帕金森病大鼠模型多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IβCIT放射自顯影研究

1、帕金森病大鼠模型多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白125I-CIT放射自顯影研究【摘要】 目的 探討125I-CIT甲基-3-（4-碘苯基）托烷-2-羧酸鹽多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（DAT）顯像技術(shù)的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 應(yīng)用6-羥基多巴胺（6-OHDA）建立黑質(zhì)部分損毀及完全損毀偏側(cè)帕金森?。≒D）大鼠模型。靜脈注射125I-CIT 40 Ci進(jìn)行放射自顯影。高效液相-電化學(xué)法檢測(cè)紋狀體多巴胺（DA）及其代謝產(chǎn)物含量。免疫組化酪氨酸羥化酶（TH）染色觀察黑質(zhì)及紋狀體TH陽(yáng)性細(xì)胞及纖維。結(jié)果 黑質(zhì)部分損毀及完全損毀偏側(cè)模型損毀側(cè)紋狀體125I-CIT放射活性分別為2.67±0.25和0.98±0.29，較

2、未損毀側(cè)分別降低18%和72%， DA含量分別降低39%和98%。TH染色可見(jiàn)損毀側(cè)黑質(zhì)及紋狀體TH陽(yáng)性細(xì)胞及纖維明顯少于對(duì)側(cè)。結(jié)論 DAT的顯像研究可能有助于PD早期診斷及病情監(jiān)測(cè)。Autoradiographic study of dopamine transporter in rat models of Parkinson disease with 125I-CITLIU Zhenguo CHEN Shengdi， SUN Wenshan，et alDepartment of Neurology， Ruijin Hospital， Clinical and Research Center

3、 for Parkinson Disease， ShanghaiSecond Medical University， Shanghai 200025 China【Abstract】 Objective To study the value of imaging for dopamine transporter（DAT） with 125I-CIT Methods The rat models of hemiparkinsonism with either partial or complete lesions were rendered with 6-hydroxydopamine （6-OH

4、DA） Each rat was injected intravenously with 125I-CIT containing 40Ci Coronal tissue sections were imaged by autoradiography The levels of dopamine （DA） and its metabolites were measured by high performance liquid choromatography and electrochemical detection （HPLC-ECD） The tyrosine hydroxylase（TH）-

5、positive cells and fibres in the substantia nigra and striatum of the rats were observed with immunohistochemical stainingResults The radioactivities in the lesions of the striatum of both partial and complete hemiparkinsonian lesions of the rat models were 267±0.25 and 098±0.29，respective

6、ly ，and were singificantly decreased by 18% and 72%，respectively， as compared with those on the side without lesions The levels of DA in the lesions of the striatum of partial and complete rat models were decreased by 39% and 98%， respectively The loss of TH-positive cells and fibres in the substant

7、ia nigra and striatum was found in the lesions of the striatum of both partial and complete hemiparkinsonian rat models Conclusion The imaging study of DAT may be helpful for the early diagnosis of Parkinsons disease and for the monitoring of the progression of this disease【Key words】 Carrier protei

8、ns； Parkinson disease；125I-CIT； Autoradiography帕金森?。≒arkinson disease，PD）病理基礎(chǔ)是中腦黑質(zhì)多巴胺（DA）能神經(jīng)元及黑質(zhì)紋狀體通路變性死亡。中樞多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（DAT） 位于DA能神經(jīng)元突觸前膜。中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元變性將累及紋狀體部位DA能神經(jīng)終末DAT的密度。DAT密度的改變與DA能神經(jīng)元數(shù)量的變化相一致1。黑質(zhì)DA能神經(jīng)元數(shù)量可以通過(guò)DAT功能顯像進(jìn)行半定量檢測(cè)，為臨床PD輔助診斷提供一種手段。材料和方法1黑質(zhì)部分和完全損毀PD大鼠模型制備2：SD大鼠60只，雄性，體重200250 g。取20只大鼠，借助大鼠腦立體定

9、向儀，將6-羥基多巴胺（6-OHDA）溶液12 g/6 l分2點(diǎn)注射至大鼠右側(cè)黑質(zhì)致密部，坐標(biāo)定位：1點(diǎn)為前囟后5.0 mm，旁正中1.9 mm，硬膜下7.1 mm；另1點(diǎn)為前囟后5.0 mm，旁正中2.3 mm，硬膜下6.8 mm。23周后腹腔注射阿樸嗎啡（APO） 01 mg/kg體重，取APO誘發(fā)旋轉(zhuǎn)次數(shù)小于3轉(zhuǎn)/min者作為黑質(zhì)部分損毀模型。取另外40只大鼠，在上述黑質(zhì)部位注射2點(diǎn)的基礎(chǔ)上，于內(nèi)側(cè)前腦束（MFB）注射8 g/4 l 6-OHDA，坐標(biāo)為：前囟后4.4 mm，旁正中1.7 mm，硬膜下7.7 mm。將APO誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)大于7轉(zhuǎn)/min者作為黑質(zhì)完全損毀模型。2125I-

10、CIT甲基-3-（4-碘苯基）托烷-2-羧酸鹽的標(biāo)記3：采用氯胺-T法標(biāo)記125I-CIT，標(biāo)記率為75%80%，放射化學(xué)純度95%。3模型動(dòng)物腦放射自顯影：取正常大鼠、黑質(zhì)部分損毀及完全損毀模型大鼠各6只，經(jīng)尾靜脈注射取125I-CIT 40 Ci，于注射后4 h斷頸取腦，冰凍切片，與GS-250自顯影儀掃屏顯像曝光8 h，用圖像分析系統(tǒng)對(duì)每只大鼠兩側(cè)相同的紋狀體區(qū)分析46張腦片。對(duì)每張腦片圖像的兩側(cè)紋狀體及額葉皮層相對(duì)稱的部位選取1個(gè)相同形狀及面積大小的感興趣區(qū)（ROI），對(duì)每個(gè)ROI進(jìn)行光灰度測(cè)定，并計(jì)算各組同側(cè)紋狀體/皮層（ST/CX）灰度的比值，取其平均值，這一比值代表紋狀體的相對(duì)放

11、射計(jì)數(shù)，亦代表其DAT密度，可反映其紋狀體DA能神經(jīng)末梢以及黑質(zhì)DA能神經(jīng)元數(shù)目的變化。4高效液相-電化學(xué)法檢測(cè)（HPLC-ECD）模型動(dòng)物DA及其代謝產(chǎn)物含量：每組各取4只大鼠，麻醉后斷頭，在干冰上分離出雙側(cè)紋狀體并稱重，HPLC-ECD檢測(cè)。5模型動(dòng)物黑質(zhì)及紋狀體免疫組化染色：每組各取1只，經(jīng)4%多聚甲醛灌注后，于紋狀體和黑質(zhì)部位冰凍切片，片厚50 m，進(jìn)行免疫組化ABC法酪氨酸羥化酶（TH）染色。6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：組內(nèi)左右側(cè)及組間比較采用Student t檢驗(yàn)。結(jié)果1動(dòng)物腦組織放射自顯影觀察：正常大鼠紋狀體區(qū)冠狀位圖像清楚可見(jiàn)紋狀體部位有放射性濃集，左、右側(cè)灰度相當(dāng)。皮層、伏隔核以及黑質(zhì)部位

12、亦有輕度放射性濃集。黑質(zhì)部分損毀及完全損毀模型損毀側(cè)紋狀體放射性濃集降低，黑質(zhì)完全損毀模型降低更明顯（圖1）。黑質(zhì)部分損毀模型右側(cè)ST/CX比值較左側(cè)降低了18%；黑質(zhì)完全損毀模型降低了72%。從表1中可以看出模型動(dòng)物左右側(cè)紋狀體之間ST/CX比值存在顯著性差別，隨著損毀程度加重，DAT密度降低明顯，表明DAT密度降低程度與損毀程度成正比，-CIT DAT功能顯像可以反映早期黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的病理變化及變化程度。表1 125I-CIT在PD大鼠模型腦內(nèi)ST/C比值及各組間比較（±s）組別鼠數(shù)（只）未損毀側(cè)（左側(cè)）損毀側(cè)（右側(cè)）對(duì)照組63.60±0.15*3.63±0

13、.40黑質(zhì)部分損毀組63.25±0.39*2.67±0.25黑質(zhì)完全損毀組63.45±0.49*0.98±0.29注：同組左、右側(cè)比較 * P0.05* P0.005； 與正常組同側(cè)相比 P0.0012DA及其代謝產(chǎn)物含量：從表2可見(jiàn)，黑質(zhì)部分損毀模型損毀側(cè)（右側(cè)）多巴胺（DA）、二羧苯乙酸（DOPAC）和3-甲氧-4-羧基苯乙酸（HVA）較左側(cè)分別減少39%、41%和70%；黑質(zhì)完全損毀模型右側(cè)比左側(cè)分別減少98%、96%和97%。表明部分損毀模型的DA生化能代表PD早期的生化改變。表2 HPLC-ECD檢測(cè)大鼠離體紋狀體DA、DOPAC、HVA的含量

14、（±s g/g濕組織）組別鼠數(shù)（只）DA DOPAC HVA 對(duì)照組4 左側(cè) 2.971±01940.866±01250.986±0080 右側(cè) 3.039±01840.956±01461.056±0267黑質(zhì)部分損毀組4 未損毀側(cè)（左側(cè)） 2.897±02131.034±02181.089±0327 損毀側(cè)（右側(cè)） 1.759±0408*0.612±0580.328±025*黑質(zhì)完全損毀組4 未損毀側(cè)（左側(cè)） 2.831±02040.965±0

15、0870.853±0078 損毀側(cè)（右側(cè)） 0.043±0018*0.037±0014*0.028±0011*注：同組左右側(cè)相比 * P0.05， * P0.001；與正常組同側(cè)相比 P0.05， P0.001結(jié)合125I-CIT在PD大鼠放射自顯影圖像的灰度測(cè)定值，可以發(fā)現(xiàn)在部分損毀模型生化改變?cè)缙冢珼A含量降低39%時(shí)DAT自顯影圖像即可顯示出左右側(cè)差別。3TH免疫組化：在黑質(zhì)部分損毀及完全損毀的PD模型上，6-OHDA未損毀側(cè)（左側(cè)）黑質(zhì)致密帶內(nèi)可見(jiàn)密集的TH陽(yáng)性細(xì)胞呈棕褐色，網(wǎng)狀帶內(nèi)以及腹側(cè)背蓋（VTA）亦可見(jiàn)一些TH陽(yáng)性細(xì)胞，左側(cè)紋狀體部位可見(jiàn)

16、細(xì)而密集的TH陽(yáng)性纖維。黑質(zhì)部分損毀PD模型的損毀側(cè)黑質(zhì)致密帶以及網(wǎng)狀帶尚存在一些TH陽(yáng)性細(xì)胞，以網(wǎng)狀帶為多，紋狀體亦見(jiàn)到相對(duì)密集的TH陽(yáng)性纖維。在黑質(zhì)完全損毀PD模型的損毀側(cè)（右側(cè)）黑質(zhì)致密帶以及網(wǎng)狀帶未見(jiàn)TH陽(yáng)性細(xì)胞，VTA部位有少量TH陽(yáng)性細(xì)胞，紋狀體部位僅有少許細(xì)而稀疏的TH陽(yáng)性纖維（圖2）。討論DAT是位于紋狀體DA能神經(jīng)元突觸前膜的一種膜蛋白，DAT密度的改變與DA神經(jīng)元數(shù)量的變化相一致。1993年有人用123I-CIT單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)體層攝影術(shù)（SPECT）檢測(cè)正常人和PD患者DAT功能顯像，證實(shí)PD患者DAT下降4。文獻(xiàn)報(bào)道PD初期的殼核18F-Ddopa攝取率降低30%，表明

17、18F-Ddopa正電子發(fā)射體層攝影術(shù)（PET）可以在PD亞臨床期檢測(cè)黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的功能5。同時(shí)，也有資料表明早期PD患者基底節(jié)DAT功能較正常人降低31%65%，因此，DAT PET或SPECT檢測(cè)有助于PD早期診斷，甚至，可用于亞臨床期PD的篩查。Marek等6應(yīng)用123I-CIT SPECT檢查8例早期偏側(cè)PD患者和8名年齡、性別與PD患者相當(dāng)?shù)慕】嫡Ｈ?，發(fā)現(xiàn)偏側(cè)PD患者基底節(jié)DAT水平在有癥狀肢體對(duì)側(cè)和同側(cè)分別降低約53%和38%，且殼核DAT水平降低比尾核明顯，表明123I-CIT SPECT有助于PD早期甚至亞臨床期的診斷。利用DAT功能狀態(tài)觀察PD嚴(yán)重程度則是根據(jù)PD患者的

18、臨床功能評(píng)分來(lái)進(jìn)行比較，但臨床上無(wú)法結(jié)合紋狀體部位生化和病理與DAT功能相匹配研究PD的早期病情及病情發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)建立的黑質(zhì)部分和完全損毀偏側(cè)PD模型，損毀側(cè)紋狀體DA含量分別降低39%和98%。免疫組化染色可見(jiàn)紋狀體和黑質(zhì)TH陽(yáng)性纖維和神經(jīng)元相應(yīng)地稀疏及缺失，可模擬PD早期及晚期病理、生化改變。應(yīng)用125I-CIT放射自顯影研究了黑質(zhì)部分及完全損毀的PD大鼠模型，并結(jié)合離體生化和TH免疫組化進(jìn)行DA及其代謝產(chǎn)物檢測(cè)和DA能神經(jīng)元及其纖維形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)當(dāng)黑質(zhì)部分損毀側(cè)紋狀體的DA含量較未損毀側(cè)降低40%時(shí)，125I-CIT在紋狀體部位的放射性濃集程度均見(jiàn)降低，與紋狀體DA含量降低及TH免疫組

19、化觀察到TH陽(yáng)性纖維稀疏程度相一致。表明125I-CIT顯像不僅有助于PD早期診斷，而且可以用于病情監(jiān)測(cè)，為123I-CIT SPECT 顯像的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。PD大鼠腦紋狀體125I-CIT放射自顯影， a：正常大鼠，兩側(cè)紋狀體可見(jiàn)放射性濃集， b：部分損毀偏側(cè)大鼠，損毀側(cè)紋狀體放射性濃集程度明顯減弱， c：完全損毀偏側(cè)大鼠，損毀側(cè)紋狀體放射性濃集程度更加降低 圖2 PD大鼠損毀側(cè)紋狀體顯示部分和完全損毀大鼠紋狀體稀疏的TH陽(yáng)性纖維， a：正常對(duì)照， b：部分損毀， c：完全損毀TH 免疫組化染色×80基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究規(guī)劃“腦功能和腦重大疾病基礎(chǔ)研究”資助項(xiàng)目（G

20、1999054000）；上海市衛(wèi)生系統(tǒng)百名跨世紀(jì)優(yōu)秀學(xué)科帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃資助項(xiàng)目（97BR001）；上海市科委青年科技“啟明星”計(jì)劃資助項(xiàng)目（97QMB1410、99QB14023）；上海市教委基金資助項(xiàng)目（99B08）參考文獻(xiàn)1Kaufman MJ，Madras BKSevere depletion of cocaine recognition sites associated with the dopamine transporter in Parkinsons-diseased striatumSynapse，1991，49：43-492Carman LS，Gage FH，Shults CWPartial lesion of the