的天然狀態(tài)，不喪失活性，所以要根據(jù)所提取蛋白質(zhì)的性質(zhì)采用適當?shù)姆椒▽⒔M織和細胞破碎。過氧化氫酶在乙醇、氯仿等有機溶劑中溶解度

3、很小，而脂質(zhì)在有機溶劑中溶解度較大,通過參加有機溶劑可實現(xiàn)過氧化氫酶與脂質(zhì)的別離。過氧化氫酶在乙醇、氯仿等有機溶劑中穩(wěn)定性好，不易變性，而某些雜蛋白在有機溶劑中穩(wěn)定性差，容易變性。根據(jù)上述原理選擇0.05mol/L，pH4.0醋酸-乙醇緩沖液以及氯仿作為勻漿緩沖液，通過勻漿法破碎肝組織細胞，勻漿液離心后脂質(zhì)分配到有機相中，局部雜蛋白那么沉淀下來，而過氧化氫酶主要存在于上清液中，別離出上清液即獲得過氧化氫酶的粗提液。鹽析原理：蛋白質(zhì)在高濃度鹽溶液中由于水化膜被破壞而溶解度降低。通過向過氧化氫酶粗提液中參加適當濃度的中性鹽,使過氧化氫酶呈鹽析狀態(tài),而局部雜蛋白呈鹽溶狀態(tài), 離心后過氧化氫酶主要存在

4、于沉淀中，棄去上清收集沉淀，即可實現(xiàn)過氧化氫酶與局部雜蛋白的別離。透析原理：采用20%乙醇、0.1mol/L pH4.7醋酸緩沖液、0.1mol/L NaCl溶液為透析液，對產(chǎn)物進行透析處理。在該透析條件下，過氧化氫酶溶解度變小，以沉淀形式析出，但不變性。透析過夜后離心，過氧化氫酶主要存在于沉淀中，但沉淀中也可能含有少量變性的雜蛋白。選擇0.1mol/L pH7.8磷酸緩沖液復溶沉淀，那么過氧化氫酶溶解，而變性的雜蛋白不能溶解，從而實現(xiàn)過氧化氫酶與局部雜蛋白的別離。層析原理：凝膠層析法主要根據(jù)混合物中分子大小不同的各種物質(zhì)，隨流動相流經(jīng)作為固定相的凝膠層析柱時，各種物質(zhì)分子擴散移動速度不同使混

5、合物中各種物質(zhì)得到別離的技術(shù)。采用sephadexG-200葡聚糖凝膠層析柱可以實現(xiàn)過氧化氫酶與其他分子量雜蛋白的別離，通過監(jiān)測洗脫液在407nm過氧化氫酶特征性吸收波長和280nm波長下的光吸收值變化，合并收集OD407nm和OD280nm重疊峰值管，即可獲得純化后的過氧化氫酶。米氏常數(shù)測定原理：底物濃度與反響速率之間的關(guān)系可用V=表示，圖形為矩形雙曲線如下將此式取倒數(shù)可得，以和作圖可得一直線由圖可知該直線與橫軸的截距為-。找出一系列的點，將點復原為直線，即可求出Km點的取法：設(shè)置不同的底物濃度，參加酶的量相同，反響相同的時間，找出反響后過氧化氫的量，分解的底物可以求得，用它來表示反響速率。

6、剩余的過氧化氫用高錳酸鉀滴定。2KMnO4+5H2O2+3H2SO4=2MnSO4+K2SO4+5O2+8H2O蛋白質(zhì)濃度測定原理：蛋白質(zhì)中的酪氨酸等與酚試劑之磷鉬酸、磷鎢酸作用產(chǎn)生藍色化合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。Lowry法測定蛋白質(zhì)可分為兩個步驟：1、在堿性溶液中，蛋白質(zhì)與銅離子發(fā)生反響Cu2+蛋白質(zhì)Cu-蛋白質(zhì)2、Cu-蛋白質(zhì)使試劑中的磷鎢酸-磷鉬酸復原成為藍色化合物，測定光吸收值就可以推算出蛋白質(zhì)的含量。試劑中的碳酸鈉有緩沖作用，使溶液的pH始終保持在10左右，顯色最深。福林-酚法的靈敏度高、蛋白質(zhì)濃度測定范圍是25250g/ml.但此法實際上是蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸等與試劑

7、的反響，因此他受蛋白質(zhì)氨基酸組成的影響，即不同蛋白質(zhì)中氨基酸組成的不同會使顯色強度有所差異；此外，樣品中酚類及檸檬酸的干擾會使結(jié)果偏高。低濃度的尿素約0.5%左右、胍約0.5%左右、硫酸鈉1%、硝酸鈉1%、三氯醋酸0.5%、乙醇5%、丙酮0.5%對顯色無影響，上述物質(zhì)濃度高時必須做校正曲線。SDS-PAGE測定分子量原理：在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中參加陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉SDS，那么蛋白質(zhì)分子電泳的遷移率主要取決于分子量大小Mr，而與本身所帶的電荷量和形狀無關(guān)。具體公式:lgMW=(A+B)Rf實驗步驟：(一)、組織勻漿法制備過氧化氫酶粗提液 1.頸椎脫臼處死6只小鼠，取肝臟約6g； 2.參

8、加預冷勻漿緩沖液51ml,用組織搗碎機勻漿3min,取200L，勻漿液留樣放入冰箱-20保存； 3.冰浴下緩慢參加3ml氯仿，再次勻漿1min;勻漿液離心4，7500rpm,30min棄沉淀，收獲上清液44ml于錐形瓶中； 4.取勻漿上清液120L,參加40L 4×電泳上樣Buffer,沸水浴5min，備用于SDS-PAGE檢測-20保存，另取200L勻漿后上清液-20保存。二、鹽析與透析法初步純化過氧化氫酶 1.冰浴攪拌狀態(tài)下向肝臟勻漿上清液緩慢滴加7mlNa2SO4,繼續(xù)用玻璃棒手動冰浴攪拌1h; 2.將鹽析溶液離心4，7500rpm,10min棄上清保存沉淀; 3.用24ml磷

9、酸緩沖液溶解沉淀15min，離心4，5000rpm,10min棄沉淀保存上清液; 4.取鹽析后上清液120L，用40L 4×電泳上樣Buffer，沸水浴5min,備用于SDS-PAGE檢測，-20保存； 5.將透析袋至于沸水浴5min，清洗晾涼后備用； 6.將上清液放入透析袋中，置于透析液中兩周，中途更換一次透析液； 7.兩周后取透析袋中渾濁溶液離心4，7500rpm，10min棄上清保存沉淀; 8.用3ml磷酸緩沖液溶解沉淀15min,離心4，4000rpm,10min棄沉淀保存上清液; 9.取上清液120L，用40L 4×電泳上樣Buffer制樣沸水浴5min,備用于S

10、DS-PAGE檢測，于-20保存； 10.將透析袋至于沸水浴5min,清洗晾涼后備用； 11.將收獲的上清液放入處理后的透析袋中置于75的甘油中包埋濃縮2h，待樣品濃縮至1.2ml收樣，置于-20保存。三、凝膠層析法進一步純化過氧化氫酶 1.凝膠的處理預先處理好； 2.裝柱取一支層析柱，于底部填塞薄棉，將層析柱垂直夾于鐵架臺，于柱中參加緩沖液5cm，使用前將凝膠混勻順玻璃棒緩慢注入柱中，待其自然下沉，凝膠床至少2/3柱高; 3.平衡磷酸緩沖鹽溶液流洗，控制流速5-10滴/min; 4.濃縮樣品； 5.加樣用吸管吸取待別離的濃縮液1.2ml,在接近凝膠床外表處沿柱壁緩慢參加； 6.洗脫用磷酸鹽緩

11、沖液保持流速； 7.收集及檢測樣品下降至底部5cm開始用試管收集流出液，每管收集2ml,收集管依次在407nm和280nm波長下測吸光度值，繪制洗脫曲線；如圖1 8.收獲純化產(chǎn)物收集OD407nm和OD280nm重疊峰值管； 9.取2ml純化后存樣于-20保存，備于蛋白質(zhì)濃度和Km值測定； 10.取層析樣品60L，用20L 4×電泳上樣Buffer制樣，沸水浴5min,備用于SDS-PAGE檢測，于-20保存。四、Lowry法測定純化的過氧化氫酶濃度 1.選擇標準蛋白:選擇與待測樣品層析后的純化樣品相同或組成類似的蛋白質(zhì)作為標準蛋白溶液。 2.標準蛋白溶液的配制:將標準蛋白經(jīng)凱氏定氮

12、法準確測定其蛋白質(zhì)含量，再用無離子水配制成0.1mg/ml的儲存液。 3.實驗結(jié)果表1所示配成不同濃度的標準蛋白組，編上號碼，以第一管為空白管，在分光光度計上測定650nm處的光密度值。 4.以各標準溶液濃度為橫坐標，各管的光密度值為縱坐標作圖，繪制標準曲線。如圖2 5.測定樣品蛋白:取試管兩支，一支放1ml稀釋的層析后純化樣品和1ml試劑AB混合液，另一支放1ml生理鹽水和1ml試劑AB混合液，兩者均混勻后在50水浴保溫10分鐘，冷卻，再各參加試劑C 3ml立即混勻，置于50水浴中保溫20分鐘，冷卻后測定650nm波長處的光密度值。五.雙倒作圖法測定純化的過氧化氫酶米氏常數(shù) 1.稀釋勻漿后和

13、層析后樣品各1000倍5L-5ml 2.過氧化氫的濃度再標定:取清潔錐形瓶2支，各加0.04mol/L的過氧化氫溶液2.0ml和25硫酸2.0ml。分別用0.002mol/L高錳酸鉀滴定至微紅，記錄滴定毫升數(shù)去平均值，計算過氧化氫的摩爾濃度。 3.反響測速:取枯燥的50ml錐形瓶5只，編號后操作。終止反響：血液參加后立即計時10分鐘，到時立即參加25硫酸2.0ml,邊加邊搖，終止酶促反響。 4.滴定:用標準0.002mol/L高錳酸鉀滴定，記錄各瓶耗高錳酸鉀的ml數(shù)。 5.計算 1.反響瓶中過氧化氫濃度計算 S=H2O2摩爾濃度*H2O2的ml數(shù)/3.0 2.反響速度計算 V=H2O2的摩爾濃

14、度*參加H2O2毫升數(shù)-0.002*2.5*消耗KMnO4的ml數(shù) =參加的H2O2的毫摩爾數(shù)-剩余的H2O2的毫摩爾數(shù) 3.求Km值 如圖3六.SDS-PAGE法測定純化的過氧化氫酶分子量 1.凝膠的制備：(預先處理好) 2.蛋白質(zhì) 樣品的處理：將蛋白質(zhì)溶解在蛋白質(zhì)樣品溶解液中，在100加熱2-5分鐘。蛋白質(zhì)的最后濃度一般為0.05-1mg/ml. 3.加樣 4.電泳 5.剝膠和固定垂直柱形電泳 6.染色和脫色 7.蛋白質(zhì)的定量如圖4實驗結(jié)果：小鼠肝臟過氧化氫酶別離純化溶液體積ml蛋白濃度mg/ml酶活Km分子量IU/ml 總酶活比活I(lǐng)U/mg回收率%勻漿產(chǎn)物442.7-57,891 層析產(chǎn)

15、物20.205102048.78-0.0795 圖1圖2圖3圖4試驗中的幾個考前須知1) 使用離心機要注意平衡，平穩(wěn)，對稱，牢固，緩慢，以防止損傷離心機。2) 手動玻璃勻漿器助溶時，要注意緩慢旋轉(zhuǎn)推移，時間稍微長一些，使溶解的更充分。3) 使用分光光度計前，要記得調(diào)零。4) 裝柱時，防止出現(xiàn)斷層，干膠。實驗必須保證試管，量筒，吸管等的清潔，以防止試劑之間的污染，影響實驗結(jié)果。5) 勻漿制備中快慢交替，防止溫度過高對過氧化氫酶產(chǎn)生影響6) 洗脫速度不可過快，以防樣品帶擴散結(jié)果誤差分析本次實驗結(jié)果與理論數(shù)值根本符合，但稍有誤差?？赡芤驗椋? 使用的儀器內(nèi)有雜質(zhì)，儀器老化2 滴加的試劑與酶沒有充分接觸3 酶因為操作時溫度稍高局部會失活4 拿出離心管時稍微晃動使沉淀與上清液混合5 層析時收集的液滴大小不均造成吸光度測量誤差6 滴定時計時不準確，滴定終點人為判斷不一致7 滴定前過氧化氫分解或稍被硫酸污染 8 周圍環(huán)境中的雜蛋白影響，可能因為實驗時間過長造成酶活性降低實驗討論1 鹽析時，為什么要在冰浴攪拌的狀態(tài)下，且要緩慢滴加？答：常溫下，酶的活性有損傷。攪拌和緩慢滴加，是防止局部鹽濃度過高，使雜蛋白析出。2 為什么勻漿、透析中用醋酸緩沖液，而鹽析、凝膠層析中用的都是磷酸緩沖液？答：醋酸緩沖液的