細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察課件

1、第一頁(yè)，共十四頁(yè)。細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞凋亡(dio wn)（apoptosis）的命名主要是根據(jù)某些單個(gè)細(xì)胞死亡時(shí)細(xì)胞碎裂如花瓣或樹(shù)葉散落般的形態(tài)學(xué)特征。目前對(duì)細(xì)胞凋亡的認(rèn)識(shí)正不斷得到深化，檢測(cè)凋亡細(xì)胞的方法也逐漸增多，但形態(tài)改變?nèi)允谴_定細(xì)胞凋亡的最可靠的方法。第二頁(yè)，共十四頁(yè)。細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察一、光學(xué)一、光學(xué)(gungxu)顯微鏡觀察顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞的主要特征為核染色質(zhì)致密深染，形成致密質(zhì)塊，有時(shí)可碎裂。在HE染色的組織切片中細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)致密、嗜酸性染色增強(qiáng)，并可形成凋亡小體。在組織中凋亡細(xì)胞常以分散單個(gè)形式存在，凋亡細(xì)胞與周圍細(xì)胞分離，不引起炎癥反應(yīng)(fnyng)。本方法簡(jiǎn)便易

2、行，但在細(xì)胞密集的組織中對(duì)于改變不典型的細(xì)胞判斷較困難，常缺乏較為特征的指標(biāo)，具有較強(qiáng)的主觀性，重復(fù)性差。本方法可用于調(diào)亡現(xiàn)象的初步觀察，作為分析指標(biāo)之一。第三頁(yè)，共十四頁(yè)。細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察檢測(cè)方法： 細(xì)胞涂片或組織石蠟切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物鏡下觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)改變，結(jié)合顯微(xin wi)測(cè)量工具可作凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)。第四頁(yè)，共十四頁(yè)。細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察二、視頻二、視頻(shpn)時(shí)差顯微技術(shù)（時(shí)差顯微技術(shù)（video time-lapse microscopy）本方法用于細(xì)胞培養(yǎng)，通過(guò)相差顯微鏡可動(dòng)態(tài)(dngti)觀察細(xì)胞凋亡的變化過(guò)程，尤其是觀察細(xì)胞表和外形的變化。凋

3、胞與基質(zhì)分離，胞體變圓、收縮、出泡，有的細(xì)胞拉長(zhǎng)，出現(xiàn)釘狀突起，特續(xù)數(shù)小時(shí)后細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞溶解，通過(guò)連續(xù)觀察，本方法可養(yǎng)壑培養(yǎng)中的凋亡細(xì)胞，但不能用于病理組織。第五頁(yè)，共十四頁(yè)。細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察檢測(cè)方法： 收集2105細(xì)胞/ml培胞，置于多孔培養(yǎng)板，加入凋亡誘導(dǎo)劑，在帶有自動(dòng)攝像裝置的相差顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞的動(dòng)態(tài)改變，每隔分鐘30秒作序列攝影，連續(xù)24小時(shí)。如同(rtng)進(jìn)進(jìn)行熒光染色，可參熒光晃微鏡下觀察和攝影。第六頁(yè)，共十四頁(yè)。細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察三、電子顯微鏡觀察三、電子顯微鏡觀察(gunch)關(guān)于凋亡細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征，包括透射電鏡和掃描電鏡下的改變，在許我文獻(xiàn)中已有詳盡描述。凋

4、亡細(xì)胞的典型形態(tài)改變?nèi)绨|(zhì)的固縮，染色質(zhì)濃縮成半月形或帽狀附于核膜，核的碎裂和凋亡小體形成等，在透射電鏡下得到最佳的體現(xiàn)。為凋亡細(xì)胞判定提供了最可靠的依據(jù)(yj)。本方法的缺點(diǎn)是樣品制作過(guò)程較復(fù)雜，且儀器、設(shè)備的費(fèi)用昂貴，較難廣泛大量開(kāi)展。由于樣品范圍局限，在凋亡細(xì)胞數(shù)較少時(shí)需進(jìn)行大量的觀察才能觀察到典型的凋亡改變。第七頁(yè)，共十四頁(yè)。細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察還應(yīng)指出的是，在觀察體外培養(yǎng)的凋亡細(xì)胞時(shí)，?？梢?jiàn)到各階段的改變，并可見(jiàn)到較多典型的凋亡細(xì)胞時(shí)，?？梢?jiàn)到各階段的改變，并可見(jiàn)到較多典型的凋亡小體很少見(jiàn)到，出現(xiàn)較多的是凋亡初期胞體收縮、染色質(zhì)邊聚和后期(huq)凋亡小體（或整個(gè)凋亡細(xì)胞）被吞噬和降解

5、的現(xiàn)象。一些不典型的改變?nèi)菀妆缓雎?，在觀察時(shí)要特別予以注意。第八頁(yè)，共十四頁(yè)。細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察檢測(cè)方法： 透射電鏡標(biāo)本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，丙酮脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸電子又重染色(rns)，透射電鏡觀察。掃描電鏡標(biāo)本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，乙醇逐級(jí)脫水，CO2臨界點(diǎn)干燥，真空噴金，掃描電鏡觀察。第九頁(yè)，共十四頁(yè)。細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察四、流式細(xì)胞技術(shù)四、流式細(xì)胞技術(shù)(jsh)流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞是通過(guò)檢查其光射特征及熒光參數(shù)時(shí)行的。細(xì)胞穿過(guò)流式細(xì)胞儀的激光束集點(diǎn)時(shí)使激光發(fā)生散射，分析(fnx)散射光可以提供細(xì)胞大小及結(jié)構(gòu)的信息。散射光包括前向散射光和左向角散射光兩種，前向散

6、射光的強(qiáng)度與細(xì)胞大小、體積相產(chǎn)，右向角射光的強(qiáng)度與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的析射性、顆粒性（granu-larity）有關(guān)。第十頁(yè)，共十四頁(yè)。細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞凋亡過(guò)程中出現(xiàn)(chxin)的形態(tài)改變?nèi)缂?xì)胞皺縮、胞膜起泡、核濃縮和碎裂等可以使光散射特性發(fā)生改變。早期凋亡細(xì)胞主要表現(xiàn)為前向散射光減弱而右向角散射光增強(qiáng)或不變，前者反映了細(xì)胞的皺縮，后者反映了細(xì)胞的核逐縮及碎裂。晚期凋亡細(xì)胞的前向散射光和右向角散射光均減弱。由于光散射牧場(chǎng)生并非凋亡細(xì)胞的特異性指標(biāo)，細(xì)胞的機(jī)械性損傷和細(xì)胞壞死也可以使前向散射光減弱。因此，只有將光散射特性的檢測(cè)與熒光參數(shù)的檢測(cè)結(jié)合起來(lái)才能準(zhǔn)確地辨認(rèn)凋亡細(xì)胞。第十一頁(yè)，共十四頁(yè)。細(xì)胞

7、凋亡形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞凋亡過(guò)程中核酸內(nèi)切酶在DNA分子核小體間的降解，導(dǎo)致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，細(xì)胞熒光(ynggung)染色后作流式細(xì)胞儀分析，可以發(fā)現(xiàn)在DNA直方圖上正常二倍體細(xì)胞的Go/G1峰前出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體峰（xub-G1峰，即AP峰-apoptotic peak）,代表凋亡細(xì)胞。根據(jù)此亞二倍體峰可以計(jì)算凋亡細(xì)胞的百分率。此外，流式細(xì)胞術(shù)還可以通過(guò)測(cè)定線粒體膜的電位、溶酶體質(zhì)子泵的活性及細(xì)胞DNA/總蛋白質(zhì)比例等方法辨認(rèn)凋亡細(xì)胞。第十二頁(yè)，共十四頁(yè)。細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察檢測(cè)(jin c)方法： 獲取密度1106細(xì)胞/ml左右的細(xì)胞懸液，精洗，固定，熒光染料染色，上流式細(xì)胞儀分析。第十三頁(yè)，共十四頁(yè)。細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察內(nèi)容(nirng)總結(jié)細(xì)胞凋亡(dio wn)的形態(tài)學(xué)觀察。檢測(cè)方法：。